Name: Valutazione e caratterizzazione delle navi ialoidi nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Impara a valutare e caratterizzare i vasi ialoidi nei topi per studiare la regressione vascolare oculare. Questo metodo combina imaging in vivo ed es vivo per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 ed EY028100) a J.C. . La procedura di isolamento degli ialoidi descritta in questo studio è stata adattata con la modifica da protocolli generosamente condivisi dai dottori Richard Lang, Toshihide Kurihara e Lois Smith, di cui gli autori sono grati.

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali in Oftalmic e Vision Research per esperimenti sugli animali, seguendo le Linee guida degli Istituti Nazionali di Salute ( NIH) per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali per le procedure sperimentali e le norme stabilite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Boston Children's Hospital. Lrp5-/- topi (stock n. 005823; Jackson Laboratory) e il suo controllo wild-type (WT) Topi C57BL/6J (stock n. 000664; Jackson Laboratory) sono stati utilizzati per questo studio.
1. Parte I: Immagini in vivo di vasi ialoidi utilizzando un sistema di imaging della retina dei roditori
<ol><li>Preparazione dell'anestesia dei topi e dilatazione della pupilla
	<ol>
<li>Selezionare i mouse.<ol>
<li>Utilizzare topi più vecchi di P12 (dopo aver aperto gli occhi) per l'imaging della retina; entrambi i sessi sono adatti.</li>
			<li>Come desiderato, topi mutanti di immagine con regressione ialoide ritardata (e loro controlli WT) durante l'età adulta. I topi WT di età superiore a 3 settimane potrebbero non presentare vasi ialoridi rimanenti molto rilevabili, quindi P12–P21 è ideale per l'imaging rimanente visibile WT hyaloid.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare una miscela di chetamina/xilazina per l'anestesia.<ol>
<li>Prendere 2,3 mL di soluzione di stock di ketamina (100 mg/mL) e 0,7 mL di soluzione di stock di xilosina (20 mg/mL) e aggiungere 20 mL di salina sterile (20 mg/mL di salina sterile (20 mg/mL) 0,9% di cloruro di sodio) per fare una soluzione di lavoro di una miscela di ketamina/xilanina (10 mg/mL di ketamina e 0,6 mg/mL di xilana).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Anestesizzare i topi iniettando intraperitonealmente la miscela di ketamina/xilonica in un volume di 8 volte il peso corporeo del topo (ad esempio, un topo da 20 g ha bisogno di 160 L di miscela di soluzione di lavoro di ketamina/xilonica per ottenere una dose di ketamina [80 mg/kg di peso corporeo] e xylazina [4.8 mg/kg peso corporeo]miscela).</li>
		<li>Applicare una goccia di soluzione farmacologica per la dilatazione delle pupille (vedi Tabella deimateriali) ad ogni occhio per dilatare le pupille del topo immediatamente dopo l'anestesia.</li>
		<li>Valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico dell'aglione dell'arto posteriore. Attendere che il topo sia sufficientemente anetizzato (nessun riflesso del pedale) e le sue pupille siano ampiamente dilatate.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging tomografia a coerenza ottica di vasi ialoidi
	<ol>
<li>Idratare le cornee del topo con lacrime artificiali, e quindi, posizionare il mouse sul palco di posizionamento.</li>
		<li>Contattare delicatamente la cornea del mouse con la lente della sonda OCT. Regolare il mouse e la sonda in modo che la testa del nervo ottico si trova al centro del campo visivo nell'immagine del fondo, per guidare l'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office. NOTA: Per ulteriori dettagli sulla configurazione generale di un sistema di imaging retinico del roditore (vedere Tabella dei materiali) e sulla regolazione della posizione del mouse, fare riferimento a Gong et al.28.</li>
		<li>Regolare la messa a fuoco per ottenere le immagini ottimali dello Strumento di personalizzazione di Office.</li>
		<li>Regolare l'angolo della linea indicata nel software di imaging dello Strumento di personalizzazione di Office (vedere Tabella dei materiali) per rivelare i vasi ialoidi persistenti e, quindi, scattare immagini.</li>
	</ol></li>
	<li>F (in questo modo undus f (in questo stato luoresceina un ngiografia imaging di vasi ialidi
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di fluoresceina: aggiungere 9 mL di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) a 1 mL di soluzione di fluoresceina (concentrazione di scorte: 100 mg/mL). La concentrazione della soluzione di lavoro finale è di 10 mg/mL.</li>
		<li>Intraperitonemente iniettare la soluzione di lavoro della fluoresceina (5 l/g di peso corporeo).</li>
		<li>Idratare la cornea del topo con lacrime artificiali, e quindi, posizionare il mouse sul palco di posizionamento.</li>
		<li>Posizionare la lente del microscopio di imaging retinico Micron IV per creare un contatto diretto con la cornea di topo. Regolare leggermente l'allineamento per posizionare la testa del nervo ottico al centro del campo di visualizzazione.</li>
		<li>Modificare il filtro del microscopio in un canale fluorescente verde.</li>
		<li>Concentrarsi sui vasi ialoidi persistenti per scattare immagini.</li>
		<li>Scattare più immagini dopo 1 min, 3 min, 5 min e 10 min (non più di 10 min) post-iniezione per determinare il miglior punto di tempo (rapporto segnale-sfondo) per osservare i vasi ialoidi. Completare la procedura FFA entro 10 minuti, dopo di che la fluoresceina può diventare troppo diffusa e rendere invisibili i vasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Recupero dei topi dall'anestesia
	<ol>
<li>Dopo le procedure, tenere i topi su una piastra di riscaldamento calda.</li>
		<li>Attendere che i topi siano di nuovo mobili per riportarli alla gabbia del topo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Parte II: Visualizzazione ex vivo di vasi ialoidi
<ol><li>Preparazione di occhi fissi del mouse
	<ol>
<li>Seleziona i topi dell'età giusta. NOTA: i topi neooatali vengono in genere sacrificati al P8 per la dissezione degli iauloidi. Entrambi i sessi sono adatti. I topi mutanti con regressione ialidea ritardata (e i rispettivi controlli WT) possono essere sezionati e analizzati durante l'età adulta.</li>
		<li>Eutanasia i topi per esposizione a CO2.</li>
		<li>Enucleate gli occhi del topo per dissezione smussata.</li>
		<li>Aprire le palpebre larghe con pinze di microchirurgia per consentire l'accesso al bulbo oculare. Posizionare le pinze di microchirurgia curva sotto il globo in orbita per afferrare il nervo ottico senza spremere il bulbo oculare. Tirare delicatamente e rimuovere il bulbo oculare con le pinze.</li>
		<li>In alternativa, sezionare il bulbo oculare utilizzando forbici microchirurgiche per tagliare con attenzione parallelamente al globo dai quattro lati verso la parte posteriore dell'orbita e separando il globo dai tessuti connettivi circostanti.</li>
		<li>Immergere gli occhi nel 4% di paraformaldeide nel buffer PBS per 30 min a temperatura ambiente per la fissazione.</li>
		<li>Trasferire i bulbi oculari fissi nel tampone PBS ghiacciato. NOTA: I bulbi oculari possono essere conservati in PBS a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporamento di vasi ialidi con iniezione di gelatina
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di gelatina del 5%.<ol>
<li>Pesare 50 mg di gelatina.</li>
			<li>Sciogliere la gelatina in 1 mL di acqua distillata.</li>
			<li>Incubare la soluzione di gelatina in un bagno d'acqua a 37 gradi fino a completa dissoluzione. Mantenere la soluzione in acqua a 37 gradi centigradi fino all'uso. NOTA: Un lotto di soluzione più grande può essere preparato e conservato a 4 gradi centigradi. Ogni volta prima dell'uso, la soluzione deve essere riscaldata in bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per ottenere una consistenza chiara.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Al microscopio a dissezione, iniettare 50 -L di soluzione di gelatina nel corpo vitreo al limbo; ripetere l'iniezione 3x in diversi siti per effettuare un totale di quattro iniezioni, distanziate uniformemente intorno al limbo (Figura 2A).</li>
		<li>Incubare i bulbi oculari in un frigorifero a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio per 30 min per solidificare la gelatina iniettata nello spazio vitreo.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione e isolamento dei vasi ialidi NOTA: vedere la figura 2B-E.<ol>
<li>Collocare i bulbi oculari in una teglia Petri contenente PBS per evitare che il tessuto si asciughi. Fare un'incisione con forbici microchirurgiche al limbo e rimuovere la cornea.</li>
		<li>Snip e rimuovere il nervo ottico.</li>
		<li>Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare due coppie di pinze per staccare e scartare gli strati di sclera, choroide e pigmento retitico (RPE) e rimuovere l'iride.</li>
		<li>Con il lato ottico-nervoso della retina rivolto verso l'alto e il lato dell'obiettivo verso il basso, iniettare 50 - L di PBS appena sotto la coppa della retina per consentire l'accumulo del buffer PBS tra il corpo vitreo sovrincone gelatinizzato e la retina.</li>
		<li>Staccare delicatamente e rimuovere la coppa della retina e il corpo ciliario dal corpo vitreo con pinze di microchirurgia.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire la tazza di gelatina contenente il tessuto ialoide immerso in PBS in un vetrino al microscopio</li>
		<li>Capovolgere il resto del tessuto (obiettivo/ialoide) sopra, in modo che il lato dell'obiettivo sia rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Sollevare l'obiettivo e allentare delicatamente il collegamento tra l'obiettivo / TVL e VHP, quindi tagliare l'HA con forbici microchirurgiche per rimuovere l'obiettivo-TVL. Mantenere la parte VHP della coppa ialoide per il supporto piatto.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaggio piatto e colorazione dei vasi ialoidi
	<ol>
<li>Sciacquare delicatamente la tazza ialidea con PBS sul vetrino per rimuovere tutti i detriti di dissezione.</li>
		<li>Assicurarsi che la coppa ialata galleggia sulla diapositiva in una soluzione PBS adeguata.</li>
		<li>Disporre delicatamente e regolare la posizione della coppa ialidea gelatinizzata con pinze microchirurgiche, con il bordo della tazza rivolto verso il basso sul vetrino, per ottenere un aspetto ottimale dopo la fusione.</li>
		<li>Posizionare il vetrino con la tazza ialidea immersa in PBS su uno scaldavezzo a 37 gradi centigradi, attendere che la gelatina si sciolga e lo ialoide si appiattisce e rimuovere il vetrino quando è appena asciutto (non asciugarlo troppo).</li>
		<li>(Facoltativo) Immunostain i vasi ialoidi<ol>
<li>Creare buffer di blocco e penetrazione (ad esempio, 5% di albumin del siero bovino [BSA] e 0,1% Triton X-100 nel buffer PBS). Aggiungere 50 ll l di buffer di blocco su un isolamento ialoide a pallone piatto e incubarlo a temperatura ambiente per 30 min.</li>
			<li>Applicare 50 l di anticorpo primario (ad esempio, CD31) (1:100 diluizione nel buffer di blocco) su un supporto piatto di isolamento ialoide, quindi incubarlo in una scatola bagnata a 4 gradi durante la notte.</li>
			<li>Risciacquare delicatamente 3x, per 5 min ogni volta, con PBS.</li>
			<li>Applicare 50 - L di anticorpo secondario (ad esempio, anticorpo secondario anti-coniglio-Alexa 488, 1:100 diluizione) sul supporto piatto ialidea e incubarlo a temperatura ambiente per 1 h.</li>
			<li>Risciacquare delicatamente 3x, per 5 min ogni volta, con PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio anti-dissolvenza con DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) per macchiare i nuclei nei vasi ialoidi.</li>
		<li>Posizionare delicatamente un coperchio sullo ialoide per completare il supporto piatto.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging e quantificazione di recipienti ialidi a prua
	<ol>
<li>Immagina la colorazione DAPI dei vasi ialidi con un microscopio fluorescente e assicurati che l'HA centrale sia visibile (escludere i campioni senza l'HA).</li>
		<li>Identificare i rami dei vascelli direttamente derivati dall'HA e contare manualmente il numero di rami dei vascelli per la quantificazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizzazione dei vasi ialidi nella sezione trasversale degli occhi
	<ol>
<li>Incorporare bulbi oculari fissi in un composto ottimale di temperatura di taglio in uno stampo di tessuto adatto, quindi congelare gli occhi incorporati sul ghiaccio secco o conservarli in un congelatore a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Utilizzare un microtoma criostato per creare una sezione trasversale degli occhi incorporati in sezioni di spessore di 12 m a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Raccogliere le sezioni trasversali oculari su una temperatura ambiente scorrevole microscopio toccando delicatamente le sezioni di tessuto, che aderiscono al vetrino.</li>
		<li>Asciugare all'aria per disidratare le sezioni di tessuto per 30 min, che possono essere conservati in un congelatore -20 gradi fino a quando non sono pronti per la colorazione.</li>
		<li>Risciacquare la diapositiva 1x con PBS per rimuovere il composto di temperatura di taglio ottimale rimanente sul vetrino.</li>
		<li>(Facoltativo) Immergere lo scivolo in un buffer di fissaggio appropriato (ad esempio, 4% paraformaldeide in PBS) per 15 min a temperatura ambiente per una fissazione aggiuntiva, se necessario.</li>
		<li>Permeabilizzare il tessuto con 0,1% Triton X-100 in PBS per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il tampone di colorazione isoletina-IB4 per la colorazione dei vasi sanguigni.</li>
		<li>Sciogliere e ricostituire la polvere di isoletto-IB4 (500 g) con 50 mL di PBS in un tubo di centrifugazione da 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere lentamente 50 -L di 1 M soluzione CaCl 2, goccia dopo goccia, nella miscela 50 mL di PBS/isolectin-IB4. Questo passaggio deve essere eseguito lentamente per evitare precipitazioni. La concentrazione finale di CaCl2 è di 1 M. Per la colorazione isoletta-IB4 è richiesta la presenza di Ca 2o.</li>
		<li>Applicare 30 l di cuscinetto di colorazione isoletto-IB4 sulle sezioni trasversali dell'occhio sullo scivolo e incubarlo in una scatola bagnata a 4 gradi centigradi durante la notte.</li>
		<li>Risciacquare 3x, per 5 min ogni volta, con PBS.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di supporto di montaggio anti-dissolvenza con DAPI per macchiare i nuclei nelle sezioni.</li>
		<li>Posizionare delicatamente un coperchio sulle sezioni del tessuto per completare il supporto piatto.</li>
		<li>Controllare il tessuto al microscopio per visualizzare la presenza di vasi ialoidi all'interno della coppa per gli occhi.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2+plays+an+important+role+in+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficient+Bmp4+ocular+phenotypes+include+anterior+segment+dysgenesis+with+elevated+intraocular+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure.</a> BMC Genetics. 2, 18(2001).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+Activation+of+Wnt+Signaling+by+Lithium+Normalizes+Retinal+Vasculature+in+a+Murine+Model+of+Familial+Exudative+Vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0132643(2015).</li>
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<li>Riazifar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+Bst%2B%2F-+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche per valutare e caratterizzare i vasi ialidi sono procedure intuitive e necessarie per osservare la regressione dei vasi ialidi nei modelli animali, per consentire studi sui meccanismi alla base della regressione vascolare durante lo sviluppo. Mentre l'imaging retinico in vivo consente l'osservazione longitudinale della regressione ialidea nello stesso animale, l'accesso a un sistema di imaging del reddito dei roditori per OCT e FFA può essere un fattore limitante. Inoltre, l'imaging in vivo nei topi vivi non ...

L'afflusso di sangue nell'occhio è essenziale per garantire il normale sviluppo della retina e dei tessuti oculari circostanti e per dotare una corretta funzione visiva. Ci sono tre letti vascolari nell'occhio: la vascolatura retinica, la choroide e una rete circolatoria embrionale transitoria di vasi ialoidi. Lo sviluppo della vascolatura oculare richiede una coordinazione spaziale e temporale durante l'embriogenesi e la maturazione dei tessuti. Tra i tre letti vascolari, la vascolatura ialoide è il primo sistema funzionale di approvvigionamento del sangue a fornire nutrizione e ossigeno alla lente embrionale appena formata e alla retina in via di sviluppo. I vasi ialoidi regrediscono nello stesso momento in cui le vaslazioni della retina si sviluppano e maturano1. La regressione della vascolatura iatalide è fondamentale per consentire un chiaro percorso visivo per lo sviluppo della funzione visiva; quindi, questo processo di regressione vascolare è importante quanto la crescita della vascolatura retinica. La regressione ialidea alterata può portare a malattie oculari. Inoltre, la regressione dei vasi ialoidi fornisce un sistema modello per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella regolazione della regressione vascolare, che possono avere implicazioni per la regolazione angiogenica anche in altri organi.
La vascolatura ialoide, derivata dall'arteria iataloide (HA), è composta da vasa hyaloidea (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL) e membrana pupillare (PM). Fornisce nutrimento alla retina in via di sviluppo, alla vitrea primaria e alla lente durante lo sviluppo embrionale2. A sorgere dall'HA, VHP si dirama anteriormente attraverso la vetrezia fino alla lente. La TVL coppa la superficie posteriore della capsula lente, e anastomosi al PM, che si collega alle arterie ciliari anteriori, coprendo la superficie anteriore della lente2,3, con conseguente formazione di una rete di vasi nel PM 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5. È interessante notare che non ci sono vene nella vascolatura iatilla, e il sistema fa uso di vene conoidali per realizzare il drenaggio venoso.
Nell'embrione umano, la vascolatura ialoide è quasi completa alla nona settimana di gestazione e inizia a regredire quando compaiono i primi vasi retinici, durante il quarto mese di gestazione2. A partire dall'atrofia del VHP, regressione delle reti capillari del TVL, il PM, e, infine, l'HA avviene successivamente2,3. Nel frattempo, iniziano a formarsi le ritrazioni vitree primarie e il vitreoso secondario, composto dai componenti della matrice extracellulare, comprese le fibre di collagene. Entro il sesto mese di gestazione, il vitreoprimario primario è ridotto a un piccolo canale trasparente che si estende dal disco nervoso ottico all'obiettivo, chiamato canale o canale ialio del Cloquet, e il vitreo secondario diventa il componente principale del segmento posteriore 2 Il nome del sistema , 3. La circolazione ialidea svanisce per lo più a 35-36 settimane di gestazione, poco prima della nascita3.
A differenza degli esseri umani, in cui la vascolatura ialoide è completamente regredita alla nascita, il sistema vascolare ialoide del topo inizia a regredire dopo la nascita. Poiché la retina del topo nasce vasi avascolari e retinici si sviluppano postnatmente, i vasi ialoidi regrediscono contemporaneamente dal giorno postnatale (P) 4 e sono per lo più completamente regrediti da P216 (Figura 1). Il PM scompare prima tra P10 e P12, e il VHP scompare tra P12 e P16, mentre un piccolo numero di cellule TVL e HA rimangono anche a P16, e da P21 il sistema di regressione vascolare ialoide è quasi completo6. Nel frattempo, la vascolatura della retina inizia a svilupparsi dopo la nascita. Lo strato superficiale del plesso vascolare si estende completamente alla retina periferica a P7–P8, lo strato profondo (situato nello strato plexiforme esterno) si sviluppa da P7-P12 e, infine, il plesso intermedio nello strato plexiforme interno si sviluppa tra P12 e P157 . Man mano che la vascolatura retinica si sviluppa, sostituisce gradualmente la funzione di regredire concomitante i vasi ialoidi, fornendo nutrizione e ossigeno all'occhio in via di sviluppo. L'occorrenza postnatale della regressione dei vasi ialoidi nei topi fornisce un modello sperimentale facilmente accessibile per osservare e studiare la vascolatura ialoide, nonché la base molecolare che regola i processi di regressione vascolare sia fisiologici che patologiche8.
Il fallimento della regressione ialoide può essere visto in malattie come il PHPV, che è una rara anomalia congenita dello sviluppo dell'occhio risultante da una regressione non riuscita o incompleta della vascolatura embrionale, vitreos primaria e ialoide9. I meccanismi che regolano il processo di regressione della vascolatura ialoide sono complicati e ampiamente studiati. Una delle principali vie molecolari essenziali per la normale regressione dei vasi ialidi è la via di segnalazione Wnt10, poiché le mutazioni genetiche in questa via che interessano sia il ligando Wnt che i recettori sono state collegate con PHPV nell'uomo9. Studi sperimentali hanno identificato un ligando Wnt, Wnt7b, che è prodotto dai macrofagi intorno ai vasi ialoidi nell'occhio in via di sviluppo per mediare questo processo di regressione. Wnt7b attiva la segnalazione wnt legandosi con i recettori frizzled4 (F-D4)/LRP5 nelle cellule endoteliali adiacenti per avviare l'apoptosi cellulare, portando alla regressione dei vasi ialoidi10. Di conseguenza, i topi carenti di Wnt7bmostrano una persistenza di vasi ischemidi10. Allo stesso modo, un ligando Wnt non convenzionale, Norrin (codificato dal gene Ndp), si lega anche all'F-D4/LRP5 per indurre la regressione del vaso iadilido durante lo sviluppo. Ndpy/-, Lrp5-/-e Fzd4-/- visualizzano tutti la regressione della nave ialoide posticipata, sostenendo un ruolo normativo critico della segnalazione Wnt11,12, 13,14,15,16. Inoltre, un altro corecettore Wnt LRP6 si sovrappone a LRP5 nella loro funzione di modulazione del percorso di segnalazione Wnt nelle cellule endoteliali vascolari ialoidi17. Altri fattori che possono anche contribuire alla regressione ialoide includono il fattore ipossia-inducibile18,19, fattore di crescita endoteliale vascolare20,21, collagene-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225e proteina morfogenetica ossea-426. In questo articolo, utilizziamo i topi Lrp5-/- come modello di vasi ialidi persistenti per dimostrare le tecniche di valutazione e caratterizzazione della vascolatura ialidea attraverso metodi sia in vivo che ex vivo.
La visualizzazione della vascolatura iatloide in vivo ed ex vivo è essenziale per studiare i meccanismi di regressione della nave ialoide. Gli attuali metodi per osservare la vascolatura iataide si concentrano principalmente sulla visualizzazione e l'analisi di VHP e HA, attraverso immagini dello OCT e FFA, sezioni trasversali oculari e il supporto piatto ialoide. Oct e FFA sono potenti strumenti di imaging in vivo, consentendo l'osservazione longitudinale negli animali vivi dopo che hanno aperto gli occhi. Inoltre, il supporto piatto ialoide isolato fornisce la visualizzazione dell'intera vascolatura ialoide e un mezzo per ottenere una quantificazione accurata del numero di navi. Eppure la natura delicata e fragile delle navi ialoidi e le conseguenti difficoltà tecniche del suo isolamento possono averne limitato l'uso nella ricerca oculistica un po'10,17,27. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato della visualizzazione dei vasi ialidi, combinando sia l'imaging della retina viva in vivo che il supporto piatto ialoide isolato ex vivo per migliorare la fattibilità di queste tecniche. Questo protocollo è stato adattato con la modifica e l'espansione da pubblicazioni precedenti sul metodo in vivo di imaging live fundus e OCT28 e sul metodo ex vivo del supporto piatto ialoide isolato11.

<table><tbody><tr><td>AK-Fluor (iniezione di fluoresceina, USP)</td><td>Akorn</td><td>17478-253-10</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>Thermo Fisher</td><td>S2828</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Collirio lacrimale artificiale</td><td>Systane</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock NO: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Ciclopentolato cloridrato e fenilefrina cloridrato collirio</td><td>Cyclomydril</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio di capra IgG (H+L) adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Scheda di riscaldamento</td><td>Lab-Line Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4, 594 coniugato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I21413</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di ketamina cloridrato</td><td>KetaVed</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>Lrp5-/-</td><td>Topi The Jackson Laboratory</td><td>Stock NO. 005823</td><td>Sviluppato da Deltagen Inc., San Mateo, CA</td></tr><tr><td>Micron IV e OCT</td><td>Phoenix Research Labs</td><td>N/A</td><td>Imaging software: InSight</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>discovery v8</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per microchirurgia</td><td>Scanlan International</td><td>4004-05</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microchirurgia</td><td>Scanlan International</td><td>6006-44</td><td></td></tr><tr><td>Composto per temperatura di taglio ottimale</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Composto per temperatura di taglio ottimale</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td>AGR1180</tr><tr><td>Paraformaldeide (16%)</td><td>Elettrone Microscopia&nbsp; Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way stampi per inclusione monouso (stampi per tessuti)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-20</td><td></td></tr><tr><td>Tampone salino tamponato con fosfato (PBS) (10X)</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino di copertura per vetrini</td><td>Premiere</td><td>94-2222-10</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione sterile di xilazina</td><td>Akorn: AnaSed</td><td>NDC: 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione e caratterizzazione delle navi ialoidi nei topi

Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice

Nell'occhio, i vasi ialidi embrionali nutrono la lente e la retina in via di sviluppo e regrediscono quando i vasi retinici si sviluppano. La regressione persistente o fallita dei vasi ialidi può essere osservata in malattie come il vitreo primario iperplastico persistente (PHPV), che porta a un percorso luminoso ostruito e a una compromissione della funzione visiva. Comprendere i meccanismi alla base della regressione dei vasi ialoidi può portare a nuove intuizioni molecolari sul processo di regressione vascolare e a potenziali nuovi modi per gestire le malattie con vasi ialidi persistenti. Qui descriviamo le procedure per l'imaging dello ialoide nei topi vivi con tomografia a coerenza ottica (OCT) e fundus fluorescein angiografia (FFA) e un protocollo tecnico dettagliato di isolamento e ialoide flat-mount ex vivo per l'analisi quantitativa. I topi da knockout 5 (LRP5) correlati al recettore della lipoproteina a bassa densità sono stati utilizzati come modello sperimentale di vasi ialidi persistenti, per illustrare le tecniche. Insieme, queste tecniche possono facilitare una valutazione approfondita dei vasi ialoidi come modello sperimentale di regressione vascolare e studi sul meccanismo dei vasi ialoidi persistenti.

Immagini in vivo di vasi ialidi in topi vivi Figura 3 A rivela viste trasversali delle immagini dello OCT per i tessuti retina e ialoidi nei topi WT e Lrp5-/-di 3 mesi, un modello animale con ipoteride persistente. L'occhio WT mostra l'assenza di tessuto ialoide, mentre l'occhio Lrp5-/-mostra due vasi ialoidi persistenti derivati dalla testa del nervo ottico. Figura 3 B...

Questo protocollo descrive metodi sia in vivo che ex vivo per visualizzare e caratterizzare completamente i vasi ialoidi, un modello di regressione vascolare negli occhi del topo, utilizzando la tomografia a coerenza ottica e l'angiografia fundus fluorescein per l'imaging dal vivo e l'ex vivo isolamento e successivo montaggio piatto di iauide per l'analisi quantitativa.

Valutazione e caratterizzazione delle navi ialoidi nei topi

In the eye, the embryonic hyaloid vessels nourish the developing lens and retina and regress when the retinal vessels develop. Persistent or failed ...

Il nostro protocollo prevede misure sia in vivo che ex vivo per visualizzare e caratterizzare la vascolarizzazione ialoide all'interno dell'occhio come utile modello sperimentale per lo studio della regressione vascolare. Questa tecnica combina sia l'osservazione longitudinale in vivo dei vasi ialoidi nei topi vivi che la visualizzazione ex vivo e la quantificazione accurata di vasi ialoidi interi sezionati. La nostra tecnica fornisce un metodo pratico e fattibile per lo studio della patogenesi e dei meccanismi di base della vascucolatura fetale persistente.Questo metodo fornisce anche informazioni sui meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella regolazione della regressione vascolare oculare che possono essere rilevanti per la ricerca sull'angiogenesi in altri organi. I passaggi di isolamento hyaloid possono essere tecnicamente impegnativi per i principianti. Molta pratica e pazienza aiuteranno a garantire una dissezione di successo.La visualizzazione di questo metodo fornirà informazioni pratiche dettagliate e suggerimenti sulla tecnica che possono aiutare gli spettatori a padroneggiare le competenze in modo più efficiente. Per la tomografia a coerenza ottica o l'imaging OC

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Impara a valutare e caratterizzare i vasi ialoidi nei topi per studiare la regressione vascolare oculare. Questo metodo combina imaging in vivo ed es vivo per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari.

Valutazione e caratterizzazione delle navi ialoidi nei topi

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