Name: Misurazione del cortisolo a Koala (Phascolarctos cinereus) Pelliccia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Scopri il metodo per misurare il cortisolo dal pelo di koala (Phascolarctos cinereus) come biomarcatore dello stress cronico. Questa tecnica sensibile e riproducibile utilizza metanolo come solvente ottimale per l'estrazione.

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Questo lavoro è stato sostenuto attraverso finanziamenti di ricerca per le start-up per Edward Narayan attraverso la Western Sydney University, School of Science and Health. Gli autori ringraziano Jack Nakhoul per l'assistenza nell'elaborazione dei campioni.

Questo progetto è stato eseguito secondo severe linee guida per la cura degli animali e dell'uomo. L'etica animale è stata concessa dalla Western Sydney University (A12373). Inoltre, una valutazione del rischio di laboratorio e un modulo di biosicurezza e radiazioni sono stati inviati e accettati dalla Western Sydney University per intraprendere in modo sicuro questa ricerca (B12366).
NOTA: I campioni di pelliccia di Koala per questo progetto sono stati ottenuti dall'Adelaide Koala and Wildlife Hospital, situato al 282 di Anzac Highway, Plympton South Australia. La pelliccia è stata prelevata da un koala che era stato ricoverato in ospedale ed eutanasia a causa delle loro gravi lesioni. Il koala deceduto era stato conservato in un congelatore all'interno di un sacchetto del corpo subito dopo la morte. Dopo aver rimosso il koala deceduto dal sacco del corpo, 1,2 g di pelliccia è stata rasata dalla nuca utilizzando clipper animali standard. La pelliccia è stata rasata il più vicino possibile alla pelle, in modo da garantire che la pelle non fosse tagliata. Una volta rasato, il koala deceduto è stato rimesso nel sacchetto del corpo e messo nel congelatore. La pelliccia è stata poi posta in una sacca in lamina di alluminio e conservata sotto i -20 gradi centigradi. Durante il transito, la pelliccia è stata tenuta a temperatura ambiente, e all'arrivo in laboratorio, la pelliccia è stata conservata a -80 gradi centigradi.
1. Estrazione del cortisolo di pelliccia di Koala
<ol><li>Togliere la pelliccia dal deposito a -80 gradi centigradi e lasciare scongelare il tempo.</li>
	<li>Pesare la pelliccia su un equilibrio di precisione analitico di laboratorio.</li>
	<li>Mettere 60 mg della pelliccia in un tubo di centrifugatura prepesato ed etichettato da 1,5 mL e ripetere fino a riempire 18 tubi. NOTA: per questo studio di convalida sono stati utilizzati 18 sottocampioni di pellicce.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di cromatografia liquida ad alte prestazioni al 100% (HPLC) isopropanolo ad ogni tubo utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Campioni di vortice per 30 s.</li>
	<li>Filtrare ogni campione utilizzando un setaccio micro precisione di 0,5 mm in modo da ottenere la separazione di liquido e pelliccia.</li>
	<li>Scartare il liquido in un contenitore di rifiuti.</li>
	<li>Mettere ogni campione di pelliccia in una barca di pesatura in plastica etichettata, quindi mettere in un desiccatore vuoto, lasciare asciugare la pelliccia per 3 giorni.</li>
	<li>Una volta completamente asciutto, mettere ogni campione in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL etichettato.</li>
	<li>Mettere ogni campione in un mulino a perline con 3 perline in acciaio cromato (3,2 mm) e polverizzare per 2 min a 30 frullati al secondo.</li>
	<li>Pipetta 1,5 mL della prima tecnica di estrazione (etanolo di grado analitico al 100%) in 6 tubi di microcentrifuga da 1,5 mL contenenti il campione di pelliccia.</li>
	<li>Eseguire lo stesso per il metanolo di grado analitico al 100% e l'isopropanolo di grado analitico 100% fino a 18 1,5 mL di tubi di microcentrifuga sono riempiti.</li>
	<li>Capovolgere ogni tubo di microcentrismo da 1,5 ml e incubare a temperatura ambiente (RT) con pulsazione costante utilizzando uno shaker per 3 h.</li>
	<li>Rimuovere e defiltrare i campioni utilizzando un setaccio di micro precisione di 0,5 mm.</li>
	<li>Trasferire il liquido in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato con una pipetta, garantendo al contempo che la pelliccia venga scartata in modo appropriato.</li>
	<li>Estratto di solvente completamente asciutto sotto un flusso di vapore N2 sotto un armadio fume.</li>
	<li>Ricostituire l'estratto di campione essiccato utilizzando 400 l di assaggio tampone (composizione fornita nel kit di cortisolo commerciale; vedi Tabella dei materiali) e 100 -L di etanolo di grado analitico 100%. NOTA: estratti di esempio possono essere memorizzati a -80 .</li>
</ol>2. Controlli interni
<ol><li>Per fare controlli, fare una piscina di campioni estratti con alti livelli di ormone. Per creare questa piscina, selezionare i campioni da animali con esposizione nota al fattori di stress. Ad esempio, selezionare i campioni da koala che sono stati salvati da traumi ambientali in quanto generalmente mostrano alti livelli di ormone cortisolo6.<ol>
<li>Per fare il pool di estratto, prendere 20 l' di estratto da ogni campione (n : 10) fino a ottenere un volume totale di 200 L. Il pool di estratti può essere conservato a -80 C fino a i saggi. Eseguire il pool in ogni analisi come controlli interni bassi o alti (vedere il passaggio 2.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per il saggio, utilizzare il pool per effettuare scorte per controlli bassi e alti che si legano rispettivamente al 70% (C1) e al 30% (C2). Ottenere il fattore di diluizione per i punti di rilegatura 30% e 70% dal grafico del parallelismo per l'estratto rispetto allo standard cortisolo (Figura 1). Utilizzare il buffer di analisi per la diluizione del pool di esempio. Ad esempio, utilizzare 60 l dell'estratto del pool e 60 luna di buffer di analisi per la diluizione 1:2. NOTA: per l'estratto di metanolo, il punto di rilegatura del 30% era pulito mentre il 70% del punto di rilegatura era di circa 1:2 come da Figura 1. Pertanto, questi hanno fornito il fattore di diluizione per i controlli interni (rispettivamente C1 e C2) per l'esecuzione all'interno del saggio.</li>
</ol>3. Analisi cortisolo in estratti di pelliccia di koala
<ol><li>Utilizzare un kit di cortisolo commerciale (Tabella dei materiali) e impostare la piastra da 96 bengeti comprendente i campioni, i controlli, gli standard del cortisolo, i pozzi di legame non specifici e i pozzi di legatura massima seguendo le istruzioni del fornitore. Utilizzare il foglio di layout della lastra fornito nell'opuscolo del kit per elencare le posizioni dei campioni, dei controlli e degli standard sulla mappa della lastra. NOTA: si consiglia di eseguire tutti i campioni, i controlli e gli standard in duplicato per consentire l'accuratezza dei risultati.</li>
	<li>Preparare i campioni. Seguire l'estrazione dell'ormone pelliccia (sezione 1) per ottenere il 100% di metanolo estratto per la pelliccia di koala.</li>
	<li>Preparare i reagenti. Seguire la procedura descritta nel kit di cortisolo commerciale per preparare i reagenti tra cui (1) buffer di analisi, (2) lavare buffer e (3) standard (composizioni fornite nel kit di cortisolo, Tabella dei materiali).</li>
	<li>In base alle istruzioni fornite nel kit di cortisolo, pipet 50 - L di campioni o standard in pozzi nella piastra. Pipet 75 l e 50 L di assaggio buffer nei pozzi di rilegatura non specifici (NSB) e i pozzi di rilegatura massima (Standard B0 o zero), rispettivamente.</li>
	<li>Aggiungere 25 l del cortisolo coniugato ad ogni pozzo utilizzando un pipet ripetitore. Quindi pipet 25 -L dell'anticorpo cortisolo in ogni pozzo, ad eccezione dei pozzi NSB. Toccare delicatamente i lati della piastra per assicurarsi che i reagenti siano ben miscelati.</li>
	<li>Coprire la piastra con il sigillante della piastra e agitare a temperatura ambiente per 1 h (a bassa velocità) utilizzando uno shaker orbitale.</li>
	<li>Togliere il sigillante e aspirare la piastra del pozzo lavando ogni pozzo con 300 .</li>
	<li>Asciugare la piastra toccando la piastra su asciugamani assorbenti puliti.</li>
	<li>Pipette 100 -L di substrato tetrametilbenzadina (TMB) (composizione fornita nel kit di cortisolo, Tabella deimateriali) ad ogni pozzo.</li>
	<li>Posizionare il sigillante sulla piastra del pozzo e incubare a RT per 30 min.</li>
	<li>Pipette 50 -L di soluzione di arresto per ogni pozzo.</li>
	<li>Posizionare la piastra del pozzo in un lettore di lamiere in grado di leggere 450 nm.</li>
	<li>Per calcolare la concentrazione finale dell'ormone, derivare la concentrazione finale di cortisolo di pelliccia in ng/mg di campione moltiplicando la concentrazione di ormone pg/mL con il volume dell'estratto finale (0,5 mL) e dividendo per la massa campione di pelliccia (60 mg).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono una serie di studi che utilizzano una serie di tecniche per rilevare cortisolo nella pelliccia di mammifero. Questo studio presenta i risultati per la rilevazione del cortisolo nella pelliccia raccolta da un koala selvatico esposto allo stress antropogenico corrente. Questo studio innovativo usato pelliccia per testare quale dei tre solventi comunemente utilizzati sono meglio per estrarre cortisolo, una misura di stress cronico, dalla pelliccia koala. I risultati hanno mostrato che il metanolo al 100% era il solv...

Gli ecosistemi australiani sostengono la vita umana attraverso la fornitura di servizi tra cui cibo e fibra tra molte altre interazioni dinamiche1. Ironia della sorte, è l'attività umana che opera come il motore dominante della perturbazione dell'ecosistema attraverso il cambiamento della biodiversità2. La frammentazione degli habitat, noto come processo di divisione di grandi habitat continui in piccole macchie di terra, isolate l'una dall'altra, è il principale cambiamento di biodiversità antropogenica che minaccia gli ecosistemi australiani2. La frammentazione dell'habitat modifica la struttura e la diversità della composizione delle specie in qualsiasi area, riducendo così l'area di habitat necessaria a queste specie per mantenere le popolazioni vitali2. Il risultato è una maggiore concorrenza tra le specie per le risorse tra cui cibo, carburante, fibra e acqua3. La distruzione degli ecosistemi australiani a seguito del cambiamento della biodiversità sta avendo conseguenze catastrofiche su molte specie autoctone australiane1.
La specie marsupiale più iconica dell'Australia, il koala (Phascolarctos cinereus), dipende dal fatto che gli ecosistemi australiani rimangano sani per la loro sopravvivenza4. L'introduzione dell'insediamento europeo ha causato un rapido declino delle popolazioni australiane di koala, in quanto sono state massacrate per le loro pelli in cerca di profitto in un grande commercio di esportazione5. Questa pratica è stata vietata negli anni '80 e le popolazioni di koala sono state quindi in grado di stabilizzare5. Tuttavia, la crescita esponenziale della popolazione umana ha portato questa specie a competere per gran parte del loro habitat, e la loro sopravvivenza è di nuovo sotto minaccia6. Secondo l'Unione Internazionale per la Conservazione della Natura (IUCN), tutte le popolazioni di koala australiani sono elencate come vulnerabili all'estinzione con una tendenza demografica in diminuzione7. Questo elenco è attribuito all'incertezza sui parametri della popolazione pertinenti e alla marcata variazione delle tendenze demografiche per questa specie7. Essendo gli animali più iconici ed endemici, i koala beneficiano in gran parte l'economia australiana attraverso il turismo (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Una stima suggerisce che il turismo correlato al koala ha generato circa 9.000 posti di lavoro e contribuisce tra 1,1 e 2,5 miliardi di dollari per l'economia (NSW Office of Environment and Heritage 2018). La rimozione di qualsiasi specie ha il potenziale per essere catastrofica, e può essere visto nel costante declino della fauna selvatica australiana nativa6. Inoltre, l'economia australiana sentirà le ramificazioni se le popolazioni di koala australiani continueranno a diminuire al ritmo di6.
Si suggerisce che la prevalenza di morte e malattia in risposta alla frammentazione dell'habitat sia il risultato dello stress cronico8. 24 specie marsupiali sono già state dichiarate estinte in Australia a causa della frammentazione dell'habitat, con i koala che seguono una tendenza simile8. La complessità della frammentazione dell'habitat e dei sistemi biologici è sinergica, ma può essere discomificata attraverso l'analisi della risposta allo stress6. Generalmente, qualsiasi disturbo in un ambiente naturale di animali attiva una complessa cascata di eventi neuroormonali, noti come una risposta 'lotta o volo'9,10. Questa risposta allo stress è un processo che inizia nel cervello dove viene attivato l'asse ipotalamico-pituitario-surrenale (HPA)11. Un componente del cervello chiamato l'ipotalamo rilascia l'ormone che rilascia corticotrofina (CRH), che poi segnala l'ipofisi anteriore per rilasciare l'ormone adrenocorticotrofico (ACTH)11. Questo a sua volta stimola la secrezione glucocorticoide dalla medulla surrenale. Il corpo circola glucocorticoidi attraverso il sangue, che devia la conservazione del glucosio dal glicogeno e mobilita il glucosio dal glicogeno immagazzinato11. Questa cascata di eventi neuroormonali è la risposta utilizzata dall'animale per affrontare stimoli imprevedibili11. Tuttavia, quando i glucocorticoidi vengono rilasciati e rimangono elevati per un periodo prolungato di tempo, l'animale è considerato vivendo stress cronico12,13. Questo processo comporta la deviazione di energia da altre funzioni corporee corporali, in quanto è necessario per la produzione di glucocorticoidi in corso13. Di conseguenza, lo stress cronico può vietare la crescita, la riproduzione e l'immunità, tutti essendo tratti chiave del fitness necessari per la sopravvivenza14.
Misurare la produzione di glucocorticoidi di un animale è un indicatore comune utilizzato per determinare se l'animale sta vivendo o meno stress fisiologico15. Per farlo, i glucocorticoidi possono essere misurati nel plasma sanguigno, siero, saliva, urina o feci16. Tuttavia, l'evidenza suggerisce che i capelli sono un indicatore molto più efficace di stress cronico, al contrario del suddetto16. Questo perché i capelli è pensato per incorporare ormoni trasmessi al sangue durante la sua fase di crescita; è relativamente stabile; e qualsiasi cortisolo rilevato nei capelli riflette lo stress fisiologico sperimentato nel periodo di crescita dei capelli, che può essere settimane fino a mesi16. Inoltre, qualsiasi raccolta di cortisolo dovrebbe essere non invasiva al fine di ridurre al minimo lo stress associato alla cattura e alla manipolazione16. Tuttavia, qualsiasi stress sperimentato durante questo evento non avrebbe un impatto sui livelli di glucocorticoide nei capelli16. Ci sono stati molti studi che esplorano la competenza di utilizzare i capelli per misurare lo stress a lungo termine in un certo numero di animali, e comprendono studi su renne, orsi grizzly, scimmie rhesus, buoi muso e orsi bruni17,18, 19 del 12 , 20 anni , 21. Il cortisolo per capelli viene solitamente estratto lavando prima il campione per garantire che il sudore e il cortisolo di derivazione sebum depositati sulla superficie dei capelli non venga co-estratto con cortisolo e poi polverizzando il campione in un perline-battitore22. Dopo il lavaggio, il campione deve essere essiccato per garantire la completa evaporazione22. Infine, utilizzando un solvente, il campione può essere estratto e ricostituito per facilitare il saggio di cortisolo22. Il solvente più comune utilizzato per estrarre il cortisolo dalla pelliccia è il metanolo21,23; tuttavia, ci sono alcuni studi che utilizzano etanolo e isopropanolo nelle loro tecniche di estrazione del cortisolo. Ad esempio, uno studio che ha usato l'etanolo ha avuto successo per estrarre il cortisolo dal liquido amniotico umano24. Inoltre, uno studio che ha usato isopropanol ha avuto successo per estrarre cortisolo da capelli e unghie umane25,26. Per questo motivo, questo studio ha testato tutti e tre i solventi (metanolo, etanolo e isopropanolo) per determinare quale sia stato il più riuscito per l'estrazione del cortisolo da campioni di pelliccia di koala.
L'obiettivo principale di questo studio era quello di utilizzare le tecniche attuali per convalidare una tecnica ottimale di estrazione dell'ormone da utilizzare come misura non invasiva del cortisolo dalla pelliccia di koala. Ciò è stato ottenuto testando tre solventi di estrazione (metanolo, etanolo e isopropanolo). Abbiamo ipotizzato che il metanolo sarà il solvente ottimale utilizzato per estrarre il cortisolo dalla pelliccia di koala perché è il solvente raccomandato di estrazione da Arbor saggio cortisol kit27.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Perle</td></tr> di <tr><td>acciaio al cromo</td> da 1,5 mL <td>n/a</td><td>n/a</td><td>3,2 mm x 3</td></tr><tr><td>Kit di cortisolo</td><td>Saggi Arbor</td><td>K003-H1W</td><td>Prodotto nel Michigan USA</td></tr><tr><td>Kit di immunodosaggio enzimatico del cortisolo DetectX</td><td>Saggi Arbor K003-H5</td><td></td><td>Utilizzato per la prima volta per il test del cortisolo nella pelliccia di koala</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Isopropanolo di grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a Metanolo</td> di <td>grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a</td> Micro pipetta di <td>grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>setaccio di precisione</td><td>da</td><td></td><td>0,5 mm</td></tr> Bio <tr><td></td><td>Radi</td><td>n/a</td><td>n/a Rondella</td></tr> per <tr><td>micropiastre</td><td>Bio Radi</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Bio Line</td><td>n/a</td><td>n/a Pesatrice</td></tr> per <tr><td>plastica Barca</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a Sigillante</td></tr> per <tr><td>piastre</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a Bilancia</td></tr> di <tr><td>precisione</td><td>n/a</td><td>n/</td><td>a n/a Miscelatore</td></tr> a <tr><td>vortice</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

misurazione del cortisolo a koala (phascolarctos cinereus) pelliccia

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

I metodi ottimali di estrazione degli ormoni utilizzati per misurare lo stress negli animali tra i tipi di campione non sono sempre gli stessi. L'iconica specie marsupiale australiana, il koala (Phascolarctos cinereus), deve affrontare un'esposizione prolungata a fattori di stress antropogenici e la valutazione dello stress cronico nelle popolazioni selvatiche è urgentemente giustificata. Uno dei modi più efficaci per misurare lo stress cronico è attraverso l'analisi dell'ormone glucocorticoide cortisolo nei capelli o pelliccia, in quanto supporta le risposte fisiologiche e comportamentali. Questo studio di convalida di laboratorio ha lo scopo di testare le tecniche attuali per convalidare un metodo ottimale di estrazione dell'ormone da utilizzare come misura non invasiva del cortisolo nella pelliccia di koala. È riconosciuto che l'utilizzo di tecniche non invasive per misurare gli ormoni dello stress è preferito rispetto alle tecniche tradizionali ed invasive a causa delle loro ideali punti di vista pratici ed etici. Inoltre, è relativamente più facile acquisire pelliccia dai koala che acquisire campioni del loro sangue. Questo studio ha utilizzato campioni di pelliccia di koala acquisita dall'Adelaide Koala e dal Wildlife Hospital per eseguire una serie di tecniche di estrazione ormonale nel tentativo di convalidare un metodo ottimale di estrazione del cortisolo. I risultati hanno mostrato che il metanolo al 100% ha fornito l'estrazione del solvente più ottimale rispetto al 100% di etanolo o al 100% dell'isopropanolo sulla base dei risultati del parallelismo. In conclusione, questo metodo di estrazione del cortisolo dalla pelliccia di koala ha fornito un saggio affidabile non invasivo che potrebbe essere utilizzato per studiare lo stress cronico nei koala.

Il rilevamento di analisi dei metaboliti ormonali di interesse è determinato utilizzando il parallelismo. Utilizzando una curva di parallelismo, il punto di rilegatura del 50% determina anche il fattore di diluizione del campione sulla curva standard (Figura 1). Come mostrato nel grafico del parallelismo (Figura 1), gli estratti di etanolo al 100% e 100% isopropanol non hanno fornito uno spostamento parallelo rispetto allo standard cortisolo. Tuttavia, l'estratto di metanolo 100% ha forn...

Vi presentiamo un protocollo per determinare il solvente di estrazione ottimale per misurare il cortisolo dalla pelliccia di koala. I solventi utilizzati in questo protocollo sono metanolo, etanolo e isopropanolo. Determinare un solvente di estrazione ottimale aiuterà a misurare in modo affidabile la pelliccia per determinare l'impatto dello stress cronico sui koala.

Misurazione del cortisolo a Koala (Phascolarctos cinereus) Pelliccia

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Questo è un metodo nuovo per la valutazione dell'ormone glucocorticoide, cortisolo, dalla pelliccia di koala. Fornisce un nuovo biomarcatore per la valutazione dello stress cronico nei koala. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo altamente sensibile e riproducibile con un tempo di consegna abbastanza rapido tra la preparazione del campione e il test ormonale.Questa tecnica consente la valutazione quantitativa dello stress cronico nei koala, che è uno strumento di gestione clinica altamente utile. Ad aiutarmi con questa procedura c'è Dylan Fox, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura recupera la pelliccia dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e lasciala scongelare a temperatura ambiente.Quindi, pesare la pelliccia su un bilanciere analitico di precisione di laboratorio. Posizionare 60 milligrammi di pelliccia in un tubo di centrifuga pre-pesato ed etichettato da 1,5 millilitri e ripeterlo fino a riempire 18 tubi. Utilizzando una pipetta, aggiungere un millilitro di isopropanolo di grado HPLC al 100% a ciascun tubo.Vortice i campioni per 30 secondi. Filtrare ogni campione con un setaccio micro-precisione da 0,5 millilitri in m

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Dispositivo portatile per il pretrattamento della saliva al fine di migliorare la rilevazione del cortisolo

Scopri il metodo per misurare il cortisolo dal pelo di koala (Phascolarctos cinereus) come biomarcatore dello stress cronico. Questa tecnica sensibile e riproducibile utilizza metanolo come solvente ottimale per l'estrazione.

Misurazione del cortisolo a Koala (Phascolarctos cinereus) Pelliccia

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