Induzione e caratterizzazione dell'ipertensione polmonare nei topi utilizzando il modello Ipossia/SU5416
June 3rd, 2020
Questo protocollo descrive l'induzione dell'ipertensione polmonare (PH) nei topi in base all'esposizione all'ipossia e all'iniezione di un antagonista del recettore VEGF. Gli animali sviluppano PH e ipertensione ventricolare destra (RV) 3 settimane dopo l'avvio del protocollo. Viene presentata anche la caratterizzazione funzionale e morfometrica del modello.
Questo protocollo può essere utilizzato per indurre ipertensione polmonare ed eseguire misurazioni funzionali del ventricolo destro. Il modello di ipossia sugen è facile da implementare e può ricapitolare alcuni dei tratti distintivi dell'ipertensione polmonare entro due o tre settimane dall'induzione. Utilizzando questo modello, possiamo identificare nuovi percorsi coinvolti nello sviluppo della malattia.
Siamo in grado di identificare nuovi obiettivi e testarne il potenziale terapeutico. Prima di iniziare la procedura di induzione, fissare i serbatoi di azoto vicino alla camera ipossia e impostare il regolatore di ossigeno in un punto del 10% di ossigeno. Successivamente, caricare la soluzione SU5416 preparata al momento in una siringa millilitro dotata di un ago calibro 25 e trattenere manualmente il primo animale da iniettare.
Afferrare la pelle per formare una tenda parallela alla colonna vertebrale assicurandosi di afferrare saldamente la parte posteriore della testa per evitare una potenziale lesione da morso da parte del topo. Inserire l'ago per via sottocutanea sul fianco alla piega della pelle sciolta parallela alla pelle e fornire 100 microlitri del contenuto della siringa. Dopo 10 secondi, ritirare l'ago e riportare l'animale nella sua gabbia.
Quando tutti gli animali sono stati iniettati, posizionare i topi in una camera ventilata di ipossia. Per l'esposizione all'ipossia, verificare che le camere siano dotate di un sensore di ossigeno per misurare il livello di ossigeno e aprire le camere per non più di 20 minuti ogni tre giorni per la pulizia e l'aggiunta di cibo e acqua. Ispezionare gli animali ogni giorno alla ricerca di segni di stress e ripetere l'iniezione DI5416 settimanalmente per tre settimane consecutive.
Prima di avviare la procedura di misurazione della pressione, preparare il connettore del tubo Y e utilizzare la modalità manuale per controllare la funzione del ventilatore. Impostare la pressione inspiratoria su meno di un centimetro d'acqua per evitare il barotrauma e impostare la frequenza respiratoria su 110 respiri al minuto. Tagliare un catetere intravascolare calibro 20 per creare un tubo endotracheale e accendere l'unità di controllo del volume di pressione.
Avviare il software di acquisizione dati e posizionare il catetere del volume di pressione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri di PBS in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi calibrare il catetere in base al protocollo del produttore. Posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante e posizionare una sonda rettale per il monitoraggio della temperatura corporea.
Successivamente, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo anestetizzato e radere le aree del collo e del torace. Fissare gli arti del topo con nastro chirurgico e fare un'incisione di un centimetro nella pelle cervicale mediale. Usando un applicatore con punta di cotone, separare senza mezzi termini le ghiandole salivari parotidi e submandibolari per esporre i muscoli sottostanti la trachea.
Tagliare con cura i muscoli per esporre completamente la trachea e utilizzare le forbici per fare una piccola incisione tra le cartilagine tracheali. Inserire il tubo endotracheale preparato e rimuovere la guida metallica del catetere intravascolare. Quindi collegare il catetere al ventilatore e verificare la posizione del tubo tracheale gonfiando manualmente i polmoni.
Fissare la posizione con il nastro adesivo. Per la giusta misurazione della pressione ventricolare, fare un'incisione cutanea di un centimetro sul processo xifoide e sull'addome superiore e iniziare dalla linea mediana distale allo xifoide e muovendosi con cura lateralmente su entrambi i lati, separare la pelle sul torace e sulla parete addominale. Aprendo la cavità addominale, tagliare attentamente il diaframma, facendo attenzione a non ferire il cuore pulsante o i polmoni.
E utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere delicatamente il pericardio. Portare il catetere a pressione vicino al mouse e utilizzare un applicatore con punta di cotone dotato di ago per fare una coltellata nella parte atipica distale del ventricolo destro. Sostituire con cura l'ago con un catetere a pressione, inserendo il catetere di pressione parallelo alla direzione del ventricolo destro con la punta rivolta verso l'arteria polmonare.
Guarda il tracciamento dell'onda di pressione per garantire il corretto posizionamento del catetere. Una volta stabilizzato il segnale di pressione, sospendere le respirazioni e ottenere almeno tre misurazioni. Una volta registrate tutte le misurazioni, riportare accuratamente il catetere al tubo di centrifuga riempito di PBS nel bagno d'acqua.
Qui vengono mostrate curve di pressione rappresentative e un'analisi quantitativa della pressione ventricolare destra alla fine del periodo di osservazione. L'analisi istologica delle arterie polmonari rimodellate dopo l'ipossia più il trattamento SU5416 rivela un aumento dello spessore mediale della parete rispetto agli animali normossici. La colorazione dell'agglutinina germinale di grano per valutare l'ipertrofia cardiomiocita indica che l'ipossia più l'esposizione a SU5416 si traduce in un marcato aumento delle dimensioni dei cardiomiociti e dell'ipertrofia ventricolare destra.
Inoltre, la valutazione morfometrica dell'ipertrofia ventricolare destra mediante misurazione dell'indice di Fulton conferma un aumento dell'ipertrofia ventricolare destra negli animali ipossici. Eseguire le misurazioni funzionali è importante per evitare il sanguinamento perché ciò può influire negativamente sui risultati dello studio. Questo protocollo può anche essere utilizzato per indurre ipertensione polmonare nei ratti con solo lievi modifiche.
In particolare, solo un'iniezione di Sugen nei ratti è sufficiente per indurre l'ipertensione polmonare.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'induzione dell'ipertensione polmonare (PH) nei topi attraverso l'esposizione all'ipossia e l'iniezione di antagonisti del recettore VEGF. Il modello consente la caratterizzazione funzionale e morfometrica della PH e dell'ipertrofia del ventricolo destro entro tre settimane.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cardiovascolare
- Fisiopatologia
Sfondo
- L'ipertensione polmonare è una condizione grave che colpisce il sistema cardiovascolare.
- Comprendere i meccanismi alla base della PH può portare a nuovi obiettivi terapeutici.
- Il Modello di Ipossia Sugen è un metodo ampiamente utilizzato per studiare la PH nei topi.
- Gli antagonisti del recettore VEGF giocano un ruolo nello sviluppo della PH.
Obiettivo dello studio
- Indurne l'ipertensione polmonare in un modello di topo controllato.
- Eseguire misurazioni funzionali del ventricolo destro.
- Identificare nuovi percorsi e obiettivi terapeutici per la PH.
Metodi utilizzati
- Induzione di ipossia impostando i livelli di ossigeno al 10%.
- Iniezione di SU5416 per bloccare i recettori VEGF.
- Monitoraggio della funzione e della morfologia del ventricolo destro.
- Caratterizzazione del modello in un periodo di tre settimane.
Risultati principali
- Sviluppo di ipertensione polmonare e ipertrofia del ventricolo destro.
- Le misurazioni funzionali indicano cambiamenti significativi nelle prestazioni del ventricolo destro.
- Cambiamenti morfologici coerenti con l'ipertensione polmonare osservati.
- Identificazione di potenziali nuovi obiettivi terapeutici per il trattamento.
Conclusioni
- Il Modello di Ipossia Sugen imita efficacemente l'ipertensione polmonare.
- Questo modello può essere utilizzato per esplorare nuovi percorsi coinvolti nella PH.
- Studi futuri possono sfruttare questo modello per test terapeutici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The hypoxia/SU5416 mouse model provides a rapid, cost-effective system for interrogating vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary hypertension, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with wild-type and genetically modified mice supports pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing within a three-week timeframe. This model bridges discovery biology and preclinical evaluation by delivering quantifiable hemodynamic and histological readouts that inform portfolio triage and risk-adjusted decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF signaling pathways and identification of novel therapeutic targets involved in pulmonary vascular remodeling.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of genetic or pharmacological interventions using standardized induction and measurement procedures.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by modeling key histopathological hallmarks of human Group 1 pulmonary hypertension, including medial wall thickening and right ventricular hypertrophy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable outputs such as right ventricular pressure via catheterization and Fulton index for hypertrophy assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible, low-variance measurements when combined with standardized hypoxia exposure and weekly SU5416 dosing.
- Scalability: Enables platform reuse across wild-type and knockout models without requiring surgical expertise, supporting high-throughput target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system that mimics human pulmonary hypertension pathophysiology, allowing evaluation of target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Supports prevention and therapy studies through reversible phenotype upon normoxia return, enabling washout and rechallenge designs.
- Translational Continuity: Connects early discovery to preclinical validation by delivering functional (RV pressure) and structural (vascular remodeling, cardiomyocyte hypertrophy) endpoints aligned with clinical biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target identification, assay validation, and mechanistic de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of VEGF-dependent and independent pathways in pulmonary hypertension through inducible, reversible vascular injury.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized induction (10% oxygen, weekly SU5416) and quantifiable outputs (RV pressure, Fulton index, histological thickening).
- Analytics: Provides functional hemodynamics and morphometric readouts that allow cross-group comparison and effect size estimation for target prioritization.
- Translational Research: Offers mechanistic insight into right ventricular adaptation and pulmonary artery remodeling, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable phenotypic platform for iterative testing of targets across multiple chemogenetic or pharmacological modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by modeling human-relevant vascular and cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hypoxia control, injection schedule, and pressure/volume catheterization techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of targets based on functional and structural disease modification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering multiparametric data (pressure, hypertrophy, fibrosis) for objective target ranking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic chamber management, SU5416 handling, and right ventricular catheterization techniques.
- Dependent on precise oxygen control (10%) and access to nitrogen tanks for chamber maintenance.
- Necessitates standardized animal handling and weekly dosing to ensure model consistency across cohorts.
- Limited to mild-to-moderate phenotype severity, which may restrict modeling of advanced disease stages.
- Reversibility upon normoxia return requires careful experimental design for chronic therapy studies.
