Induzione e caratterizzazione dell'ipertensione polmonare nei topi utilizzando il modello Ipossia/SU5416
3 giugno 2020
Questo protocollo descrive l'induzione dell'ipertensione polmonare (PH) nei topi in base all'esposizione all'ipossia e all'iniezione di un antagonista del recettore VEGF. Gli animali sviluppano PH e ipertensione ventricolare destra (RV) 3 settimane dopo l'avvio del protocollo. Viene presentata anche la caratterizzazione funzionale e morfometrica del modello.
Questo protocollo può essere utilizzato per indurre ipertensione polmonare ed eseguire misurazioni funzionali del ventricolo destro. Il modello di ipossia sugen è facile da implementare e può ricapitolare alcuni dei tratti distintivi dell'ipertensione polmonare entro due o tre settimane dall'induzione. Utilizzando questo modello, possiamo identificare nuovi percorsi coinvolti nello sviluppo della malattia.
Siamo in grado di identificare nuovi obiettivi e testarne il potenziale terapeutico. Prima di iniziare la procedura di induzione, fissare i serbatoi di azoto vicino alla camera ipossia e impostare il regolatore di ossigeno in un punto del 10% di ossigeno. Successivamente, caricare la soluzione SU5416 preparata al momento in una siringa millilitro dotata di un ago calibro 25 e trattenere manualmente il primo animale da iniettare.
Afferrare la pelle per formare una tenda parallela alla colonna vertebrale assicurandosi di afferrare saldamente la parte posteriore della testa per evitare una potenziale lesione da morso da parte del topo. Inserire l'ago per via sottocutanea sul fianco alla piega della pelle sciolta parallela alla pelle e fornire 100 microlitri del contenuto della siringa. Dopo 10 secondi, ritirare l'ago e riportare l'animale nella sua gabbia.
Quando tutti gli animali sono stati iniettati, posizionare i topi in una camera ventilata di ipossia. Per l'esposizione all'ipossia, verificare che le camere siano dotate di un sensore di ossigeno per misurare il livello di ossigeno e aprire le camere per non più di 20 minuti ogni tre giorni per la pulizia e l'aggiunta di cibo e acqua. Ispezionare gli animali ogni giorno alla ricerca di segni di stress e ripetere l'iniezione DI5416 settimanalmente per tre settimane consecutive.
Prima di avviare la procedura di misurazione della pressione, preparare il connettore del tubo Y e utilizzare la modalità manuale per controllare la funzione del ventilatore. Impostare la pressione inspiratoria su meno di un centimetro d'acqua per evitare il barotrauma e impostare la frequenza respiratoria su 110 respiri al minuto. Tagliare un catetere intravascolare calibro 20 per creare un tubo endotracheale e accendere l'unità di controllo del volume di pressione.
Avviare il software di acquisizione dati e posizionare il catetere del volume di pressione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri di PBS in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi calibrare il catetere in base al protocollo del produttore. Posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante e posizionare una sonda rettale per il monitoraggio della temperatura corporea.
Successivamente, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo anestetizzato e radere le aree del collo e del torace. Fissare gli arti del topo con nastro chirurgico e fare un'incisione di un centimetro nella pelle cervicale mediale. Usando un applicatore con punta di cotone, separare senza mezzi termini le ghiandole salivari parotidi e submandibolari per esporre i muscoli sottostanti la trachea.
Tagliare con cura i muscoli per esporre completamente la trachea e utilizzare le forbici per fare una piccola incisione tra le cartilagine tracheali. Inserire il tubo endotracheale preparato e rimuovere la guida metallica del catetere intravascolare. Quindi collegare il catetere al ventilatore e verificare la posizione del tubo tracheale gonfiando manualmente i polmoni.
Fissare la posizione con il nastro adesivo. Per la giusta misurazione della pressione ventricolare, fare un'incisione cutanea di un centimetro sul processo xifoide e sull'addome superiore e iniziare dalla linea mediana distale allo xifoide e muovendosi con cura lateralmente su entrambi i lati, separare la pelle sul torace e sulla parete addominale. Aprendo la cavità addominale, tagliare attentamente il diaframma, facendo attenzione a non ferire il cuore pulsante o i polmoni.
E utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere delicatamente il pericardio. Portare il catetere a pressione vicino al mouse e utilizzare un applicatore con punta di cotone dotato di ago per fare una coltellata nella parte atipica distale del ventricolo destro. Sostituire con cura l'ago con un catetere a pressione, inserendo il catetere di pressione parallelo alla direzione del ventricolo destro con la punta rivolta verso l'arteria polmonare.
Guarda il tracciamento dell'onda di pressione per garantire il corretto posizionamento del catetere. Una volta stabilizzato il segnale di pressione, sospendere le respirazioni e ottenere almeno tre misurazioni. Una volta registrate tutte le misurazioni, riportare accuratamente il catetere al tubo di centrifuga riempito di PBS nel bagno d'acqua.
Qui vengono mostrate curve di pressione rappresentative e un'analisi quantitativa della pressione ventricolare destra alla fine del periodo di osservazione. L'analisi istologica delle arterie polmonari rimodellate dopo l'ipossia più il trattamento SU5416 rivela un aumento dello spessore mediale della parete rispetto agli animali normossici. La colorazione dell'agglutinina germinale di grano per valutare l'ipertrofia cardiomiocita indica che l'ipossia più l'esposizione a SU5416 si traduce in un marcato aumento delle dimensioni dei cardiomiociti e dell'ipertrofia ventricolare destra.
Inoltre, la valutazione morfometrica dell'ipertrofia ventricolare destra mediante misurazione dell'indice di Fulton conferma un aumento dell'ipertrofia ventricolare destra negli animali ipossici. Eseguire le misurazioni funzionali è importante per evitare il sanguinamento perché ciò può influire negativamente sui risultati dello studio. Questo protocollo può anche essere utilizzato per indurre ipertensione polmonare nei ratti con solo lievi modifiche.
In particolare, solo un'iniezione di Sugen nei ratti è sufficiente per indurre l'ipertensione polmonare.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'induzione di ipertensione polmonare (PH) nei topi mediante esposizione all'ipossia e iniezione di un antagonista del recettore del VEGF. Il modello consente la caratterizzazione funzionale e morfometrica dell'ipertensione polmonare e dell'ipertrofia ventricolare destra entro tre settimane.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cardiovascolare
- Patofisiologia
Sfondo
- L'ipertensione polmonare è una condizione grave che interessa il sistema cardiovascolare.
- Comprendere i meccanismi alla base dell'IP può portare all'individuazione di nuovi bersagli terapeutici.
- Il modello Sugen Ipossi è un metodo ampiamente utilizzato per studiare l'IP nei topi.
- Gli antagonisti del recettore del VEGF svolgono un ruolo nello sviluppo dell'IP.
Scopo dello studio
- Indurre ipertensione polmonare in un modello murino controllato.
- Eseguire misurazioni funzionali del ventricolo destro.
- Identificare nuove vie e bersagli terapeutici per l'ipertensione polmonare.
Metodi Utilizzati
- Induzione di ipossia impostando i livelli di ossigeno al 10%.
- Somministrazione di SU5416 per bloccare i recettori del VEGF.
- Monitoraggio della funzione e della morfologia del ventricolo destro.
- Caratterizzazione del modello nel corso di un periodo di tre settimane.
Risultati principali
- Sviluppo di ipertensione polmonare e ipertrofia del ventricolo destro.
- Le misurazioni funzionali indicano cambiamenti significativi nella performance del ventricolo destro.
- Modifiche morfologiche compatibili con ipertensione polmonare osservate.
- Identificazione di potenziali nuovi bersagli terapeutici per il trattamento.
Conclusioni
- Il modello Sugen ipossia riproduce efficacemente l'ipertensione polmonare.
- Questo modello può essere utilizzato per esplorare nuovi percorsi coinvolti nell'HP.
- Studi futuri possono sfruttare questo modello per test terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello murino ipossia/SU5416 fornisce un sistema rapido ed economico per studiare il rimodellamento vascolare e la disfunzione del ventricolo destro nell'ipertensione polmonare, consentendo la validazione precoce di bersagli terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici. La compatibilità con topi wild-type e modificati geneticamente permette l'analisi di percorsi molecolari e la verifica di ipotesi terapeutiche entro un arco temporale di tre settimane. Questo modello collega la biologia della scoperta con la valutazione preclinica, fornendo parametri emodinamici e istologici quantificabili che guidano la selezione del portafoglio e decisioni basate sulla valutazione del rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle vie di segnalazione del VEGF e l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici coinvolti nel rimodellamento vascolare polmonare.
- Valore operativo: Permette uno screening fenotipico rapido di interventi genetici o farmacologici mediante procedure standardizzate di induzione e misurazione.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio biologico modellando i principali aspetti istopatologici dell'ipertensione polmonare di Gruppo 1 nell'uomo, inclusi l'ispessimento della tonaca media e l'ipertrofia del ventricolo destro.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di variabili dipendenti come la pressione del ventricolo destro mediante cateterizzazione e l'indice di Fulton per la valutazione dell'ipertrofia.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni riproducibili e a bassa varianza quando combinato a un'esposizione standardizzata all'ipossia e a somministrazioni settimanali di SU5416.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su modelli wild-type e knockout senza richiedere competenze chirurgiche, supportando campagne ad alta produttività per la validazione di bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per la malattia che imita la fisiopatologia dell'ipertensione polmonare umana, consentendo la valutazione dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Valore operativo: Supporta studi di prevenzione e terapia grazie alla reversibilità del fenotipo al ritorno alla normossia, permettendo disegni sperimentali con periodo di washout e ri-somministrazione.
- Continuità traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica fornendo endpoint funzionali (pressione del ventricolo destro) e strutturali (rimodellamento vascolare, ipertrofia dei cardiomiociti) allineati con biomarcatori clinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, sostenendo l'identificazione precoce del bersaglio, la validazione dei saggi e la riduzione del rischio meccanicistica prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi su vie dipendenti e indipendenti dal VEGF nell'ipertensione polmonare mediante un danno vascolare inducibile e reversibile.
- Screening: Fornisce sistemi biologici pronti per saggi, con induzione standardizzata (10% di ossigeno, SU5416 settimanale) e output quantificabili (pressione del ventricolo destro, indice di Fulton, ispessimento istologico).
- Analisi: Offre letture funzionali di emodinamica e morfometria che permettono il confronto tra gruppi e la stima dell'entità dell'effetto per la priorizzazione degli obiettivi.
- Ricerca traslazionale: Fornisce informazioni meccanicistiche sull'adattamento del ventricolo destro e sul rimodellamento dell'arteria polmonare, supportando decisioni di avanzamento o interruzione allineate ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma fenotipica riutilizzabile per test iterativi di obiettivi in diverse modalità chemogenetiche o farmacologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi modellando la fisiopatologia vascolare e cardiaca rilevante per l'uomo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso tecniche standardizzate di controllo dell'ipossia, del programma di iniezioni e di cateterizzazione pressione-volume.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento nelle fasi avanzate consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati agli obiettivi sulla base della modifica funzionale e strutturale della malattia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'avanzamento adeguato al rischio fornendo dati multiparametrici (pressione, ipertrofia, fibrosi) per una classificazione oggettiva degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione della camera ipossica, nel trattamento del SU5416 e nelle tecniche di cateterizzazione del ventricolo destro.
- Dipende da un controllo preciso dell'ossigeno (10%) e dall'accesso a bombole di azoto per la manutenzione della camera.
- Necessita di procedure standardizzate per la gestione degli animali e dosaggi settimanali per garantire la coerenza del modello tra i diversi gruppi.
- Limitato a una gravità del fenotipo da lieve a moderata, il che potrebbe limitare la modellizzazione delle fasi avanzate della malattia.
- La reversibilità al ritorno alla normossia richiede una progettazione sperimentale accurata negli studi sulle terapie croniche.
