Name: Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri la convezione consegna migliorata guidata da MRI per la somministrazione di vettori virali optogenetici nella corteccia del macaco Rhesus. Questo metodo consente un'espressione diffusa e la manipolazione dell'attività neuronale su larga scala.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (AY), dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dalla Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e dall'UCSF Neuroscience Imaging Center. Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development dei National Institutes of Health sotto il premio Numero K12HD073945, il Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e il Center for Neurotechnology (CNT, un National Science Foundation Engineering Research Center sotto Grant EEC-1028725). Ringraziamo Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews per il loro aiuto con gli esperimenti e Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun per l'aiuto tecnico.

Tutte le procedure sono state approvate dall'Università della California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La seguente procedura è stata eseguita utilizzando due macachi rhesus maschi adulti di 8 e 7 anni di età, del peso rispettivamente di 17,5 kg e 16,5 kg (scimmia G e scimmia J).
NOTA: utilizzare tecniche asestetiche standard per tutte le procedure chirurgiche.
1. Imaging di base
<ol><li>Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale sotto isoflurane (la concentrazione è cambiata tra 0 e 5% in base alle esigenze, a seconda dei segni vitali come la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca). Monitorare la temperatura dell'animale, la frequenza cardiaca, la saturazione di ossigeno, le risposte elettrocardiografiche e la pressione parziale finale delle maree di CO2 durante tutta la procedura.</li>
	<li>Posizionare l'animale in un telaio stereotassico compatibile con MR (vedere la Tabella dei Materiali) in cui rimarrà per tutta la procedura. Collegare l'animale a una macchina portatile di isoflurane compatibile con MR e trasportarlo allo scanner MRI (3 T).</li>
	<li>Acquisire il T1 standard (angolo di rilancio - 9o, tempo di ripetizione/eco - 668,6, dimensione della matrice: 192 x 192 x 80, spessore della fetta , 1 mm) e T2 (angolo di rilancio : 130 , tempo di ripetizione/tempo di eco , 52,5, dimensione della matrice, 256 x 256 x 45, spessore della fetta e 1 mm di immagini MR anatomiche) come linea di base riferimento e per la pianificazione chirurgica.</li>
	<li>Recuperare l'animale dall'anestesia e trasportarlo nell'area di alloggiamento degli animali.</li>
	<li>Utilizzare le immagini T1 e T2 acquisite per determinare il posizionamento della craniotomia. La posizione della craniotomia può essere determinata con precisione abbinando l'area corticale di interesse da MR con l'atlante del cervello del macaco (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition). Inoltre, queste immagini di base possono fornire una stima per le posizioni dell'infusione virale. Le regioni corticali di interesse qui dimostrate sono M1 e S1.</li>
</ol>2. Impianto camera compatibile con MR
<ol><li>Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale con monitoraggio anestetico standard come in 1.1.</li>
	<li>Posizionare l'animale nel telaio stereotassico compatibile con MR in cui rimarrà durante l'impianto della camera e la consegna di vettori virali. Collegare l'animale a una macchina isoflurane compatibile con MR portatile.</li>
	<li>Creare un'incisione sagittale a circa 2 cm dalla linea mediana con una lunghezza di circa 5 cm con un bisturi.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto molle sottostante dal cranio utilizzando ascensori (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Creare una craniotomia circolare (di2,5 cm di diametro) per coprire le traiettorie pre-pianificate per le iniezioni utilizzando una trefinene (vedere Tabella dei materiali).<ol>
<li>Abbassare il punto di centratura della trefra oltre il bordo della trefrina. Creare un'indentazione al centro della craniotomia pianificata sufficientemente profonda nel cranio per ancorare la trefrautilizzando utilizzando il punto di centratura regolabile della trefra. Prestare attenzione per evitare di penetrare completamente attraverso la profondità del cranio in quanto ciò potrebbe causare danni al tessuto neurale sottostante.</li>
		<li>Lavare periodicamente l'area con la salina in base alle esigenze per mantenere l'umidità dei tessuti per tutta la craniotomia.</li>
		<li>Una volta che il centro è stato fatto, abbassare la trephine sul cranio e ruotare la trefrade in senso orario e antiorario mentre si applica la pressione verso il basso fino a quando il tappo osseo può essere rimosso con pinze. Prestare attenzione per evitare di danneggiare il tessuto sottostante con la trephine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infilare una sutura fine (taglia 6-0) attraverso la dura al centro della craniotomia e sollevare la dura tirando delicatamente la sutura dalla superficie del cervello creando una tenda al centro della craniotomia.</li>
	<li>Successivamente, forare la dura vicino al centro della tenda utilizzando forbici oftalmiche fini per evitare di danneggiare il cervello. Quindi tagliare la dura dal centro al bordo della craniotomia e continuare lungo il bordo con forbici opfaliche fini.</li>
	<li>Montare la camera cilindrica compatibile cED MR (Figura1; vedere la sezione 4 per le istruzioni di produzione) sul cranio sulla parte superiore della craniotomia per fornire supporto cannula durante l'infusione cED in modo tale che la curvatura della flangia della camera si allinea bene con la curvatura del cranio.</li>
	<li>Fissare gli impianti al cranio utilizzando viti di plastica e acrilico dentale o alcune viti in titanio.</li>
</ol>3. Consegna vettoriale virale
<ol><li>Subito dopo aver impiantato la camera compatibile con MR e inserito nella camera la griglia di iniezione della cannula (Figura1A-B, Figurasupplementare 1 ) , riempire la griglia con riempire le cavità della camera con gelatina asorbente sterile bagnato per mantenere l'umidità del cervello (Figura 1F).</li>
	<li>Coprire la pelle e il cilindro con un incisione antimicrobico sterile per mantenere la sterilità dei cilindri durante il trasporto e le infusioni di MR. Posizionare una capsula di vitamina E per contrassegnare la parte superiore della griglia di iniezione per l'identificazione positiva.</li>
	<li>Mentre l'animale rimane intubato, staccare il tubo endotracheale dal circuito di anestesia e riattaccarlo a una macchina isoflurane compatibile con MR portatile e trasportarlo allo scanner MRI.</li>
	<li>Acquisire immagini T1 (angolo di rilancio - 9o, tempo di ripetizione / eco - 668,6, dimensione della matrice - 192 x 192, spessore della fetta , 1 mm, 80 fette) per calcolare la distanza dalla parte superiore della griglia di iniezione e la superficie corticale. La capsula di vitamina E è chiaramente visibile nelle immagini T1 e deve essere utilizzata come marcatore per la parte superiore della griglia di iniezione (Figura 2A). Utilizzare lo strumento righello del software di imaging MR per misurare la distanza tra la parte superiore della griglia di iniezione e la superficie corticale.</li>
	<li>Acquisire immagini T2 (angolo di capovolgimento - 130 gradi, tempo di ripetizione/eco - 52,5, dimensione della matrice : 256 x 256, spessore della fetta : 1 mm, 45 fette) per determinare le guide cannula ottimali per ogni sito in base al sito mirato di infusione (Figura2B-C). Come accennato in precedenza, la griglia cannula è piena di salina che è meglio visibile nelle immagini T2. Utilizzando il software di imaging MR, scorrere i piani coronali e sagittali per trovare la posizione di destinazione dell'infusione.</li>
	<li>Dopo aver scongelato il vettore virale per alcune ore a temperatura ambiente, mescolare il vettore virale con l'agente di contrasto RM gadoteridol (Rapporto di 250:1; 2mM Gd-DTPA, vedi Tabella dei materiali) con pipetta o vortice miscelazione. NOT:</</c1> La tecnica presentata è stata testata per i vettori AAV con un'espressione di guida DiCKIIa di C1V1 fusa su EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titro: 2,5 x 1012 molecole di virus/mL; vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Caricare il virus misto in un tubo IV ad alta pressione da 0,2 ml (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Stabilire un campo sterile all'esterno dello scanner MR per preparare la linea di infusione virale.</li>
	<li>Utilizzando tubi IV ad alta pressione, collegare una lunga linea di estensione (circa 3-5 metri, a seconda della posizione della pompa di infusione rispetto al foro MR) ad una siringa DA 3 mL compatibile con MR e prime con salina.</li>
	<li>Collegare l'estremità distale della linea di estensione lunga all'estremità prossimale del tubo da 0,2 mL IV caricato con il virus e attaccare la cannula resistente al reflusso con una punta a gradini di 1 mm (Figura 2D; vedi sezione 5 per le istruzioni di produzione della cannula) all'estremità distale di questo assieme con un connettore catetere in stile morsetto (vedere Tabella dei materiali) ( Figura2E).</li>
	<li>Infine, impostare la siringa in una pompa compatibile con MR (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il controller della pompa nella sala di controllo dello scanner in quanto non è compatibile con MR.</li>
	<li>Utilizzando le immagini MR anatomiche di base ottenute in precedenza, selezionare la posizione della griglia di iniezione di cannula e la profondità di inserimento necessarie per raggiungere il sito di infusione bersaglio. Contrassegnare la profondità di inserimento sulla cannula utilizzando un nastro sterile.</li>
	<li>Iniziare l'infusione ad una velocità di 1 l/min e convalidare visivamente il flusso del fluido nella linea di infusione osservando l'espulsione del fluido dalla punta della cannula.</li>
	<li>Inserire manualmente la cannula attraverso la griglia di iniezione alla profondità di destinazione mantenendo il flusso nella linea di infusione, in quanto ciò impedirà al tessuto penetrato di intasare la cannula durante l'inserimento.</li>
	<li>Acquisire immagini ponderate T1 flash veloce (angolo di capovolgimento : 30 gradi, tempo di ripetizione/eco: 3,05, dimensione della matrice: 128 x 128, spessore della fetta, 1 mm, 64 fette) per il monitoraggio online dell'infusione di vettori virali.</li>
	<li>Dopo aver infuso 10 l del vettore in modo tale da un numero sufficiente di virus da rilevare nello scanner MR, ottenere immagini MR per verificare il corretto posizionamento della cannula come evidente dalla diffusione osservata del virus. Se la profondità della cannula inserita non è corretta, regolare la profondità di conseguenza o rimuovere lentamente la cannula e ritentare l'inserimento come in 3.12.</li>
	<li>Monitorare l'infusione tramite la guida di immagini MR online (flash T1 ponderata) e aumentare il tasso di infusione a 5 l/min di 1 l/min di passi ogni pochi minuti (Figura3A).</li>
	<li>Dopo aver infuso circa 40 l del vettore virale, iniziare a ridurre la velocità di infusione di 1 gradini luna/min e fermare l'infusione dopo 50 dollari e lasciare la cannula in posizione per 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere lentamente la cannula dal cervello e passare alla posizione successiva. Ripetere i passaggi da 3.9 a 3.19 per ogni posizione.</li>
	<li>Coprire il cilindro con un drappo sterile alla fine delle iniezioni, prima del trasporto degli animali. Quindi trasportare l'animale di nuovo alla sala operatoria.</li>
	<li>Espiantare la camera compatibile con MR e chiudere l'incisione chirurgica sostituendo il lembo osseo e il muscolo sovrastante e suturando la pelle utilizzando tecniche asettiche standard o sostituire la camera con un cilindro di titanio e dura artificiale (vedi Yazdan-Shahmorad et al. 20169) per la registrazione neurale e la stimolazione.</li>
</ol>4. Produzione di camere compatibili con MR
<ol><li>Fabbricare la griglia di iniezione di cannula in nylon (Figura 1A-B) mediante lavorazione in base alle dimensioni specificate (Figura supplementare 1).</li>
	<li>Stampa 3D del cilindro compatibile con MR in acrylonitrile butadiene titino (plastica ABS0 (Figura 1C-E) (vedere File supplementare 1–3; vedere Tabella dei materiali per stampante e materiali 3D). NOT:</</c5> Un progetto mantiene una griglia di iniezione di cannula fissa all'interno del cilindro compatibile con MR (Figura 1C), mentre un altro consente la rotazione della griglia, estendendo la regione di iniezione (Figura 1D-E).</li>
	<li>Infilare la griglia di iniezione della cannula e toccare la cavità corrispondente della camera compatibile con MR in modo che entrambi i pezzi presentino lo stesso filettatura. NOT:</</c8> È possibile utilizzare qualsiasi tipo di filettatura, a condizione che entrambi i componenti abbiano lo stesso threading.</li>
	<li>Inserire la griglia di iniezione di cannula in nylon avvitandonel foro del cilindro compatibile con MR.</li>
</ol>5. Produzione Cannula resistente al reflusso13
<ol><li>Tagliare un tubo di silice lungo 30 cm con ID 0,32 mm e 0,43 mm OD per il tubo di silice interno (vedi Tabella deimateriali) utilizzando una lama di rasoio.</li>
	<li>Tagliare un tubo di silice lungo 7,5 cm e 5 cm con ID 0,45 mm e 0,76 mm OD per il tubo di silice esterno (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Aderisci al tubo esterno di 7,5 cm al tubo interno di 30 cm con il cianoacrylato in modo che la camera d'aria si estenda per 1 mm oltre il tubo esterno, rendendo il passo resistente al reflusso (Figura 2D). Per garantire che il cianoacrylato non entri all'interno del tubo interno, posizionare il cianoacrylato all'esterno del tubo interno lontano dalla punta della cannula.</li>
	<li>Incollare il tubo di silice lungo 5 cm all'altra estremità del tubo interno per l'attacco al connettore catetere in stile morsetto (vedere il passaggio 3.10).</li>
</ol>

<ol><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li>
<li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li>
<li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839(2018).</li>
<li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys%3B+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li>
<li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li>
<li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided%2C+convection+enhanced+delivery+%28CED%29+of+AAV+vector+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li>
<li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).</li>
<li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li>
<li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li>
<li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li>
<li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li>
</ol>

PNS ha interesse finanziario in Neuralink Corp., una società che sta sviluppando terapie cliniche utilizzando la stimolazione cerebrale.

Qui, descriviamo una tecnica fattibile ed efficiente per ottenere espressione optogenetica su larga scala nella corteccia somatosensoriale e motoria di NHP da CED guidata da MR. L'uso del CED a guida MR presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali di infusione virale nel cervello NHP. Uno di questi vantaggi è la capacità di raggiungere l'espressione su grandi aree con meno infusioni richieste. Ad esempio, con i metodi convenzionali, iniezioni multiple di 1-2 L dell'espressione di rendimento vettoriale ...

L'optogenetica è un potente strumento che consente la manipolazione dell'attività neurale e lo studio delle connessioni di rete nel cervello. L'implementazione di questa tecnica nei primati non umani (NHP) ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione del calcolo neurale su larga scala, cognizione, e il comportamento nel cervello dei primati. Sebbene l'optogenetica sia stata implementata con successo negli NFP negli ultimi anni1,2,3,4,5,6,7, una sfida che ricercatori faccia sta raggiungendo alti livelli di espressione in grandi aree del cervello in questi animali. Qui, stiamo fornendo un approccio efficiente e semplificato per raggiungere alti livelli di espressione optogenetica in vaste aree della corteccia nei macachi. Questa tecnica ha un grande potenziale per migliorare gli studi optogenetici attuali in questi animali in combinazione con la registrazione all'avanguardia8,9 e stimolazione ottica10 tecnologie.
La convezione avanzata Delivery (CED) è un metodo consolidato di consegna di agenti farmacologici e altre grandi molecole, tra cui vettori virali, al sistema nervoso centrale11,12,13. Mentre i metodi di consegna convenzionali comportano infusioni multiple a basso volume distribuite tra piccole regioni del cervello, il CED può ottenere una distribuzione più ampia e uniforme degli agenti con meno infusioni. La convezione (convezione) di fluido sfuso guidato dalla pressione durante l'infusione consente una trasduzione più ampia e uniforme del tessuto bersaglio quando si forniscono vettori virali con CED. In studi recenti, abbiamo dimostrato la trasduzione e la successiva espressione optogenetica di ampie aree del motore primario (M1) e somatosensoriale (S1) cortices9 e talamo14 utilizzando la risonanza magnetica (MR) guidato CED.
Qui, illustreremo l'uso del CED per ottenere l'espressione optogenetica in grandi aree corticali con solo poche iniezioni corticali.

<table><tbody><tr><td>Tubi per flebo ad alta pressione da 0,2 mL</td><td>Smiths Medical Inc., Dublino, OH, USA</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>Diametro interno di 0,32 mm, diametro esterno di 0,43 mm Tubi in silice</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>diametro interno di 0,45 mm, diametro esterno di 0,76 mm Tubi in silice</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, Università della Pennsylvania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS plastica</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>Telo antimicrobico per incisione</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban Telo</td></tr><tr><td>dentale acrilico</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>Agente legante acrilico</td></tr><tr><td>Ascensori</td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Elevatore Langenbeck,</td></tr><tr><td>sutura fine</td> a punta larga <td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Laser per la stimolazione della luce</td><td>Omicron-Laserage, Germania</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR compatibile 3 cc siringa</td><td>Harvard apparato, Holliston, MA, USA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging MR</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR-Compatibile Pompa</td><td>Harvard apparato, Holliston, MA, USA</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico compatibile con la risonanza magnetica</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>Perifix Clamp Connettore per catetere</td><td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Viti in plastica</td><td>Plastica 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>Viti in nylon</td></tr><tr><td>Viti in titanio</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>Viti ossee autofilettanti</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,</td> <td>SKU:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE Stampante 3D</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di vitamina E Pure</td><td>Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina assorbibile sterile umida</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>Gelfoam</td></tr></tbody></table>

convezione consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla corteccia di rhesus macaque sotto la guida di immagini mri online

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Nell'optogenetica dei primati non umani (NHP), infettare grandi aree corticali con vettori virali è spesso un compito difficile e dispendioso in termini di tempo. Qui, dimostriamo l'uso di risonanza magnetica (MR) convezione avanzata consegna (CED) di vettori virali optogenetici in cortici somatosensoriali primari (S1) e motori (M1) di macachi per ottenere un'espressione corticale efficiente e diffusa di canali ionici sensibili alla luce. I vettori virali associati ad adeno (AAV) che codificano l'opsin C1V1 con spostamento rosso sono stati iniettati nella corteccia dei macachi rhesus sotto il CED guidato dalla RM. Tre mesi dopo l'infusione, l'imaging epifluorescente ha confermato ampie regioni di espressione optogenetica (>130 mm2) in M1 e S1 in due macachi. Inoltre, siamo stati in grado di registrare risposte elettrofisiologiche affidabili evocate dalla luce dalle aree che esprimono utilizzando array microelettrocorticografici. L'analisi istologica successiva e l'immunostaining contro il reporter hanno rivelato un'espressione optogenetica diffusa e densa in M1 e S1 corrispondente alla distribuzione indicata dall'imaging epifluorescente. Questa tecnica ci permette di ottenere l'espressione su vaste aree della corteccia entro un periodo di tempo più breve con danni minimi rispetto alle tecniche tradizionali e può essere un approccio ottimale per la consegna virale optogenetica in animali di grandi dimensioni come gli NNP. Questo approccio dimostra un grande potenziale per la manipolazione a livello di rete dei circuiti neurali con specificità di tipo cellulare nei modelli animali evolutivamente vicini agli esseri umani.

Convezione Enhanced Delivery (CED) sotto MRI Guidance
La diffusione del vettore virale è stata monitorata durante l'infusione di CED sotto la guida delle immagini MR online (Figura 3A). In questo studio, S1 e M1 di due scimmie sono stati presi di mira (Figura 3B). I volumi di distribuzione tridimensionali sono stati stimati in un'analisi post-hoc delle ...

Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l'espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

La consegna migliorata della convezione, o CED, di vettori virali optogenetici in primati non umani consentirà ai ricercatori di manipolare l'attività neurale su larga scala per comprendere calcoli e comportamenti neurali complessi. Con il CED possiamo ottenere un'alta espressione optogenetica in vaste regioni del cervello dei primati con poche iniezioni in un breve lasso di tempo rispetto ai metodi tradizionali. La risonanza magnetica o l'impianto a camera compatibile con mr viene eseguito utilizzando la pratica standard negli interventi chirurgici di primati non umani, la procedura è descritta in dettaglio nel protocollo di testo e delineata brevemente in questo video.Dopo la sedazione, il posizionamento e l'incisione iniziale degli animali come descritto nel protocollo di testo, creare una craniotomia circolare per coprire le traiettorie prepianenate per le iniezioni utilizzando una trefina. Creare un'indentazione al centro della craniotomia pianificata sufficientemente profonda nel cranio per ancorare la trefina utilizzando il punto di centraggio regolabile della trefina. Una volta fatto il centro, abbassare la trefina sul cranio e ruotare la trefina in senso orario e antiorario mentre si applica la pressione verso il basso fino a quando il cappuccio osseo non può essere rimosso con le forcep.Dopo aver sollevato la dura come descritto nel protocollo di testo, tagliare la dura dal centro al bordo della craniotomia e continuare lungo il bordo con forbici oftalmiche fini. Montare la camera cilindrica su misura per la consegna compatibile MR sul cranio sopra la craniotomia per fornire supporto alla cannula durante l'infusione in modo che la curvatura della flangia della camera si allinei bene con la curvatura del cranio. Fissare gli impianti al cranio utilizzando viti di plastica e acrilico dentale o alcune viti in titanio.Subito dopo aver impiantato la camera compatibile con MR e aver inserito la griglia di iniezione di cannula nella camera, riempire la griglia con lo 0,9% di soluzione salina per visualizzare le posizioni di iniezione tramite immagini anatomiche MR. Riempire anche le cavità della camera con schiuma di gel assorbibile sterile bagnata per mantenere l'umidità del cervello. Coprire la pelle e il cilindro con un drappo incisa antimicrobico sterile per mantenere la sterilità dei cilindri durante il trasporto e le infusioni mr.Posizionare una capsula di vitamina E per contrassegnare la parte superiore della griglia di iniezione per un'identificazione positiva. Mentre l'animale rimane intubato, staccare il tubo endotracheale dal circuito di anestesia e riattaccarlo a una macchina isoflurana portatile compatibile con MR. Trasportare l'animale allo scanner per risonanza prima della risonanza.Acquisire immagini T1 per calcolare la distanza dalla parte superiore della griglia di iniezione e dalla superficie corticale. La capsula di vitamina E è chiaramente visibile nelle immagini T1 e deve essere utilizzata come marcatore per la parte superiore della griglia di iniezione. Acquisire immagini T2 per determinare le guide cannula ottimali per ogni sito in base al sito di infusione mirato.La griglia di cannula è piena di salina che è meglio visibile nelle immagini T2. Utilizzando il software di imaging MR, scorrere i piani coronali e sagittali per trovare la posizione target dell'infusione. Dopo aver scongelato il vettore virale per alcune ore a temperatura ambiente, mescolare il vettore virale con l'agente di contrasto MR gadoteridol per pipetta o miscelazione del vortice.Caricare il virus misto in tubi IV ad alta pressione da 0,2 millilitri. Utilizzando tubi IV ad alta pressione, collegare una lunga linea di estensione a una siringa da tre millilitri compatibile con MR e prime con soluzione salina. Collegare l'altra estremità del tubo di estensione lungo ai tubi IV da 0,2 millilitri caricati con il virus.Quindi collegare la cannula resistente al reflusso con una punta a gradini di un millilitro all'estremità distale di questo gruppo con un connettore catetere in stile morsetto. Infine, impostare la siringa in una pompa compatibile con MR. Utilizzando le immagini MR anatomiche di base ottenute, selezionare la posizione della griglia di iniezione della cannula e la profondità di inserimento necessarie per raggiungere il sito di infusione target.Contrassegnare la profondità di inserimento sulla cannula utilizzando nastro sterile. Iniziare l'infusione ad una velocità di un microlitro al minuto e convalidare visivamente il flusso del fluido nella linea di infusione osservando l'espulsione del fluido dalla punta della cannula. Inserire manualmente la cannula attraverso la griglia di iniezione alla profondità di destinazione mantenendo il flusso nella linea di infusione in quanto ciò impedirà al tessuto penetrato di intasare la cannula durante l'inserimento.Ora acquisisci immagini veloci ponderate T1 flash per il monitoraggio online dell'infusione vettoriale virale. Dopo aver infuso circa 10 microlitri del vettore in modo tale che un virus sufficiente sia infuso per rilevare nello scanner MR, ottenere immagini MR per verificare il corretto posizionamento della cannula come evidente dalla diffusione osservata del virus. Se la profondità della cannula inserita non è corretta, regolare la profondità di conseguenza o rimuovere lentamente la cannula e reattempt l'inserimento.Monitora l'infusione tramite la guida di immagini MR online. Aumentare la velocità di infusione a cinque microlitri al minuto di un microliter al minuto ogni pochi minuti. È importante aumentare lentamente il tasso di infusione e non superare cinque microlitri al minuto poiché alti tassi di infusione potrebbero causare danni ai tessuti.Dopo aver infondere circa 40 microlitri del vettore virale, iniziare a ridurre la velocità di infusione di un microlitro al minuto. Interrompere l'infusione dopo l'iniezione di circa 50 microlitri. Lasciare la cannula in posizione per dieci minuti.Rimuovere lentamente la cannula dal cervello e spostarsi nella posizione successiva. Coprire il cilindro con un drappo sterile alla fine delle iniezioni prima del trasporto degli animali, quindi trasportare l'animale in sala operatoria. Le analisi istologiche sulle sezioni coronali seriali rivelano un'espressione optogenetica su larga scala intorno ai siti di infusione.Qui è mostrata l'immagine mr coronale di base e la diffusione dell'agente di contrasto dopo l'infusione per la stessa fetta coronale MR. Una sezione di tessuto coronale è mostrata approssimativamente dalla stessa. La colorazione perossidasi riflette l'espressione della proteina fluorescente gialla o reporter EYFP.Si osserva un buon allineamento tra l'area di espressione EYFP, misurata con epifluorescenza superficiale e con colorazione istologica. Questi includono la regione di diffusione vettoriale stimata dalle immagini MR. I punti bianchi indicano i siti di iniezione e l'intera regione nera rappresenta l'area esposta dalla craniotomia.Qui è mostrata un'immagine a basso ingrandimento delle sezioni coronali macchiate con anticorpo anti GFP che mostra l'aspetto laterale mediale dell'espressione YFP nella corteccia somatosensoriale. La punta della freccia nera indica la posizione della traccia di cannula. Il tessuto adiacente è mostrato ad un ingrandimento maggiore per mostrare la distribuzione laminare delle cellule positive YFP.Le regioni densamente popolate delle cellule positive dell'YFP si trovano prevalentemente negli strati da due a tre e da cinque a sei. Un ulteriore allargamento rivela le tipiche cellule piramidali negli strati da due a tre, strato cinque e livello sei. È importante lasciare la cannula in posizione per 10 minuti dopo che il flusso si è interrotto.Ciò garantirà che il virus sia percolato nel tessuto neurale mirato circostante. Il CED è un approccio efficiente per raggiungere livelli di espressione uniformemente elevati in grandi regioni cerebrali nei mammiferi. Ha il potenziale per espandere la nostra comprensione dei circuiti neurali e della connettività.Dopo la trasduzione virale da parte del CED, i successivi esperimenti di stimolazione optogenetica possono essere abbinati a registrazioni elettriche e saggi comportamentali per rivelare la complessa dinamica del circuito all'interno del cervello. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata da Yazdan-Shahmorad e colleghi nel 2018 in cui la modulazione neurale optogenetica è stata utilizzata per indurre cambiamenti di connettività a livello di rete nella corteccia motoria sensoriale.

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui vi presentiamo l'iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Questo protocollo descrive i passaggi e l'analisi dei dati necessari per eseguire con successo la risonanza magnetica funzionale optogenetica (ofMRI). ofMRI è una nuova tecnica che combina la lettura fMRI ad alto campo con la stimolazione optogenetica, consentendo la mappatura specifica del tipo di cellula dei circuiti neurali funzionali e delle loro dinamiche in tutto il cervello vivente.

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Come attualmente implementato, l'optogenetica nei primati non umani richiede l'iniezione di vettori virali nel cervello. Un metodo di iniezione ottimale dovrebbe essere affidabile e, per molte applicazioni, in grado di colpire singoli siti di profondità arbitraria che sono prontamente e inequivocabilmente identificati nell'istologia postmortem. Viene presentato un metodo di iniezione con queste proprietà.

Iniezioni di vettori AAV per l'optogenetica in cervello di primati non umani anestetizzati e svegli

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Viene descritta una nuova tecnica per la somministrazione diffusa di virus adeno-associato che utilizza l'infusione di virus subaracnoideo. Questo metodo non solo garantisce una diffusa trasduzione dei neuroni neocorticali di topo negli strati superficiali, ma si traduce anche in un'espressione selettiva del transgene nei neuroni piramidali di quinto strato, anche quando si utilizza un promotore non selettivo.

Trasduzione diffusa dei neuroni neocorticali di topo mediante iniezione subaracnoidea di AAV2

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Scopri la convezione consegna migliorata guidata da MRI per la somministrazione di vettori virali optogenetici nella corteccia del macaco Rhesus. Questo metodo consente un'espressione diffusa e la manipolazione dell'attività neuronale su larga scala.

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online (Video) | JoVE Journal

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

Esplora altri video