Name: Un modello affidabile e riproducibile critiche medie femorale difetto segmentale in ratti stabilizzato con un Fixator esterno personalizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Impara un protocollo chirurgico per creare difetti femorali segmentari nei ratti con fissatore esterno personalizzato. Questo modello riproducibile consente di studiare i meccanismi di guarigione ossea e le terapie rigenerative in modo accessibile.

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Questo lavoro è stato supportato da un Grant attrezzature NIH 1S10OD023676-01 supporto aggiuntivo fornito attraverso reparti di Ortopedia e riabilitazione dell'Università del Wisconsin e la facoltà di medicina e sanità pubblica. Vogliamo riconoscere la UW Carbone Cancer Center Support Grant P30 CA014520 e uso del loro piccolo Animal Imaging Facility, nonché NIH Training Grant 5T35OD011078-08 per il supporto di H. Martin. Ringraziamo anche Michael e Mary Sue Shannon per il loro supporto del partenariato rigenerazione muscolo-scheletrico.

I ratti utilizzati in questo studio ha ricevuto la cura quotidiana conformemente agli orientamenti AVMA per l'eutanasia degli animali: 2013 edizione16. Il Comitato di impiego presso l'Università di Wisconsin-Madison e istituzionali Animal Care valutato e approvato questo protocollo sperimentale prima di inizio del progetto.
1. gli animali
<ol><li>Utilizzare i ratti maschii di Sprague-Dawley nazionali pesa circa 350 g.</li>
</ol>2. preparazione di Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) imbevuto di spugna ponteggi
Nota: Preparazione di Scaffold dovrebbe verificarsi solo prima dell'impianto nel femore (vedi passo 6.14).
<ol><li>Seguire le istruzioni del produttore per l'uso di un kit di innesto stabilito rhBMP-2 osso contenente una spugna di collagene liofilizzato rhBMP-2 e acqua sterile per la ricostituzione17. Mantenere la sterilità, ricostituire la rhBMP-2 con l'acqua sterile ad una concentrazione di 1,5 mg/mL.</li>
	<li>Utilizzando un righello sterile e forbici sterili, tagliare la spugna di collagene bagnato rhBMP-2 per rimodellare per adattare una 5 mm x 3 mm x 3 difetto di mm.</li>
	<li>Usando una siringa, distribuire la soluzione di rhBMP-2 uniformemente sopra la spugna di collagene che viene assorbito.</li>
</ol>3. preparazione del dispositivo di fissazione esterno personalizzato
Nota: Per l'elenco più completo delle dimensioni, vedere Figura 1A .
<ol><li>Taglio di alluminio azione dello strato (tipo 6061, 0,088" spessore) a due pezzi (1,4 x 6 poll.) utilizzando un seghetto o altro strumento appropriato.</li>
	<li>Montare un pezzo in macchina fresatrice e, utilizzando un mulino di trivello del carburo di 90°-punto di 1/8", tagliare quattro scanalature di «V» (0.035" profondo) nel senso della lunghezza. Lasciare l'altro pezzo libero dei tagli.</li>
	<li>Tagliare i singoli piatti di 0.3" larghezza dalle due pezzi (Figura 1B). Misurare e fori vite per thread 4-40. Toccare la piastra con scanalature a "V" con il filo 4-40. Forare la piastra senza scanalature per un trapano di corpo #4 vite.</li>
	<li>Sabbia di entrambi i pezzi per arrotondare angoli e ridurre il peso (Figura 1).</li>
	<li>Avvitare i pezzi insieme 4-40, 18-8 acciaio inox pulsante viti a testa cilindrica (0,25") affinché scanalature sono a filo contro la piastra normale (Figura 1)</li>
</ol>4. procedura anestesia e analgesia
<ol><li>Inducono anestesia inserendo il ratto nella camera di induzione consegna L 4 O2/min con 4% isoflurane. Attenzione: Ricerca personale deve evitare l'inalazione di gas anestetico e mantenere la cappa adeguata e ventilazione in laboratorio.</li>
	<li>Rimuovere il ratto dalla camera dopo il ratto perde il riflesso di raddrizzamento, allegare un cono di naso e posizionare la dose di mantenimento dell'anestesia attraverso il naso (tasso di consegna di2 O di 2-3 L/min e 0,8% isoflurano).</li>
	<li>Posto il ratto il dissipatore di calore o sotto la luce riscaldante per prevenire l'ipotermia.</li>
	<li>Confermare la profondità adeguata dell'anestesia di pizzicare la punta o il test il riflesso palpebrale.</li>
	<li>Applicare lubrificazione agli occhi per evitare l'essiccazione fuori la cornea.</li>
	<li>Consegnare un'iniezione sottocutanea di rilascio prolungato buprenorfina (1 mg/kg) sul tronco/dorsum del ratto, lontano dal sito chirurgico, per fornire l'analgesia per fino a 3 giorni dopo la chirurgia.</li>
</ol>5. asettica preparazione e antibiotici preventivi
<ol><li>Radere la zona intorno a hindleg usando la costola dith 13, il piede, la linea mediana dorsale e la linea mediana ventrale come margini.</li>
	<li>Area di macchia Depilata utilizzando 2x2 garza sterile imbevuta con 10% povidone-iodio seguito da 70% EtOH (4 volte ciascuno, alternati).</li>
	<li>Somministrare un'iniezione intramuscolare di cefazolina (20 mg/kg) il quadricipite operativa.</li>
	<li>Amministrare enrofloxacina (0,25 mg/ml) in acqua potabile per 7 giorni postoperatorio per una costante protezione antibiotica.</li>
	<li>Posto ratti su mangimi medicati (ad es., Uniprim) per tutta la durata dello studio per prevenire le infezioni del tratto di pin.</li>
	<li>Applicare pomata antibiotica doppia all'interfaccia pelle-pin una volta al giorno per 3 giorni postoperatorio. Nota: Evitare qualsiasi pin di fissazione esterna o il morsetto allentato che possono contribuire allo sviluppo di un'infezione.</li>
</ol>6. intervento chirurgico
Nota: Assicurarsi un concertato sforzo per mantenere un campo sterile e area di lavoro e seguire una tecnica sterile in tutta l'interezza del caso.
<ol><li>Estendere la gamba rasato attraverso fenestrata, chiaro appiccicoso drappeggio e copertura chirurgica panca in teli sterili per creare un campo sterile.</li>
	<li>Palpare il femore e utilizzare una lama #15 per creare un'incisione di anterolateral attraverso la pelle che si estende da patella per il grande trocantere al femore prossimale.</li>
	<li>Accuratamente incise la fascia gamba laterale lungo il setto intramuscolare per separare il muscolo vasto laterale del quadricipite anteriormente da muscoli posteriori della coscia posteriormente fino a quando il femore laterale è esposto. Preservare l'inserimento di gluteal del tendine abduttore sul grande trocantere.</li>
	<li>Eseguire un'attenta, dissezione dei tessuti molli della circonferenza atraumatic ed esporre il femore alla sua metà diafisi a partire sulla superficie laterale. Per effettuare questa operazione, è necessario utilizzare una lama #15 delicatamente tagliare il muscolo dall'osso sottostante mantenendo la lama parallela contro il contorno della superficie dell'osso. Utilizzare un scollaperiostio per sollevare il muscolo dall'osso esposto come che viene sezionato e procedere intorno al pozzo femorale fino a 7-10 mm della diafisi centrale è stata cancellata di tessuti molli su tutti i lati per prepararsi ostectomia. Nota: Per evitare lesioni al pacco neurovascular femorale mediale.</li>
	<li>Inserire i quattro fili di Kirschner (k) 1.0 mm: 2 prossimale e distale nel femore perpendicolare al femore laterale, 2 diretto dritto laterale a mediale. Assicurarsi che tutti i perni innesti entrambi cortecce (bicorticale) per un'adeguata stabilità (Figura 2A).</li>
	<li>Prima di avviare con il perno più distale, solo a livello dell'epicondilo laterale. Posto jig svuotare il femore distale laterale e inserire un 1,0 punta filettata k-wire.</li>
	<li>Mantenimento della posizione del jig sull'osso, identificare dove il perno più prossimale entrerà l'osso basato sui fori jig. Una volta che la posizione è determinata, accuratamente incise parallelo alle fibre del tendine del gluteo come necessario per creare un piccolo spazio nel tessuto per il pin prossimale di passare attraverso, riducendo così al minimo il danno iatrogenico al tendine. Praticare un 1,0 mm non filettati k-wire in questo divario, assicurando nuovamente che il pin si impegna entrambi cortecce (Figura 2B).</li>
	<li>Mantenere la posizione di jig a contatto con l'osso e forare due 1.0 mm filettato k-legare, uno su entrambi i lati del difetto futuro sito. Garantire perni impegnano entrambi cortecce (Figura 2).</li>
	<li>Posizionare il fixator esterno bar livello 1 cm sopra pelle e avvitare bene, il bar al posto di blocco. Tagliare le lunghezze in eccesso perno (Figura 2D).</li>
	<li>Preparare per l'ostectomia (creazione di difetto) inserendo un retrattore piccolo, curvo intorno al femore anteriore e posteriore per proteggere il tessuto molle circostante, il muscolo e il fascio neurovascolare. Utilizzando un oscillante sagittale di ~ 5 mm lama, con molta cautela creare un difetto segmentale di 5 mm attraverso la metà diafisi. Applicare una luce, pressione uniforme con la sega per evitare inutile frattura (Figura 2E).</li>
	<li>Applicare piccole quantità di irrigazione (temperatura ambiente 0,9% sterile salino normale (NS)) come stato necessario durante la creazione di difetto per evitare necrosi termica dell'osso.</li>
	<li>Lavare la ferita con 10 mL di NS dopo aver creato il difetto.</li>
	<li>Somministrare 0,1 mL di un bupivacaina 0,25% con epinefrina (1: 200, 000) per la ferita come un analgesico e vasocostrittore.</li>
	<li>Inserto sul patibolo (5 x 3 x 3 mm) di spugna di collagene o rhBMP-2 imbevuto di spugna (dal passaggio 2) nel difetto. Ogni ponteggio deve essere dimensionato in modo appropriato per estendersi sulla lunghezza ed il volume del difetto, aiutando la spugna a rimanere in posizione. Nota: A questo punto, complessi di mRNA possono essere preparati e iniettate come descritto nei passaggi 7.1-7.3 qui sotto se eseguendo imaging di bioluminescenza.</li>
	<li>Chiudere il piano muscolare utilizzando il semplice modello interrotto con sutura assorbibile 4-0. Chiudere lo strato della pelle utilizzando un modello di subcuticular in esecuzione con 4-0 suturare assorbibile e pelle colla per colmare le lacune intorno i perni sporgenti.</li>
	<li>Togliere il cono di naso, rimanendo il termocuscino, ratto e monitorare continuamente fino a quando il ratto è in grado di mantenere costantemente una postura eretta. A questo punto, posto in una gabbia pulita per recuperare.</li>
</ol>7. preparazione di mRNA complessato e bioluminescenza imaging
Nota: Transfezione con complessi di mRNA deve essere eseguita durante la chirurgia 1 giorno prima imaging luminescenza. Utilizzare tecniche sterili durante la manipolazione di mRNA.
<ol><li>Miscelare 10 µ l di mRNA codifica per Gaussia luciferasi (stock concentrazione di 1 µ g / µ l) con 30 µ l dell'agente trasfettando lipidico.</li>
	<li>Consentire per i complessi di mRNA-lipidico per formare incubando per almeno 5 min a temperatura ambiente. L'agente trasfettando lipidico si condensa le molecole di mRNA, stabilizzando li e aumentando l'efficienza di trasfezione. Nota: Se i complessi non vengono utilizzati immediatamente, memorizzarli in ghiaccio per un massimo di 1 h.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta µ l 20 dotato di punte filtrate, iniettare metà del volume dei complessi di mRNA per l'estremità distale e prossimale del difetto, rispettivamente.</li>
	<li>Il giorno seguente, 3 min prima di formazione immagine, anestetizzare il ratto utilizzando isoflurano inalato come precedentemente descritto al punto 4.1.</li>
	<li>Posizionare il ratto in un in vivo imaging camera attrezzata con un cono di naso offrendo manutenzione isoflurano (0,8% isoflurane, tasso di consegna di2 O di 2-3 L/min).</li>
	<li>Iniettare coelenterazine risospese in soluzione fisiologica ad una dose di 4 mg/kg di peso corporeo nella prossimità del difetto.</li>
	<li>Acquisire immagini di bioluminescenza con lo in vivo imaging system (IVIS) secondo istruzioni18 del produttore.</li>
</ol>8. imaging Protocol
<ol><li>Dopo aver calibrato la macchina radiografica normale, un sistema di raggi x19, anestetizzare ratto usando isoflurano inalato come descritto in precedenza (Vedi punto 4.1) e posizionare il ratto in un cono di naso con isoflurano inalato (0,8% isoflurane, O2 tasso di consegna di 2-3 L/min) per una radiografia di femore antero-posteriore (AP).<ol>
<li>Mentre il topo è in decubito sternale, avanzare la chirurgica hindlimb avanti, flessione dell'anca e soffocare il giunto. Flettere l'articolazione di ginocchio di circa 90°. Nastro sul lato plantare zampa giù, vicino alla parete del corpo. Posizione in avanti la tibia dal femore per eliminare la possibilità di sovrapporre le ossa. Per fornire lieve abduzione dell'anca, posizionare una spugna traslucida (circa 15 mm di spessore) in regione inguinale. Quindi ottenere un'immagine (cranio-caudale) antero-posteriore del femore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere questa visualizzazione radiografica del femore AP immediatamente dopo la chirurgia, settimane 4 e 12 settimane. Utilizzare nastro e garza per posizionare in modo appropriato dell'estremità dell'animale per la qualità e la formazione immagine coerenza.</li>
	<li>Rimuovere il ratto dal cono di naso e monitorare continuamente fino a quando il ratto è in grado di mantenere costantemente una postura eretta. Quindi, inserire nuovamente la gabbia.</li>
</ol>9. istologico procedura
<ol><li>Eutanasia ratti in una camera con inalato CO2 secondo AVMA standard etici16.</li>
	<li>A seguito di eutanasia, radere il hindlimb, togliere la pelle dalle estremità più operativa e disarticulate femore a livello dell'anca. Rimuovere accuratamente tutti i tessuti molli dal femore operativo (compresi tutti i muscoli, tendini e legamenti). Lasciare solo un sottile strato di muscolo che circonda il sito di difetto per proteggere la regione di guarigione da danni accidentali durante la dissezione.</li>
	<li>Posizionare il femore in 10% formalina tamponata neutra a temperatura ambiente per 3-4 giorni per consentire la fissazione. Mantenere un 15:1 formalina tessuto in rapporto al volume. Cambiare la soluzione una volta durante il processo di fissazione.</li>
	<li>Decalcificare il femore in una soluzione di pH 6.5 15% acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) per 3-4 settimane. Raccogliere le radiografie di serie per determinare decalcificazione dell'endpoint.</li>
	<li>Bisecare il femore longitudinalmente con un taglio dall'anteriore al posteriore nel piano sagittale. Presentare il tessuto per inclusione in paraffina standard ed ematossilina ed eosina (H & E).</li>
	<li>Inviare le diapositive di H & E ad un patologo per la valutazione istologica.</li>
</ol>

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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari o vantaggi. Non ci sono stati nessun benefici ricevuti direttamente o indirettamente dagli autori di questo articolo.

Piccoli modelli animali di lesioni ortopediche quali fratture ossee completa attivare ricerca che Esplora i meccanismi di osteogenesi e di valutare il potenziale terapeutico di biomateriali20. Questo studio presenta un topo difetto segmentale modello stabilizzato da un fixator esterno personalizzato che un team lab e ingegneria biomedica può facilmente riprodurre per ulteriori studi di portante osteosynthetic riparazione ossea.
Gli studi precedenti usando comunemente di...

Chirurgia ortopedica traumatologica si concentra sul trattamento di una vasta gamma di fratture complesse. Critica diafisarie segmentale difetti hanno dimostrato difficili da trattare clinicamente a causa la diminuita capacità rigenerativa del muscolo circostante e periostio, nonché il fallimento di localizzato l'angiogenesi1. Tecniche di trattamento moderno includono fissaggio operatorio con l'innesto dell'osso, in ritardo l'innesto dell'osso (Masquelet), trasporto di osso, fusione o amputazione2,3,4. Nella maggior parte dei pazienti che presentano una funzione ambulatoria conservato dopo il loro trauma, con ben funzionanti distale degli arti, salvataggio dell'arto è chiaramente un migliore trattamento opzione5. Questi trattamenti di salvataggio spesso richiedono interventi chirurgici in fasi sopra un corso del trattamento a lungo. Alcuni autori hanno suggerito che la fissazione esterna è superiore rispetto alla superficie di fissazione interna per queste applicazioni a causa del danno in diminuzione del tessuto durante l'impianto, è diminuito impiantata e maggiore regolabilità postoperatoria del il fixator6. Tuttavia, una prova controllata randomizzata futura è attualmente in corso per aiutare a chiarire questa polemica interna versus fissazione esterna in gravi fratture aperte della tibia7. Purtroppo, con qualsiasi trattamento selezionato, significativi tassi di complicazione e fallimento persistono8,9. Con uno dei due metodi di trattamento, rispetto alla perdita segmentale dell'osso, il chirurgo deve vedersela con difetti segmentali della diafisi che presentano sfide significative. Correzioni di difetti segmentali devono massimizzare la stabilizzazione dell'osso e contemporaneamente migliorare il processo osteogenico10,11.
A causa dell'importanza clinica, eppure il volume più basso, di dimensioni critiche della diafisi difetti segmentali, un modello animale efficace, riproducibile è necessario abilitare gruppi di ricerca per far avanzare di tecniche di trattamento e, in definitiva, migliorare gli esiti clinici. I ricercatori hanno bisogno di studiare in vivo meccanismi di guarigione fisiologici in un modello animale mammifero. Mentre tali modelli di fissazione esterna già esistono12,13,14,15, speriamo di fornire un metodo più affidabile per non-unioni negli animali non trattati, diminuzione dei costi attraverso la scelta di Affordable fixator materiali e struttura un semplice protocollo chirurgico per l'applicazione facile per gli studi futuri. L'obiettivo primario del presente protocollo è quello di stabilire un modello affidabile e riproducibile di un difetto critico della diafisi in ratti. La procedura è stata valutata valutando la stabilizzazione e l'osso che guarisce in femori di ratto per 12 settimane. Gli obiettivi secondari inclusi: facendo un modello accessibile come costo efficace possibile, semplificando l'approccio chirurgico e la stabilizzazione e garantendo etico cura degli animali. Gli autori e il team di ricerca ha condotto esperimenti preliminari con una gamma di diversi biomateriali e potenziali terapie rigenerative per migliorare la guarigione in questo difetto segmentale.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina sterile allo 0,9%</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>Utilizzato per l'irrigazione della ferita e la reidratazione</td></tr><tr><td>10% di iodio/povidone</td><td>Carefusion</td><td>1215016</td><td>Utilizzato per preparare la pelle</td></tr><tr><td>10% di formalina tamponata neutra</td><td>VWR</td><td>89370094</td><td>Utilizzato come fissativo</td></tr><tr><td>Filo kirschner non filettato da 1 mm</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1003.15</td><td>Sterilizzato, utilizzato per il perno</td></tr> <tr><td>più prossimaleFilo kirschner filettato da 1 mm</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1005.15</td><td>Sterilizzato, utilizzato per le 3 fessure dei perni più distali</td></tr><tr><td>Garza 2x2</td><td>Covidien</td><td>4006130</td><td>Sterilizzato, utilizzato per preparare la pelle e assorbire il sangue</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl Suture</td><td>Ethicon</td><td>4015304</td><td>Utilizzato per chiudere gli strati muscolari e cutanei</td></tr><tr><td>4-40 x 0,25", 18-8 viti a testa tonda in acciaio inossidabile</td><td>Generico</td><td></td><td>Fissatore esterno montaggio</td></tr><tr><td>4200 Avvitatore a batteria</td><td>Stryker</td><td>OR-S-4200</td><td>Utilizzato per forare fili kirschner</td></tr><tr><td>Garza 4x4</td><td>Covidien</td><td>1219158</td><td>Sterilizzato, utilizzato per assorbire il sangue</td></tr><tr><td>70 % Etanolo</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per preparare</td></tr><tr><td>la pelle Baytril</td><td>Bayer Healthcare LLC, Divisione salute animale</td><td>312.10010.3</td><td>Aggiunto all'acqua come antibiotico</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Hikma Prodotti farmaceutici</td><td>8917156</td><td>Antibiotico pre-operatorio</td></tr><tr><td>CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7205</td><td>mRNA modificato che codifica per Gaussia Luciferasi, tenere sul ghiaccio durante l'uso</td></tr><tr><td>Celenterazina nativa</td><td>NanoLight Technology</td><td>303</td><td>Substrato per Guassia Luciferasi, utilizzato per valutare l'attività della luciferasi in vivo</td></tr><tr><td>Doppio unguento antibiotico</td><td>Johnson & Johnson consumer Inc</td><td>8975432</td><td>Applicato ai siti di spillo post-operatorio come cura delle ferite</td></tr><tr><td>Microblade a doppio taglio</td><td>Stryker</td><td>5400-003-410</td><td>Utilizzato per creare un difetto di 5 mm nel femore</td></tr><tr><td>Acido etilendiammine tetraacetico (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td>Utilizzato per decalcificare l'osso per prepararsi all'istologia</td></tr><tr><td>Buprenorfina a rilascio prolungato</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>Utilizzato come sollievo dal dolore di 3 giorni</td></tr><tr><td>Fenestrato tende</td><td>3M</td><td>1204025</td><td>Utilizzato per stabilire il campo sterile</td></tr><tr><td>Cavo del manipolo per TPS</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-4N</td><td>Utilizzato per creare un difetto di 5 mm nel</td></tr><tr><td>femore Cuscinetto riscaldante</td><td>K& H Pet Products</td><td>121239</td><td>Mantenimento della temperatura corporea di ratto</td></tr><tr><td>Cacciavite a testa esagonale</td><td>Wiha</td><td>263/1/16 " X 50</td><td>Serraggio del fissatore esterno</td></tr><tr><td>Camera di induzione</td><td>Anestesia generica</td><td></td><td>per ratti</td></tr><tr><td>Infondere la spugna di collagene con proteina morfogenica ossea umana ricombinante-2</td><td>Medtronic</td><td>7510200</td><td>Trattamento clinicamente rilevante utilizzato come controllo positivo</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td>Anestesia per ratti</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Modalità di imaging a bioluminescenza</td></tr><tr><td>Jig</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Utilizzato per posizionare perni bicorticali</td></tr><tr><td>Lipofectamine MessengerMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>LMRNA003 agente complessante dell'mRNA che consente la somministrazione di mRNA</td><td></td></tr><tr><td>Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0,25%) ed epinefrina (1:200.000))</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>NDC 63323-468-37</td><td>Applicato al sito chirurgico per alleviare il dolore e la vasocostrizione</td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Hospira</td><td>8904653</td><td>Utilizzato come solvente per la polvere di cefazolina</td></tr><tr><td>Piastre fissatrici esterne in titanio</td> Preparato <td>su misura</td><td></td><td>in casa con rottami di titanio e fresatrice</td></tr><tr><td>Total Performance System (TPS) Console</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-1</td><td>Utilizzato per creare un difetto di 5 mm nel femore</td></tr><tr><td>TPS MicroSaggital Saw</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-34</td><td>Utilizzato per creare un difetto di 5 mm nel femore</td></tr><tr><td>Ultrafocus Faxitron con DXA</td><td>Faxitron</td><td></td><td>Modalità di imaging radiografico ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Dieta per ratti Uniprim</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td><td>Dieta per ratti medicata</td></tr><tr><td>Interruttore universale per TPS</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-9</td><td>Utilizzato per creare 5 mm difetto nel femore</td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Chiusura cutanea</td></tr></tbody></table>

un modello affidabile e riproducibile critiche medie femorale difetto segmentale in ratti stabilizzato con un fixator esterno personalizzato

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

Ricerca ortopedica si basa pesantemente su modelli animali per lo studio dei meccanismi dell'osso che guarisce in vivo , nonché di studiare le nuove tecniche di trattamento. Critica e medie difetti segmentali sono difficili da trattare clinicamente, e gli sforzi di ricerca potrebbero beneficiare di un affidabile, ambulatorio modello piccolo animale di un difetto segmentale femorale. In questo studio, presentiamo un protocollo chirurgico ottimizzato per la creazione di costante e riproducibile di un difetto della diafisi critico di 5 mm in un femore di ratto stabilizzato con un fixator esterno. L'ostectomia della diafisi è stato effettuato usando una maschera personalizzata per posizionare i 4 fili di Kirschner bicortically, che sono stati stabilizzati con un dispositivo adattato fixator esterno. Una sega oscillante dell'osso è stata utilizzata per creare il difetto. O una spugna di collagene da solo o una spugna di collagene con rhBMP-2 è stata impiantata nel difetto, e la guarigione ossea è stata monitorata per 12 settimane con le radiografie. Dopo 12 settimane, i ratti sono stati sacrificati, e l'analisi istologica è stata effettuata sul controllo asportato e trattati femori. I difetti ossei contenenti solo spugna di collagene provocato non-Unione, mentre rhBMP-2 trattamento ha reso la formazione di un rimodellamento dell'osso periostale insensibile e nuovo. Fissazione di animali ben recuperata dopo l'impianto ed esterna ha avuto successo nella stabilizzazione dei difetti femorali per 12 settimane. Questo modello semplificato chirurgico potrebbe essere applicato facilmente per studiare la guarigione ossea e testare nuovi biomateriali ortopedici e terapie rigenerative in vivo.

Gli ambulatori sono stati effettuati in circa un'ora da un chirurgo con l'aiuto di un assistente. Dopo l'ottimizzazione chirurgica, complicazioni intra - e postoperatorie sono stati notevolmente ridotti al minimo e utilizzano dell'apparato jig assicurata dimensione consistente (5 x 3 x 3 mm) e la localizzazione dei difetti femorali. Ratti sono stati ambulatorio immediatamente dopo il recupero dall'anestesia e non sembrano avere alcun alterato pattern comportamentali; loro andatura non era...

Modelli di mammiferi in vivo di difetti ossei critici dimensioni sono essenziali per i ricercatori che studiano i meccanismi di guarigione e terapie ortopediche. Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di difetti riproducibile, segmentale, femorale in ratti stabilizzati con fissatore esterno.

Un modello affidabile e riproducibile critiche medie femorale difetto segmentale in ratti stabilizzato con un Fixator esterno personalizzato

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

Questo protocollo chirurgico utilizza un modello di difetto segmentale fisso esternamente coerente e riproducibile per valutare i meccanismi di guarigione dell'osso e l'uso di potenziali terapie rigenerative. Abbiamo semplificato un intervento chirurgico impegnativo per la creazione e la stabilizzazione di un modello segmentale di difetti ossei accessibile ed economico pur rimanendo appropriati per studi di guarigione longitudinale. Questa tecnica è particolarmente traducibile al trattamento di difetti ossei diafisali traumatici di dimensioni critiche che possono beneficiare della stabilizzazione con fissazione esterna, sebbene il modello richieda ulteriori studi.Per evitare una frattura durante la perforazione dei perni, utilizzare rotazioni elevate al minuto e una bassa pressione per forare la corteccia laterale, quindi diminuire le rotazioni al minuto per avanzare. Dopo aver preparato l'impalcatura da un kit di innesto osseo del tubo proteico morfogenetico osseo, secondo le istruzioni del produttore, utilizzare forbici sterili e un righello sterile per tagliare la spugna di collagene per adattarsi a un difetto di cinque per tre per tre millimetri. Quindi utilizzare una siringa per distribuire uniformemente la soluzione di proteina morfogenetica ossea-2 sulla superficie della spugna, fino a quando l'intero volume della soluzione non viene assorbito.Successivamente, radere l'area intorno alla gamba posteriore di un ratto anestetizzato usando la tredicesima costola, la zampa posteriore e le mezze linee dorsali e ventrali come margini, seguita da quattro scrub alternati sequenziali della pelle esposta con garza sterile imbevuta di 10%povidone-iodio e 70% di etanolo. Per indurre il difetto femorale, estendere la gamba rasata attraverso un drappo appiccicoso chiaro fenestrato e coprire la panca chirurgica in asciugamani sterili per creare un campo sterile. Palpare il femore e utilizzare una lama numero 15 per creare un'incisione anterolaterale attraverso la pelle che si estende dalla rotula al trochanter maggiore al femore prossimale.Incidere con cura la fascia laterale della gamba lungo il setto intermuscolare per separare il muscolo vastus lateralis del quadricipite anterioremente dai tendini del ginocchio posteriormente fino a quando il femore laterale non viene esposto. Mantenendo una lama bisturi numero 15 parallela al contorno della superficie ossea, tagliare delicatamente il muscolo lontano dall'osso sottostante per eseguire un'attenta dissezione circonferenziale dei tessuti molli atraumatica e iniziare sulla superficie laterale, esporre il femore alla sua diafisi media. Utilizzare un ascensore periosteale per sollevare il muscolo dall'osso esposto mentre viene sezionato e procedere intorno all'albero femorale fino a quando da sette a 10 millilitri di diafisi centrale sono stati liberati dai tessuti molli su tutti i lati.Quindi, posizionare un perno appena a livello dell'epicondile laterale, seguito dal posizionamento di una giga a filo al femore distale laterale, e inserire un filo kirschner con punta filettata di un millimetro. Successivamente, mantenendo la posizione della giga sull'osso, identificare dove il perno più prossimale entrerà nell'osso in base ai fori di giga. Incidere con cura parallelamente alle fibre del tendine gluteo secondo necessità per creare un piccolo spazio nel tessuto per far passare il perno prossimale, riducendo al minimo i danni iatrogeni al tendine.Forare un k-wire non filettato di un millimetro nello spazio e confrontare l'altezza del perno forato con il perno sciolto per confermare che il perno innestare entrambe le cortici. Mantenere la posizione della giga a contatto con l'osso e praticare due k-wire filettati di un millimetro, uno su entrambi i lati del futuro sito dei difetti, assicurando che i perni innescheranno entrambe le cortici e posizionare il livello della barra del fissatore esterno di un centimetro sopra la pelle. Avvitare saldamente, bloccando la barra in posizione e ritagliare le lunghezze dei perni in eccesso.Posizionare un piccolo retrattore curvo attorno al femore anteriore e posteriore per proteggere il fascio di tessuti molli, muscoli e neurovascolari circostante e utilizzare una lama oscillante sagittale di circa cinque millimetri e luce, anche pressione, per creare con molta attenzione un difetto segmentale di cinque millimetri attraverso la lama oscillante media. Lavare la ferita con 10 millilitri dello 0,9% di soluzione salina normale dopo aver creato il difetto e somministrare 0,1 millilitri dello 0,25% di bupivacaina con epinefrina alla ferita come analgesico e vasocostrittore. Inserire l'impalcatura della spugna imbevuta di proteina morfogenetica ossea-2 nel difetto e utilizzare una sutura assorbibile 4-0 nel semplice modello interrotto per chiudere il piano muscolare.Quindi chiudere lo strato cutaneo usando una sutura assorbibile 4-0 in un modello sottocuticolare in esecuzione, quindi incollare la pelle per chiudere eventuali spazi intorno ai perni sporgenti e ottenere immediatamente un'immagine radiografica anteriore-posteriore del femore e quattro e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico. Difetti di controllo negativi contenenti solo una spugna di collagene non mostrano alcuna prova di osteogenesi ponte tra i bordi ossei prossimali e distali. Una piccola quantità di nuovo rimodellamento osseo può essere vista direttamente adiacente al bordo del femore tagliato, mentre il difetto stesso mostra una mancanza di materiale osseo, la presenza di cartilagine e un certo ematoma residuo.I difetti contenenti la spugna imbevuta di proteina morfogenetica ossea-2 dimostrano una significativa guarigione ossea già quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, come evidenziato dal ponte indifeso radiopasco attraverso il difetto. Entro 12 settimane, si è formata una nuova deposizione minerale significativa in tutto il difetto. Un nuovo osso periosteale significativo può essere osservato nel indivoro che si estende dal bordo del femore tagliato e le spicule dell'osso tessuto e lamellare si sono sviluppate in tutto il difetto.Inoltre, la deposizione di cartilagine non è vista. L'imaging tramite In Vivo Imaging System dopo la rimozione del fissatore esterno consente la visualizzazione delle cellule trasfette bioluminescenti all'interno del difetto. Ad esempio, le cellule nella cavità midollare luminescenza dopo la trasfezione con codifica mRNA complessa per Gaussia luciferasi, e potrebbero essere utilizzate per misurare i cambiamenti biologici nell'espressione di un gene o proteina di interesse durante il processo di guarigione.Il posizionamento dei pin è importante per garantire una fissazione esterna stabile e duratura. I perni devono essere direttamente perpendicolari al femore e paralleli l'uno all'altro, per ridurre al minimo la rottura e l'infezione. Utilizzando questo modello, i meccanismi biologici, come specifiche espressioni proteiche, possono essere monitorati per comprendere meglio la guarigione e diversi biomateriali o terapie dell'impalcatura possono anche essere testati per l'efficacia terapeutica.Speriamo che questa tecnica consenta ai futuri ricercatori di studiare in modo più efficiente ed efficace la guarigione ortopedica con fissazione esterna in modo che i loro risultati possano essere tradotti in migliori successi clinici. Evitare di inalare gas anestetici, indossare dispositivi di protezione individuale adeguati durante la manipolazione di formalina ed EDTA e fare attenzione quando si maneggiano strumenti chirurgici, in particolare il trapano e la sega ossea oscillante.

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Un modello affidabile e riproducibile critiche medie femorale difetto segmentale in ratti stabilizzato con un Fixator esterno personalizzato (Video) | JoVE Journal

Un modello affidabile e riproducibile critiche medie femorale difetto segmentale in ratti stabilizzato con un Fixator esterno personalizzato

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