Chirurgia del nervo facciale nel modello di ratto per studiare l'inibizione assonale e la rigenerazione
5 maggio 2020
Questo protocollo descrive un approccio riproducibile alla chirurgia del nervo facciale nel modello del ratto, comprese le descrizioni di vari modelli inducibili di lesioni.
Questo protocollo può aiutare gli scienziati a studiare i risultati dopo la lesione del nervo facciale e i metodi per migliorare la rigenerazione in molti parametri diversi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'anatomia del ratto consente un facile accesso al nervo facciale e la sua larga scala ci consente di studiare tutti i modelli di lesioni pertinenti. Le applicazioni di questa tecnica si estendono verso la riabilitazione dei pazienti dopo la lesione del nervo facciale.
Come potenziale rigenerativo il ratto fornisce un modello sperimentale riproducibile e conciso. E questo metodo può fornire informazioni sulle terapie chirurgiche e mediche per la paresi o la paralisi del nervo facciale. Ed è traducibile ad altri modelli di testa e collo o ad altri nervi periferici.
Operare al microscopio usando entrambe le mani può essere impegnativo. Consiglio di esercitarmi usando la versione binoculare al microscopio prima di tentare una dissezione del nervo facciale. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, applicare un unguento agli occhi del topo e radere l'area chirurgica.
Stabilire un metodo per l'identificazione del ratto e posizionare un rotolo di garza sotto il collo. Disinfettare la pelle esposta con tre clorexidina alternata e scrub al 70% di etanolo e posizionare il topo al microscopio stereo. Manipolare l'orecchio ipsilaterale in direzione anteriore-posteriore per determinare la piegatura naturale della pelle postauricolare.
Utilizzare una lama numero 15 per fare un'incisione da due a tre millimetri nella piega postauricolare. La pianificazione e il posizionamento dell'incisione sono i passaggi più critici per garantire un'identificazione affidabile del nervo facciale riducendo al minimo le dimensioni della ferita. Sezionare senza mezzi termini attraverso l'immediata fascia sottocutanea e posizionare un retrattore micro-Weitlaner per migliorare l'esposizione dei tessuti.
Identificare il muscolo digastrico anteriore mentre viaggia in una direzione inferiore a superiore verso il suo inserimento lungo la base del cranio. Stendere delicatamente attraverso la pancia muscolare lungo il punto di inserimento muscolare per rivelare il tendine della pancia digastrica anteriore. Il tendine apparirà come un processo bianco filmoso che emana dal muscolo con un solido inserimento sulla base del cranio.
Dopo l'identificazione del muscolo digastrico anteriore e del tendine, regolare il riavvolgitore Weitlaner per ritrarre ulteriormente la pancia muscolare. La regione esposta è lo spazio tridimensionale in cui si trova il tronco principale del nervo facciale. Sezionare lungo il nervo in una direzione inferiore distally dall'uscita del forame stilomastoide.
Per indurre un modello di lesione da schiacciamento, utilizzare le forcep del gioielliere a superficie liscia per afferrare e comprimere saldamente il nervo applicando una pressione costante e riproducibile per 30 secondi per garantire un'adeguata lesione da schiacciamento. Per una semplice trasezione, afferrare l'epineurium immediato sovrascrivere il nervo con forcep a denti fini e utilizzare microscissori affilati per traslizionare cleanmente il nervo nel punto desiderato con un singolo taglio. Per un modello di gap nervoso, utilizzare pinze regolabili per impostare la lunghezza dello spazio nervoso desiderata per garantire modelli di lesioni simili tra gli animali e trasenare il nervo come appena dimostrato.
Dopo che la lesione sperimentale è stata consegnata, irrigare la ferita con soluzione salina sterile e asciugare il tessuto con garza sterile. prima di chiudere l'incisione cutanea secondo le linee guida istituzionali. Qui, viene mostrata l'imaging dal vivo del tronco principale del nervo facciale con una lesione da schiacciamento di circa due o tre millimetri distale al punto di ramo del primo PES in un ratto Transgenico 1-GFP adulto.
La valutazione del ritorno graduale della fluorescenza a una, due, tre e quattro settimane dopo la lesione può essere utilizzata come marcatore per monitorare la rigenerazione nervosa in questi animali transgenici. L'analisi istomorfometrica può essere usata per ottenere immagini della sezione trasversale della divisione mandibolare marginale permettendo la quantificazione del diametro assonale, della quantità di detriti, della fibra nervosa, della percentuale di nervo e delle misurazioni della densità. È importante regolare frequentemente il posizionamento del riavvolgitore in base alle esigenze per garantire che i nervi anatomici pertinenti siano visibili quando si identifica il nervo facciale.
Seguendo questa procedura i nervi e i muscoli rilevanti possono essere raccolti per l'analisi immunoistochimica per valutare il grado di rigenerazione rispetto ad altri gruppi sperimentali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nello studio dei risultati funzionali dopo la lesione del nervo facciale. Nello specifico, come effettuare il fenomeno della sintasi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un approccio riproducibile alla chirurgia del nervo facciale in un modello ratto, concentrandosi in particolare sui modelli di lesione e sugli esiti rigenerativi. Permette di indagare tecniche chirurgiche e terapie mediche per la riabilitazione delle lesioni del nervo facciale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Medicina Rigenerativa
- Modelli Animali
Sfondo
- Il modello del ratto consente un facile accesso al nervo facciale.
- Questa tecnica chirurgica può aiutare a valutare i metodi di lesione e rigenerazione del nervo.
- Le caratteristiche anatomiche del ratto permettono uno studio dettagliato di diversi modelli di lesione.
Scopo dello studio
- Valutare approcci terapeutici per la paralisi o paresi del nervo facciale.
- Migliorare la comprensione della rigenerazione dopo lesioni del nervo facciale.
- Sviluppare una tecnica chirurgica dettagliata che sia riproducibile tra diversi studi.
Metodi Utilizzati
- Lo studio impiega un modello ratto per l'intervento chirurgico sul nervo facciale.
- Le procedure principali includono una lesione da schiacciamento e una sezione, con passaggi chirurgici specifici descritti per garantire riproducibilità.
- Per il monitoraggio degli esiti di rigenerazione vengono utilizzate imaging in vivo e analisi istomorfometriche.
- Viene sottolineata la dissezione metodica al microscopio, che richiede abilità e preparazione.
Risultati principali
- La corretta visualizzazione e manipolazione del nervo facciale permette di valutare i processi rigenerativi.
- L'analisi mediante imaging a fluorescenza e l'analisi istomorfometrica forniscono misure quantificabili del recupero nervoso.
- La tecnica rivela informazioni importanti sui fenomeni di sinchinesi successivi a lesioni nervose.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un protocollo fondamentale per l'analisi della lesione e rigenerazione del nervo facciale.
- Permette ai ricercatori di esplorare gli esiti funzionali e gli approcci terapeutici nella riabilitazione neurale.
- La metodologia dimostra implicazioni significative per applicazioni più ampie negli studi sui nervi periferici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello di lesione del nervo facciale nel ratto fornisce una piattaforma riproducibile per valutare la rigenerazione e l'inibizione assonale, supportando la validazione degli obiettivi nello sviluppo di terapie neuroregenerative. La sua scalabilità e accessibilità anatomica permettono una valutazione costante dei modelli di lesione e delle risposte rigenerative, facilitando la riduzione del rischio preclinico per candidati neurotrofici o anti-inibitori. Questo modello collega la ricerca scoperta con quella traslazionale offrendo parametri quantificabili di tipo istomorfometrico e funzionale rilevanti per le strategie di riparazione del nervo facciale umano.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi di inibizione assonale e delle vie rigenerative dopo lesioni nervose definite, come schiacciamento, sezione o interruzione con intervallo.
- Valore operativo: Permette la somministrazione costante di reagenti neuroattivi o cellule per valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione delle vie.
- Valore predittivo: La quantificazione istomorfometrica del diametro assonale, della densità delle fibre e della rimozione dei detriti fornisce parametri oggettivi per l'efficacia del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera modelli standardizzati di lesione adatti per lo screening ad alta riproducibilità di composti pro-rigenerativi o antagonisti inibitori.
- Risultati quantitativi: L'immagine in tempo reale di assoni marcati con fluorescenza e l'analisi istomorfometrica permettono un monitoraggio longitudinale e quantificabile della rigenerazione.
- Scalabilità: Il modello ratto consente interventi chirurgici su segmenti nervosi che vanno dall'area intracranica a quella extratemporale, supportando una valutazione multiparametrica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Facilita la valutazione del recupero funzionale e della riduzione della sinchinesi, in linea con gli endpoint clinici nella riabilitazione del nervo facciale.
- Modellizzazione preclinica: Permette la valutazione di manipolazioni centrali o a livello dell'organo effettore e di terapie cellulari in un sistema nervoso periferico rilevante per la malattia.
- Avanzamento basato sul rischio: Tassi di sopravvivenza affidabili e coerenza interspecie supportano decisioni di avanzamento o interruzione prima della traduzione in specie superiori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si integra nei flussi di lavoro di scoperta consentendo la validazione degli obiettivi attraverso lesioni nervose controllate, proseguendo con lo sviluppo di saggi per lo screening di composti e sostenendo la valutazione preclinica di terapie rigenerative mediante misure funzionali e strutturali degli esiti.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi su inibitori e promotori della crescita assonale mediante paradigmi di lesione standardizzati.
- Screening: Fornisce modelli riproducibili di lesione nervosa per valutare gli effetti dei composti sulla cinetica e sulla fedeltà della rigenerazione.
- Analisi: Letture istomorfometriche e basate sulla fluorescenza forniscono dati quantificabili per l'analisi dose-risposta e del legame al bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Collega le metriche di rigenerazione assonale a esiti funzionali come la sinchinesi, sostenendone la rilevanza clinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica riutilizzabile per test iterativi su diverse modalità terapeutiche e punti temporali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla rigenerazione assonica attraverso metriche quantificabili e riproducibili di lesione e rigenerazione.
- Valore operativo: Tecniche chirurgiche standardizzate e protocolli di valutazione postoperatoria migliorano la coerenza tra laboratori e l'affidabilità dei dati.
- Valore strategico: Informa le decisioni iniziali di prosecuzione o interruzione del progetto chiarificando la biologia del bersaglio e riducendo il rischio di insuccesso nei programmi neuro-rigenerativi di fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione corretta per il rischio dei candidati neuro-rigenerativi in base alla modulazione del bersaglio validata in un modello di nervo periferico clinicamente rilevante.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze di microchirurgia e familiarità con la neuroanatomia dei roditori sotto guida stereomicroscopica.
- È dipendente da strumenti specializzati, tra cui retrattori micro-Weitlaner, pinzette da orafo, forbici microchirurgiche e calibri regolabili per l'induzione standardizzata della lesione.
- Necessita di linee reporter transgeniche (ad esempio, Thy1-GFP) o di processamento immunohistochimico per il tracciamento longitudinale degli assoni e per l'analisi istomorfometrica.
- Richiede protocolli di cura postoperatoria per garantire la sopravvivenza del ratto e ridurre al minimo le variabili confondenti nella valutazione della rigenerazione.
- La limitata trasformabilità genetica rispetto ai modelli murini potrebbe limitare l'analisi meccanicistica mediante knockout genico o approcci di sovraespressione.
