Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

I metodi qui presentati ci permettono di studiare i meccanismi molecolari della migrazione delle cellule immunitarie attraverso le barriere cerebrali nell'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale per la sclerosi multipla. Studiando la permeabilità della barriera emato-encefalica e l'attività matrice-metalloproteasi allo stesso tempo nella correlazione spaziale con l'infiltrazione delle cellule immunitarie nelle sezioni del tessuto cerebrale, possiamo associare con precisione questi eventi neuroinfiammatori ai segni clinici dell'EAE. La manipolazione professionale dei topi masi richiede un allenamento approfondito, nonché il corretto punteggio dei segni clinici dell'EAE.

Pertanto, la dimostrazione visiva è benefica. Iniziare questa procedura con l'anestesia di topi C57-Black/6 che sono stati ospitati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni come descritto nel protocollo di testo. Fissare il topo anestetizzato in una mano e iniettare 30 microlitri di peptide MOG e completare l'emulsione adiuvante di Freund sottocutaneamente in ciascuno dei fianchi della gamba posteriore, in prossimità dei linfonodi inguinali.

Ora, posizionare il topo sulla pancia e iniettare 20 microlitri dell'emulsione mog-peptidica nel tessuto adiposo molle sia a sinistra che a destra nella radice della coda. Inoltre, iniettare una piccola goccia dell'emulsione nel collo del mouse. Iniettare 100 microlitri di soluzione di tossina pertosse intraperitonealmente nel topo.

Tenere la testa del topo sotto il centro del corpo per evitare l'iniezione nell'intestino. Sostituire la dieta di mantenimento alla dieta riproduttiva al fine di fornire ai topi cibo con un contenuto energetico più elevato prima e durante la malattia clinica prevista. Ripetere l'iniezione di tossina pertosse 48 ore dopo il primo trattamento.

Controlla lo stato di salute dei topi EAE ogni mattina dai un'occhiata all'interno delle gabbie. Segna topi EAE ogni pomeriggio. Togliere dalla gabbia ogni singolo topo incluso nell'esperimento EAE e verificare se la coda ha il tonus.

Spostare la coda verso l'alto con un dito. Un topo sano manterrà la coda alta. Se l'EAE clinico è iniziato, il tono della coda sarà più basso, visibile da una graduale caduta della coda.

Alla fine, il topo non sarà in grado di sollevare affatto la coda. Posizionare ogni singolo mouse incluso nell'esperimento EAE sul banco pulito per osservare e documentare il comportamento di camminata. Vedere il testo per i criteri di punteggio per la valutazione della gravità della malattia, che è il punteggio EAE.

Valutare e documentare il peso di ogni mouse incluso nell'esperimento. Per preparare soluzioni stock di dextran, sciogliere 10 milligrammi di tre kilodalton Dextran Texas Red in 500 microlitri di soluzione di cloruro di sodio 0,9% e cinque milligrammi di 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 in 250 microlitri di soluzione di cloruro di sodio 0,9%. Per la soluzione di lavoro dextran, poco prima dell'iniezione, pipetta 55 microlitri di soluzione stock Dextran Alexa Fluor 488 da 10 kilodalton su un pezzo di pellicola di tenuta.

Quindi, aggiungere 55 microlitri di soluzione stock di tre kilodalton Dextran Texas Red. Mescolare e raccogliere 100 microlitri in una siringa fine usa e getta. Quindi, posizionare un mouse anestetizzato nella posizione laterale sul tavolo.

Iniettare per via endovenosa 100 microlitri di traccianti fluorescenti nel mouse prima che il mouse si svegli. Lasciare circolare il tracciante per 15 minuti prima di eseguire la perfusione di topi come descritto nel protocollo di testo. Riempire un contenitore di dewar piatto con ghiaccio secco schiacciato e aggiungere 2-metilbutano fino a quando il liquido raggiunge circa un centimetro sopra la confezione di ghiaccio secco.

Coprire con un coperchio sciolto, come una copertura del secchio di ghiaccio. Dopo aver tagliato la testa del topo perfuso con forbici affilate, rimuovere la pelle e le orecchie usando un set più piccolo di forbici. Sezionare con cura la calotta cranica tagliando dal forame magnum verso la parte anteriore a sinistra e sul lato destro, per consentire l'upfolding della calotta cranica sul cervello.

Quindi, sollevare con cura il cervello intatto dalla base del cranio mentre si tagliano i nervi ottici usando una spatola metallica piatta. Posizionare il cervello su un foglio di alluminio. Tagliare il cervello in tre pezzi posizionando due tagli coronali.

I tre pezzi rappresentano il cervello frontale, il cervello medio e il cervelletto con tronco encefalico. Riempire un Cryomold al primo trimestre con una matrice di taglio a temperatura ottimale. Quindi, posizionare le fette cerebrali nel Cryomold, con il lato anteriore di ogni pezzo cerebrale rivolto verso il basso.

Coprire completamente il tessuto con matrice. Posizionare il Cryomold con il tessuto in orientamento orizzontale nel bagno a 2 metilbutano. Assicurarsi che il tessuto si congeli dal basso verso l'alto entro un minuto evitando di immergere l'intero blocco tissutale nel bagno.

Trasferire il tessuto congelato a meno 80 gradi Celsius per la conservazione. Vedi il protocollo di testo per la preparazione delle sezioni di tessuto congelato. Recupera sezioni di tessuto cerebrale non fisse da sei micron che erano state preparate da topi EAE.

In una cappa aspirante, scongelare le sezioni all'interno della scatola di congelamento della plastica contenente gel di silice nel coperchio per evitare la ritenzione di acqua nel tessuto. Separare due sezioni di tessuto su una diapositiva disegnando linee con una penna che respinge l'acqua. Soluzioni di reazione di centrifugazione per cinque minuti a 13, 300 volte g a temperatura ambiente e pre-calde a 37 gradi Celsius utilizzando un bagno d'acqua.

Quindi, reidratare le sezioni tissutali per cinque minuti a 37 gradi Celsius utilizzando un buffer di reazione 1X. Dopo cinque minuti, versare il tampone di reazione 1X. Aggiungere la soluzione di reazione sulle sezioni tissutali e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius.

Quindi, lavare gli scivoli cinque volte in acqua doppia distillata. Ora, fissare le sezioni per cinque minuti con metanolo ghiacciato a meno 20 gradi Celsius prima di lavarle una volta con PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 1%BSA in PBS alla sezione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, scartare il buffer dalla sezione capovolgendo la diapositiva su un tessuto. Aggiungere un cocktail di anticorpi primari alla sezione e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le sezioni due volte con PBS, aggiungere un cocktail di anticorpi secondari e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS e montare le diapositive con la soluzione di incorporamento. Dopo aver lasciato asciugare le sezioni montate durante la notte a temperatura ambiente, analizzare le sezioni di tessuto macchiato utilizzando un microscopio fluorescente. La gravità della malattia EAE aumenta fino al picco della malattia, che può essere previsto tra i giorni 16 e 20 dopo l'induzione delle EAE.

Al culmine dell'EAE clinico, i topi hanno anche mostrato il peso corporeo più basso, che aumenta in correlazione con il miglioramento delle EAE nella fase di remissione della malattia. Ecco un'immagine rappresentativa del plesso coroideo e del parenchima cerebrale adiacente di un topo C57-Black/6 affetto da EAE. Il topo è stato iniettato per via endovenosa 15 minuti prima di sacrificarsi.

I traccianti si diffondono facilmente attraverso i microvessi fenestrati nello stoma del plesso coroideo, mentre la barriera ematico-encefalica non consente la diffusione dei traccianti circolanti nel parenchima cerebrale, che è quindi privo di qualsiasi segnale fluorescente. Queste immagini mostrano vasi sanguigni rappresentativi che perdono nel cervelletto di un topo C57-Black/6 affetto da EAE. Le punte di freccia indicano traccianti diffusi attraverso i microvessel cerebrali nel parenchima del SNC, suggerendo che la funzione di barriera emato-encefalica è compromessa in questi vasi.

Nel parenchima del SNC, il segnale fluorescente verde e rosso è visibile al di fuori delle pareti dei vasi sanguigni. Il corretto posizionamento sottocutaneo dell'emulsione MOG-CFA è essenziale per montare l'appropriata risposta immunitaria che porta all'EAE. L'iniezione intraperitoneale e intramuscolare deve essere evitata.

Preparare il CFA sotto una cappa aspirante per evitare l'inalazione del Mycobacterium attenuato. Inoltre, evitare l'autointesi con l'emulsione MOG-CFA, in quanto ciò può causare condiloma o persino portare all'EAE in individui geneticamente predisposti. Le cellule immunitarie infiltrazioni cerebrali possono essere isolate dal SNC dei topi affetti da EAE per quantificare i sottoinsiemi di cellule immunitarie infiltrate durante la neuroinfiammazione per citometria del flusso.

La valutazione dell'integrità dell'endoteliale e delle barriere cerebrali gliali può essere tradotta nell'analisi di modelli di topi geneticamente modificati o in modelli di altri disturbi neurologici.