Name: Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come analizzare la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte mediante manipolazione chemogenetica di circuiti specifici. Questo metodo consente di studiare la neurogenesi adulta con precisione e ridurre lo stress negli animali.

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L.J.Q. è stato sostenuto dal National Institute of Mental Health dei National Institutes of Health sotto il Supplemento sulla Diversità R01MH111773 e da una sovvenzione di formazione T32NS007431-20. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a J.S. da NIH (MH111773, AG058160 e NS104530).

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<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
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<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare come la manipolazione di circuiti neurali specifici regola la neurogenesi ippocampale adulta in vivo utilizzando una serie di tecniche di immunoistochimica. Affermare che la regolazione dipendente dall'attività della neurogenesi adulta mediata da specifici circuiti neurali è una tecnica preziosa con un grande potenziale di modifiche per studiare una gamma diversificata di circuiti neurali. Il successo di questi tipi di esperimenti dipende da molteplici fattori tra cui...

La neurogenesi adulta è un processo biologico attraverso il quale nuovi neuroni nascono in un adulto e integrati nelle reti neurali esistenti1. Nell'uomo, questo processo si verifica nel giro dentato (DG) dell'ippocampo, dove nascono circa 1.400 nuove cellule ogni giorno2. Queste cellule risiedono nella parte interna della DG, che ospita una nicchia neurogenica, definita zona subgranulare (SG. Qui, ippocampal adulti cellule staminali neurali (NSC) subiscono un complesso processo di sviluppo per diventare neuroni completamente funzionali che contribuiscono alla regolazione di specifiche funzioni cerebrali, tra cui apprendimento e memoria, regolazione dell'umore, e la risposta allo stress3 ,4,5,6. Per influenzare i comportamenti, le NSC adulte sono altamente regolate da vari stimoli esterni in modo dipendente dall'attività rispondendo a una serie di segnali chimici locali e distale. Questi segnali chimici includono neurotrasmettitori e neuromodulatori e agiscono in modo specifico del circuito da varie regioni del cervello. È importante sottolineare che la convergenza su circuiti di questi segnali chimici sulle NSC consente una regolazione unica e precisa dell'attivazione delle cellule staminali, della differenziazione e delle decisioni sul destino.
Uno dei modi più efficaci per interrogare la regolazione dei circuiti delle NSC adulte in vivo è associare l'analisi dell'immunofluorescenza con manipolazioni a livello di circuito. L'analisi dell'immunofluorescenza delle NSC adulte è una tecnica comunemente utilizzata, in cui gli anticorpi contro specifici marcatori molecolari vengono utilizzati per indicare lo stadio di sviluppo delle NSC adulte. Questi marcatori includono: nestina come una cellula radiale glia e marcatore progenitore precoce, Tbr2 come marcatore progenitore intermedio, e dcx come un marcatore neurone neuroblast e immaturo7. Inoltre, somministrando analoghi di tiofina come BrdU, CidU, Idu ed Edu, le popolazioni cellulari in fase S possono essere etichettate individualmente e visualizzate8,9,10. Combinando questi due approcci, è possibile studiare una vasta gamma di domande che vanno dal modo in cui la proliferazione è regolata in fasi di sviluppo specifiche, al modo in cui i vari segnali influenzano la differenziazione e la neurogenesi della NSC.
Esistono diverse opzioni per manipolare efficacemente i circuiti neurali, tra cui la stimolazione elettrica, l'optogenetica e la chemiogenetica, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi. La stimolazione elettrica comporta un'estesa chirurgia in cui gli elettrodi vengono impiantati in una regione cerebrale specifica che vengono successivamente utilizzati per trasmettere segnali elettrici per modulare una regione cerebrale mirata. Tuttavia, questo approccio manca sia di specificità cellulare che di circuito. L'optogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore attivo alla luce che viene stimolato da un laser emesso attraverso una fibra ottica impiantata, ma richiede ampie manipolazioni, costi generali e interventi chirurgici complessi11. La chemiogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore di design attivato esclusivamente da farmaci di design o DREADD, che vengono successivamente attivati da un ligando specifico e biologicamente inerte noto come clozapina N-ossido (CNO)12 . Il vantaggio di utilizzare dREADD per manipolare i circuiti neurali locali che regolano le NSC adulte sta nella facilità e nelle varie rotte dell'amministrazione CNO. Ciò consente un approccio meno dispendioso in termini di tempo con una gestione ridotta degli animali, facilmente adattabile per studi a lungo termine per modulare i circuiti neurali.
L'approccio descritto in questo protocollo è una raccolta completa di vari protocolli necessari per interrogare con successo la regolazione del circuito della neurogenesi ippocampale adulta che combina sia tecniche di immunofluorescenza che manipolazioni di circuiti usando la chemiogenetica. Il metodo descritto nel seguente protocollo è appropriato per stimolare o inibire uno o più circuiti contemporaneamente in vivo per determinare la loro funzione regolatoria sulla neurogenesi adulta. Questo approccio è meglio utilizzato se la domanda non ha bisogno di un alto grado di risoluzione temporale. Le domande che richiedono un controllo temporale preciso della stimolazione/inibizione ad una certa frequenza, possono essere affrontate meglio utilizzando l'optogenetica13,14. L'approccio qui descritto è facilmente adattabile per studi a lungo termine con una minima manipolazione animale, soprattutto quando lo stress è una delle principali preoccupazioni.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 48 pozzetti</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-etil-2'-deossiuridina (Edu)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>alcool 70% Isopropyl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Nidi Anti-Pollo</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Goat DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo TBR2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: Soluzione di AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (iodio povidone)</td>Acido citrico <td>amazzonico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stock [.1M] Acido citrico (21 g/L di acido citrico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina N-ossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Software confocale (Zen nero)</td><td>Microscopia Zeiss</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (nero)</td>Solfato di rame (II)<td></td></tr><tr><td> Pentaidrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Denville Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task Wipe Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano 0,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>Ago Hamilton 2 pollici</td><td>Hmailton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Siringa 5 &mu; L Modello 75 RN</td><td>Hmailton</td><td>Rif. azienda: 87931</td><td></td></tr><tr><td>Trapano ad alta velocità</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di infusione</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina iniettabile</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>BD Siringhe</td><td></td><td></td>da insulina ultrafini</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotassa per piccoli animali</td><td>KOPF Instruments</td><td>Modello 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo Leica</td><td></td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Microscopia</td><td></td><td></td>Zeiss</tr><tr><td>Nair (Prodotto per la depilazione)</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldaide 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>Plus Vetrino caricato</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Unguento Puralube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack per vetrini 20 unità di</td><td>diapositive Microscopia elettronica Science</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per vetrini</td><td>Microscopia elettronica Scienza</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo per piccoli animali</td><td>K& H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen Punta da 4 mm</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi chirurgico</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tamponata Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico Stock [0,1 M] Citrato trisodico (29,4 g/L citrato trisodico</td> )<td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond Adesivo per tessuti</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying circuit specific regulation of adult hippocampal neural precursor cells

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

La neurogenesi adulta è un processo dinamico mediante il quale le cellule staminali neurali appena attivate (NSC) nella zona subgranulare (SG) del giro dentato (DG) generano nuovi neuroni, che si integrano in un circuito neurale esistente e contribuiscono a specifiche funzioni ippocampali . È importante sottolineare che la neurogenesi adulta è altamente suscettibile agli stimoli ambientali, che consente la regolazione dipendente dall'attività di varie funzioni cognitive. Una vasta gamma di circuiti neurali provenienti da varie regioni del cervello orchestra queste funzioni cognitive complesse. È quindi importante capire come specifici circuiti neurali regolano la neurogenesi adulta. Qui, descriviamo un protocollo per manipolare l'attività del circuito neurale utilizzando il recettore del designer attivato esclusivamente dalla tecnologia dei farmaci di design (DREADDs) che regola le NSC e la progenie neonatale nei roditori. Questo protocollo completo include l'iniezione stereotassica di particelle virali, la stimolazione chemiogenetica di specifici circuiti neurali, la somministrazione analogica della tiofina, l'elaborazione dei tessuti, l'etichettatura dell'immunofluorescenza, l'imaging confocale e l'imaging analisi di varie fasi delle cellule precursori neurali. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate sulle tecniche di recupero degli antigeni utilizzate per visualizzare le NSC e la loro progenie e descrive un modo semplice, ma efficace per modulare i circuiti cerebrali utilizzando clozapina N-ossido (CNO) o acqua potabile contenente CNO e DREADDs-esprimere virus. La forza di questo protocollo sta nella sua adattabilità per studiare una vasta gamma di circuiti neurali che influenzano la neurogenesi adulta derivata dalle NSC.

Seguendo le procedure sperimentali descritte sopra (Figura 1A,B), siamo stati in grado di determinare gli effetti di stimolare le proiezioni delle cellule muschio contralaterali sulla nicchia neurogenica all'interno dell'ippocampo. Utilizzando un virus DREADD stimolante accoppiato con un'etichettatura 5-HT2A Cre-line di cellule muschio dipendente dalla Creci, siamo stati in grado di attivare selettivamente proiezioni eccitatori da cellule muschiate sulla DG contralaterale e ...

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un approccio per l'analisi del comportamento delle cellule staminali/progenitrici neurali adulte in risposta alla manipolazione chemiogenetica di uno specifico circuito neurale locale.

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Questo protocollo può rispondere a come vari circuiti nel cervello regolano la neurogenesi adulta e in particolare come i circuiti neurali stimolanti o inibitori influenzano la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte. Il vantaggio di questa tecnica è che è in grado di indirizzare specificamente i circuiti neurali desiderati, oltre a ridurre la quantità di stress introdotta agli animali. Questo metodo può fornire informazioni su come i diversi circuiti cerebrali regolano la neurogenesi adulta, in particolare su come specifici tipi di cellule che rilasciano determinati neurotrasmettitori regolano la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte.Per iniziare questa procedura, posizionare le sezioni tissutali in PBS e montare da cinque a otto sezioni su uno scivolo caricato positivamente in ordine seriale da anteriore a posteriore. Lasciare asciugare le sezioni tissutali a temperatura ambiente per due o cinque minuti e aderire completamente alle diapositive. Quindi, preparare il buffer di citrato in un contenitore.Riscaldare il tampone di citrato in un forno a microonde per cinque minuti fino a quando la soluzione non bolle. Nel frattempo, posizionare le sezioni m

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Cellule staminali neurali sono stati preparati da ippocampo di adulti non-letargo yearling scoiattoli artici (AGS). Queste cellule staminali neurali può essere espansa attraverso numerosi passaggi, differenziate e mantenuto come un neurone quasi 50:50 alla cultura gliali.

Crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico Cellule Staminali neurali Squirrel

Questo video mostra la procedura per colorare le cellule staminali neurali appena proliferate in sezioni di tessuto cerebrale utilizzando l'incorporazione di EdU, seguita dall'immunofluorescenza per visualizzare proteine specifiche, migliorando la comprensione della dinamica cellulare e della proliferazione.

Colorazione in immunofluorescenza per la visualizzazione di cellule staminali neurali proliferate in sezioni cerebrali di topo

Durante la neurogenesi dell'ippocampo adulto, un insieme distinto di marcatori genetici viene espresso quando una cellula staminale neurale quiescente progredisce in sequenza e si sviluppa in un neurone funzionalmente integrato nel circuito. Utilizzando il recupero dell'antigene indotto dal calore, i tipi di cellule progenitrici che altrimenti sarebbero difficili da rilevare vengono identificati con maggiore efficacia.

Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Qui presentiamo un protocollo che fornisce uno strumento per esaminare i meccanismi di regolazione di geni specifici durante lo sviluppo dell'ippocampo. L'impiego dell'elettroporazione ex utero e della coltura organotipica di fette consente l'up- e down-regolazione dell'espressione di geni di interesse in singole cellule e segue il loro destino durante lo sviluppo.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Questo articolo video illustra un protocollo completo per rilevare e quantificare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta all'interno della stessa sezione di tessuto. Abbiamo elaborato un metodo per superare i limiti dell'immunofluorescenza multipla indiretta che si verificano quando non sono disponibili anticorpi adatti da diverse specie ospiti.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Il cervello canino è un modello valido in cui studiare neurogenesi adulta. Presentato qui sono i protocolli per isolare ed espandere adulti canini dell'ippocampo cellule precursori neurali dal tessuto cerebrale primario.

Isolamento ed espansione di Canine Adult Hippocampal neurali Precursori

La dissezione della crio-sezione consente la preparazione fresca e congelata della più grande nicchia neurogena nel cervello murino per l'analisi quantitativa profonda del proteoma. Il metodo è preciso, efficiente e provoca una minima perturbazione tissutale. Pertanto, è ideale per studiare il microambiente molecolare di questa nicchia, così come altri organi, regioni e specie.

Dissezione crio-sezione della zona subependimale adulta per un'analisi quantitativa accurata e profonda del proteoma

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Qui, descriviamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di cellule staminali riprogrammate chimicamente per ottenere una modulazione neuronale precisa differenziando queste cellule in cellule precursori dopaminergiche, trapiantandole in modelli murini della malattia di Parkinson e valutando i risultati comportamentali ed elettrofisiologici per confermare il successo dell'integrazione e l'efficacia funzionale delle cellule trapiantate.

Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

Scopri come analizzare la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte mediante manipolazione chemogenetica di circuiti specifici. Questo metodo consente di studiare la neurogenesi adulta con precisione e ridurre lo stress negli animali.

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

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