Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

In natura, Cas9 è una proteina immunitaria contro i virus invasori che l'evoluzione preferisce Cas9 con specificità promiscua che può scindere il DNA virale con mutazioni spontanee. Abbiamo costruito un sistema di evoluzione diretta artificiale che predilige una variante Cas9 ottimizzata ad alta specificità. Sia le selezioni negative che positive funzionano contemporaneamente nel sistema di screening dei cecchini.

Le varianti Cas9 con attività off-target ridotta che mantengono anche l'attività di destinazione possono essere schermate contemporaneamente. Mutazioni sono state introdotte su tutta la sequenza Cas9 casualmente per produrre la libreria da schermare. E questo ha permesso di trovare mutazioni in posizioni inaspettate.

Attualmente, molti ricercatori del mondo accademico e industriale stanno utilizzando Cas9 di tipo Y per gli sviluppi terapeutici. Tuttavia, la specificità di Cas9 di tipo Y non è ottimizzata, il che può comportare un impacchettato. Nell'uomo, questo significa mutazioni inaspettate in geni casuali, che possono portare a gravi effetti collaterali.

Ci sono molti enzimi Simili a Cas9 che vengono sviluppati in terapia. La nostra tecnica può essere utilizzata per migliorare la specificità di altri DNA e nucleidi come Jipinger, Thailandia e Cas9 anche come CPF1. Rendere una libreria abbastanza grande è la chiave per aumentare le possibilità di ottenere una variante con funzione importante.

Assicurati di ottenere un'alta efficienza nella fase di raffreddamento e di utilizzare celle competenti altamente efficienti. Per iniziare questa procedura, aggiungere un nanogramma sia del plasmide CCDB che del plasmide SGRNA con doppi disallineamenti in cinquanta microlitri di cellule GOI BW25141 scongelate. Mescolare delicatamente le cellule pipettandole e trasferirle in una cuvetta di elettroporazione pre-refrigerata di 0,1 centimetri.

Trasforma l'E-coli con i due plasmidi tramite elettroporazione. Subito dopo il completamento dell'elettroporazione, aggiungere 250 microlitri di mezzo SOC. Pipettare delicatamente la soluzione per mescolare le cellule e il mezzo e trasferire la miscela in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.

Recuperare le cellule trasformate e incubarle a 32 gradi Celsius, con delicati scuotimenti per un'ora. Continuare a preparare le celle di screening Snyper come indicato nel protocollo di testo. Quando sei pronto per eseguire lo screening Snyper, trasforma le cellule di screening Snyper con 100 nanogrammi dei plasmidi variante Cas9 preparati da ogni libreria utilizzando il processo di elctroporazione precedentemente descritto.

Quindi, trasferire 250 microlitri delle cellule in un tubo di microcentrifugo fresco da 1,5 millilitri. Aggiungere 250 picogrammi di ATC a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per millilitro. Recuperare sia le cellule contenenti ATC che le cellule senza ATC incubandole a 32 gradi Celsius per un'ora con delicati scuotimenti.

Piastra 25 microlitri delle cellule recuperate senza ATC su una piastra di agar LB, contenente cloramfenicolo e kanamicina. Aggiungere ATC all'ATC recuperato contenente cellule ad una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro su una piastra di agar LB da 245 millimetri. Placcare immediatamente le cellule contenenti ATC su un agar LB contenente lastra contenente cloramfenicolo, kanamicina e arabinosi.

Incubare tutte le piastre durante la notte a 32 gradi Celsius. Il giorno dopo, fotografa i piatti. Utilizzando il software CFU aperto, contare il numero di colonie vitali, assicurandosi che il numero di colonie sulla piastra non selettiva sia almeno dieci volte superiore alla diversità della libreria, per coprire tutte le varianti.

Tira le colonie sopravvissute sulle placche selettive di tutte e tre le biblioteche. Trasferire queste colonie raggruppate a 250 millilitri di mezzo LB, integrato con cloramfenicolo e incubare durante la notte a 42 gradi Celsius. Innanzitutto, caricare il software di ricerca Cas OF per selezionare i siti di destinazione.

Selezionare il tipo PAM appropriato per il tipo specifico di Cas9 e il genoma bersaglio. Compilare la scheda sequenze di query. Scegliere il numero di mancata corrispondenza e fare clic sul pulsante invia.

Dopo alcuni secondi, verranno visualizzati i siti di destinazione e fuori destinazione. In generale, scegliere i siti fuori destinazione con uno o tre disallineamenti. Quindi, ordina il CRRNA e gli oligo Track RRNA con sequenze di modelli e amplifica il modello come delineato nel protocollo di testo.

Analizzare due microlitri del DNA del modello amplificato, su un gel di agarosio al 2%, quindi purificare il modello. Incubare la miscela di reazione durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere 0,5 microlitri di DNAsi e incubare a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, quindi purificare l'SGRNA.

Quindi, trattare 10 microgrammi dell'RNA trascritto in vitro con 250 unità di fosfatasi alcalina intestinale del vitello per tre ore a 3 gradi Celsius, in presenza di 100 unità di inibitore della RNAse, quindi purificare lo SGRNA trattato. In primo luogo, mantenere le cellule HEK293 T in DMEM integrate con 10%FBS e 1% antibiotici a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Successivamente, mescolare due microgrammi di tipo selvatico o proteina Snyper Cas9 con due microgrammi di SGRNA e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti per realizzare complessi RNP.

Tripinare e contare le cellule, quindi lavarle e prepararle nel buffer di elettroporazione come delineato nel protocollo di testo. Elettroporate i complessi RNP nelle celle usando un impulso di 1300 volt per 30 millisecondi. Subito dopo l'elettroporazione, placcare le cellule su una piastra da 48 po', riempita con 500 microlitri di DMEM, integrata con 10%FBS e 1%antibiotici.

Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Mantenere le cellule HEK293 T in DMEM integrate con 10%FBS e 1%antibiotici a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno prima della trasfezione, tripinare e contare le cellule.

Se si lavora su una scala di 48 pozzi, piastra 10.000 celle per pozzo e 250 microlitri di mezzo di crescita completo. Utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica, preparare 250 nanogrammi di plasmide P3S Cas9 e 250 nanogrammi di SGRNA per la trasfezione. Quindi, mescolare i plasmidi in 25 microlitri di MEM senza siero.

Diluire un microlitri di reagente di trasfezione con 25 microlitri di MEM senza siero. Incubare questa miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Unire la miscela plasmide con la miscela di reagente di trasfezione e incubare a stanza per 20 minuti per formare complessi lipofectamina plasmide.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di questa miscela direttamente a ogni cellule ben contenenti. Scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro per mescolare. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per 48-72 ore dopo la trasfezione, prima di saggiare per l'espressione trans-genica.

Dopo aver isolato il DNA genomico precedentemente preparato, genera librerie di sequenziamento profondo mediante amplificazione PCR del GDNA con primer mirati su target e off-target. Quindi, utilizzare i primer indice per etichettare ogni campione. Utilizzare un computer di sequenziamento di nuova generazione per sottosogliare le librerie del pool al sequenziamento finale associato.

Dopo che lo schermo di Snyper è stato eseguito, la percentuale di colonie di sopravvivenza può essere calcolata dividendo il numero di colonie sulla piastra LB selettiva per il numero di colonie sulla piastra LB non selettiva. Mentre questa percentuale è di solito molto bassa se eseguita con librerie di SP Cas9, i veri successi positivi possono essere arricchiti ripetendo lo schermo con il pool sopravvissuto. Una schermata rappresentativa di Snyper mostra un tasso di sopravvivenza del 100% ottenuto dopo la terza schermata.

Le trasfette che utilizzano RRNPs o Snyper Cas9 codificato plasmide possono essere fatte per vari bersagli e le attività risultanti su bersaglio e fuori bersaglio misurate dal sequenziamento dell'amplicon target. Nella maggior parte degli obiettivi, Snyper Cas9 mostra lo stesso livello di attività target e rapporti di specificità più elevati rispetto al tipo selvaggio. Gli SGRNA troncati possono anche essere utilizzati per migliorare ulteriormente la specificità.

Una maggiore efficienza di trasformazione nella prima fase di pulizia è molto importante per non perdere i cloni con alta specificità. Le fasi di screening successive comportano una minore efficienza di trasformazione poiché i cloni sono già arricchiti nella prima fase di screening e ci sono meno possibilità di perderli. Ci sarà più di un clone che abbiamo trovato nello schermo di Snyper.

Le attività su bersaglio e fuori bersaglio di questi cloni dovrebbero essere caratterizzate nel maggior numero possibile di obiettivi diversi per selezionare i cloni con le migliori prestazioni. Con questo metodo, gli scienziati possono migliorare la specificità degli enzimi simili a Cas9 senza perdita di attività sul bersaglio. Inoltre, gli scienziati non hanno bisogno di alcuna conoscenza preliminare sulla struttura della proteina per apportare miglioramenti.