Name: Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per rilevare e quantificare gli oligosaccaridi fucosilati del latte umano utilizzando biosensori cellulari ingegnerizzati geneticamente. Questa tecnica accelera la ricerca nutrizionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio di Iowa State University. F.E. è stato parzialmente finanziato dal NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cattedra. T.J.M. è stato parzialmente sostenuto da Karen e Denny Vaughn Facoltà Fellowship. Gli autori ringraziano Iowa State University flusso Cytometry Facility e il laboratorio di ricerca metabolomica W.M. Keck per assistenza con fluorescenza e studi di LC-MS.

1. cella condizioni di cultura e induzione
Nota: Negli esperimenti seguenti, vengono utilizzati tre ceppi: e. coli BL21 (DE3) con un vettore vuoto, e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcA14 e pET28:green proteina fluorescente (GFP) ed e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcB14 e pET28:GFP. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo di Luria-Bertani (LB) o media minimi con gli antibiotici adatti. Preparare soluzioni di riserva di 1.000 x kanamicina (50 mg/mL) e carbenicillina (100 mg/mL) in deionizzata (DI) di acqua.
<ol><li>
Preparazione dei terreni
	<ol>
<li>Preparare i supporti LB aggiungendo 25 g di brodo in polvere LB a 1 L di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 20 min sterilizzare. Attendere che la temperatura del fluido LB sterilizzata è inferiore a 60 ° C prima dell'aggiunta di 1 µ l di antibiotico stock ogni 1 mL di LB media.</li>
		<li>Per preparare piatti della libbra, aggiungere 15 g di agar ai media LB prima della sterilizzazione. Attendere che la temperatura di agar LB sterilizzata è sotto i 60 ° C prima dell'aggiunta di antibiotico.</li>
		<li>1.1.3 per le celle di biosensori, preparare o piastre con antibiotici dual, kanamicina e carbenicillina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induttori di carboidrati
	<ol>
<li>Preparare soluzioni di riserva di induttori di carboidrati al molari equivalenti a 20 g/L di lattosio: 29 g/L di 2'-FL e 3-FL. Nota: Ogni 200 µ l di cellule richiederà 20 µ l di 2'-FL o 3-FL.</li>
		<li>Indurre 200 µ l di cellule con 2,0 g/L di concentrazione finale di lattosio o 2,9 g/L di concentrazione finale di 2'-FL/3-FL. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e lasciare che culture crescere durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coltura cellulare
	<ol>
<li>Il giorno prima dell'esperimento del seme 5 mL di LB supplementato con kanamicina e carbenicillina da una colonia batterica fresca, utilizzando una tecnica sterile.</li>
		<li>Incubare tutte le colture a 37 ° C con agitazione e far crescere le colture durante la notte.</li>
		<li>Trasferire 50 µ l della coltura durante la notte in 5 mL di fresca LB/M9 media con kanamicina e carbenicillina. Incubare a 37 ° C con agitazione continua e crescere fino a quando la cultura ha raggiunto la densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,5 – 0,7. In questa fase di Mid-registro, le cellule possono essere indotte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. misurazione della fluorescenza e limiti di rilevazione
<ol><li>
Preparazione delle cellule per citometria a flusso
	<ol>
<li>Trasferire le culture durante la notte per provette da 1,5 mL e centrifugare a 12.500 x g per 1 min.</li>
		<li>Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 500 µ l di soluzione 1x tampone fosfato (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl in acqua deionizzata, pH 7.2) per preparare una sospensione di singola cellula e trasferire la singola cella sospensione in provette da 5 mL flusso cytometry.</li>
		<li>Mantenere le cellule al buio a 4 ° C fino a in esecuzione i campioni su un citometro a flusso. Per risultati ottimali, è necessario analizzare le cellule appena possibile.</li>
		<li>Selezionare 488 nm laser per eccitare la GFP. Raccogliere i livelli di fluorescenza della fluorescina isotiocianato di fluoresceina (FITC) (20.000-40.000 eventi, gated per dispersione avanti e laterali evitare i detriti e cellule aggregate) con un filtro passa-banda di 525/50 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calibrare il biosensore
	<ol>
<li>Per rendere una curva di calibrazione, fare 8 – 10 diluizioni dello standard 2'-FL nel range 0-2.500 mg/L.</li>
		<li>Le cellule di biosensori di 2'-FL (contenente pAfcA e pET28:GFP) della cultura e indurli con le diluizioni standard, come descritto in precedenza nella sezione 1.3. Eseguire tre replicati biologici per ogni diluizione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rilevazione e quantificazione della 2'-FL in un ceppo produttore
<ol><li>
Coltivazione del ceppo produttore
	<ol>
<li>Per rendere minimo media, preparare soluzioni separate di 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato di sodio e 1m tiamina-HCl. sterilizzare le soluzioni usando un filtro da 0,22 µm. Mescolare M9 media brodo in polvere con 1 L di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione M9 a 121 ° C per 15 min. raffreddare la soluzione fino a 50 ° C. Aggiungere MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrato di sodio e tiamina a concentrazioni finali di 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L e 7,5 µ g/L, rispettivamente.</li>
		<li>Avviare una cultura della 2'-FL producendo ceppo, ad es., JM109 gwBC-F2, in 5 mL di LB media e lasciarlo crescere durante la notte a 37 ° C, come descritto in Baumgartner et al.12.</li>
		<li>Sottocultura all'1% come descritto in precedenza punto 1.3.3 in 250 mL dei media minimi preparati al punto 3.1.1. Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale di 10 g/L e incubare la coltura a 37 ° C.</li>
		<li>Quando la cultura raggiunge un OD600 di 0,5 – 0,7, aggiungere isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,5 mM e lattosio a una concentrazione finale di 2 g/L.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C con agitazione continua e lasciare che culture crescere per 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estrazione di 2'-FL
	<ol>
<li>Trasferire le culture durante la notte a provette sterili da 50 mL e centrifugare a 900 x g per 15 min.</li>
		<li>3.2.2 eliminare il surnatante e risospendere il pellet in acqua deionizzata. Ripetere il passaggio di lavare tre volte per rimuovere il lattosio residuo e infine risospendere in 5 mL di acqua deionizzata.</li>
		<li>Per lisare la sospensione cellulare, è necessario utilizzare un sonicatore al 30% di potenza, in 30 s Pulse. Mantenere le cellule sul ghiaccio in ogni momento.</li>
		<li>Centrifugare le cellule lisate per 25 min a 2.000 x g. Eliminare il surnatante, passare attraverso una sterile (ad es., da 0,22 µm) filtrare e conservare a 4 ° C fino all'analisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione con biosensore
	<ol>
<li>Inoculare una cultura di 2'-FL biosensoristica cellule e nella fase Mid-registro, indurre con equivalente lysate delle cellule alle concentrazioni stimate di 2'-FL utilizzato per rendere la curva di taratura come descritto nella sezione 2.2. Eseguire la calibrazione nell'ambiente stesso come il campione da analizzare (ad esempio, lisato cellulare) aggiungendo diluizioni di 2'-FL a controllo (cioè, non produttori) lysate prima di indurre le cellule biosensore filtrata delle cellule.</li>
		<li>Eseguire gli esempi su un citometro a flusso. Generare una curva dose-risposta tracciando l'output di fluorescenza rispetto alla concentrazione di oligosaccaride. Confrontare la risposta degli standard per il lysate delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. selettiva rimozione di lattosio
Nota: Le cellule di biosensori sono sensibili al lattosio ed è auspicabile che il biosensore rilevare selettivamente HMOs su lattosio. Una strategia include lavaggio delle cellule come descritto nella sezione 3.2. Tre altre strategie sono descritte di seguito.
<ol><li>
Trattamento con commerciale purificato β-galattosidasi
	<ol>
<li>Sciogliere il liofilizzato di β-galattosidasi per 1.000 (lattasi FCC) unità/mL, a 1 mM MgCl2 o uso commerciale di β-galattosidasi in soluzione.</li>
		<li>Per determinare la concentrazione ottimale di enzima necessaria, crescere un inoculo di cellule biosensoristica 2'-FL e indurre con 2 g/L lattosio e 2,9 g / L 2'-FL a metà fase di log.</li>
		<li>A 100 culture µ l, aggiungere quantità variabili di β-galattosidasi, fino a 12 unità e lasciare che le colture crescono durante la notte a 37 ° C con agitazione continua.</li>
		<li>Misurare la fluorescenza come descritto nella sezione 2.1 e calcolare le unità ottimale dell'enzima necessario determinando la concentrazione di enzima minimo per raggiungere desiderato attenuazione del segnale.</li>
		<li>A 2'-FL producendo cellule coltivate per 24 h, aggiungere unità ottimale di β-galattosidasi e incubare per una notte a 37 ° C. Procedere con il protocollo per la determinazione del titolo di 2'-FL come descritto nella sezione 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-trattamento con LacZ + ceppo
	<ol>
<li>Avviare una cultura di 25 mL di 2'-FL producendo ceppo e una volta indotta in fase di Mid-registro, incubare la coltura a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Inoculare un e. coli BL21 (DE3) cultura in LB, crescere alla fase di Mid-registro a 37 ° C e aggiungere 50 mL della cultura (2:1) alla cultura 24h.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C per 3 h. procedere con il protocollo per la determinazione del titolo di 2'-FL come descritto nella sezione 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Precipitazione di lattosio con etanolo Nota: Questa sezione è adattata da Matsuki et al.12.<ol>
<li>Avviare una cultura di 25 mL di 2'-FL producendo ceppo e una volta indotta in fase di Mid-registro, incubare a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Aggiungere due volumi di etanolo al 100% alla cultura, agitare bene e incubare a 37 ° C per 4 ore.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione a 900 x g per 15 min. raccogliere il surnatante e incubare per una notte a 4 ° C, che precipita il lattosio.</li>
		<li>Rimuovere il lattosio precipitato passando la soluzione attraverso un filtro di carta (11 µm). Raccogliere il filtrato che rappresenta la cella lysata contenente la 2'-FL, che può essere quantificata dalla seguente sezione 3.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li>
<li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry%3A+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li>
<li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li>
<li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li>
<li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis%3A+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li>
<li>Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+9-Aminopyrene-1%2C4%2C6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li>
<li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+%28Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li>
<li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).</li>
<li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+%28HMOs%29+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li>
<li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2%E2%80%99-fucosyllactose%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939(2016).</li>
<li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Vi presentiamo una strategia ad alta produttività per la rilevazione di specifici del sollevatore di fucosylated gli oligosaccaridi del latte umano. Ciò è stata compiuta con la costruzione di biosensori di cellule intere di genetica e. coli che dopo induzione con specifici glicani rispondere con un segnale fluorescente. Il protocollo inoltre dettagli su come il biosensore può essere utilizzato per rilevare e quantificare HMOs in un metabolicamente derivati dal ceppo batterico.
Il nost...

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) Sono oligosaccaridi lattosio-derivato, solitamente composto da tre a otto monomeri di zucchero. Essi hanno una riduzione del lattosio (Gal-β1, 4-Glc) fine e sono ulteriormente allungate da legami glicosidici (β-1,3 - o β-1,6-) di glucosio (cromatografia gaseoliquido), galattosio (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Inoltre, fucosio (Fuc, α-1,2 - o α-1,3-) o acido sialico (Sia o NeuAc, α-2,3 - o α-2,6-) residui vengono spesso aggiunti1.
Analisi corrente di oligosaccaridi e altri carboidrati sono limitato a velocità effettiva e la portata dalla necessità per spettrometria cromatografico/massa (MS) tecnologia di2,4,3,5, 6 , 7, che può durare circa un'ora per campione, per non parlare della necessità di attrezzature costose, colonne specializzate e agenti derivatizzanti e competenza sul funzionamento di questa apparecchiatura8. Oligosaccaride collegamenti sono particolarmente difficili da determinare, che richiede avanzate MS9,10 o di tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR)11. Rapida ottimizzazione di sintesi di questi oligosaccaridi è così limitato dalla velocità effettiva di questo lento passaggio analitico.
In questo studio, dimostriamo rilevazione sollevatore-specifica del trisaccaride fucosylated basati su lattosio HMOs, concentrandosi su 2'-fucosyllactose (2'-FL) che è il HMO più abbondante nel latte umano, utilizzando un codificato geneticamente Escherichia coli cellule intere biosensore con un limite di rilevazione 4 mg/l. Una caratteristica importante di questo biosensore è la sua capacità di distinguere tra trisaccaridi isomerica. Il principio di progettazione si basa sull'espressione di specifiche fucosidases in e. coli che liberare il lattosio da HMOs, la cui presenza è rilevata da operone lac , che a sua volta genera un segnale fluorescente. Raggiungiamo questo con la costruzione di un sistema di due-plasmide, uno che harboring il fucosidase specifiche del sollevatore e l'altra una proteina reporter fluorescente. Questa piattaforma di biosensore è adatta per high throughput screening di citometria a flusso o lettore di micropiastre. Inoltre dimostriamo l'utilizzo del biosensore nella quantificazione del 2'-FL prodotto da un ceppo derivati dal12. All'interno di questo studio, presentiamo anche tre strategie su rimozione selettiva di lattosio che può causare segnali positivi da biosensore, dato che il ceppo di derivati dal produttore viene coltivato il lattosio.
Presi insieme, i biosensori codificati geneticamente ci permettono di rilevare e quantificare HMOs in maniera sollevatore-specifica, che è difficile anche con cromatografica, MS, o NMR tecniche. Grazie alla sua alta produttività e facilità d'uso, questo metodo dovrebbe avere applicazioni diffuse nell'ingegneria metabolica e la sintesi di HMOs.

<table><tbody><tr><td>2'-fucosillattosio&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41263-94-9</td><td></td></tr><tr><td>3-fucosillattosio&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41312-47-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio, diidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio (D-glucosio), anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD</td><td></td><td>FACSCanto Plus RUO</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Sistema HPLC serie 1100</td></tr><tr><td>Colonna HPLC</td><td>Luna</td><td></td><td>C18 Colonna a fase inversa</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11815024</tr><tr><td>libbra di brodo, mugnaio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lattosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>64044-51-5</td><td></td></tr><tr><td>M9, sali minimi, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>solfato di magnesio, anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Rivelatore SL a trappola selettiva di massa</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di fucosylated human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) sono dei carboidrati complessi componenti del latte materno umano che presentano abbondanti benefici sulla salute infantile. Tuttavia, ottimizzazione della loro sintesi biotecnologica è limitata dalla relativamente bassa velocità effettiva di rilevazione e quantificazione di monosaccaride e collegamenti. Le tecniche convenzionali di analisi glycan includono metodi cromatografici/massa-spettrometria con velocità di trasmissione dell'ordine di centinaia di campioni al giorno senza automazione. Qui, dimostriamo un biosensore batterico geneticamente codificato per la rilevazione di alto-rendimento, specifiche del sollevatore e quantificazione delle strutture fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, che abbiamo raggiunto via eterologa espressione di fucosidases. Come la presenza di lattosio nel latte o in processi biotecnologici potrebbe portare a falsi positivi, dimostriamo anche la riduzione del segnale da lattosio utilizzando diverse strategie. Dovuto l'alta velocità effettiva di questa tecnica, molte condizioni di reazione o bioreattore parametri potrebbero essere analizzati in parallelo in poche ore, consentendo l'ottimizzazione della produzione di HMO.

Abbiamo progettato un biosensore intera cellula specifico a 2'-FL che può essere utilizzato in combinazione con la produzione biotecnologica dell'oligosaccaride. Questo si basa sulla scissione enzimatica specifica di modificare terminali zuccheri generazione di lattosio e quindi l'attivazione dell'operone lac , che conduce all'espressione di una proteina fluorescente reporter sotto un promotore inducibile di lattosio, in proporzione alla quantità di 2'-FL. Per dimostrare la sua s...

Descriviamo qui il rilevamento ad alta velocità e la quantificazione degli oligosaccaridi del latte umano fucosylated (HMOs) utilizzando un biosensore di cellule intere. Inoltre dimostriamo qui, l'adattamento di questa piattaforma nei confronti di ceppi di produzione HMO, concentrandosi sul miglioramento del rapporto segnale-rumore.

Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande chiave coinvolte nella produzione di oligosaccaridi del latte umano. Innanzitutto, quanta parte del prodotto ho? E in secondo luogo, qual è il collegamento specifico dei carboidrati?L'obiettivo è semplificare e accelerare il processo di quantificazione e caratterizzazione di questi oligosaccaridi del latte umano. Questo metodo ha due vantaggi rispetto allo stato attuale dell'arte. In primo luogo, è suscettibile allo screening ad alta produttività.Quindi, potete immaginare di testare migliaia di condizioni diverse o forse anche una libreria di enzimi di sintesi in un giorno usando questa tecnica. Inoltre, utilizza l'esclusiva specificità del substrato che la natura ha evoluto negli enzimi per darci informazioni sul collegamento dei carboidrati di quegli oligosaccaridi. Riteniamo che questo metodo possa migliorare la produzione di oligosaccaridi del latte umano, il che a sua volta può portare a alimenti per lattanti di migliore qualità che imitano più da vicino il latte materno umano e aiutano a colmare il divario tra i bambini allattati al seno e nutriti con alimenti.La discrezione dell'utente è consigliata quando si decide quale metodo utilizzare per la rimozione del lattosio in base al costo, alla velocità effettiva e alla disponibilità delle apparecchiature. Si deve fare attenzione a garantire una rimozione ottimale del lattosio. Il giorno prima dell'esperimento, seme 5 millilitri di mezzo LB integrati con kanamicina e carbenicillina da una colonia batterica fresca utilizzando tecniche sterili.Incubare tutte le culture durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, trasferire 50 microlitri di una coltura notturna in cinque millilitri di supporti LB M9 freschi con kanamicina e carbenicillina. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti continui fino a quando la coltura non ha raggiunto un OD600 tra zero punto cinque e zero punti sette.In primo luogo, trasferire le colture notturne in un punto cinque tubi millilitro e centrifugare a 12.500 volte g per un minuto. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di 1x PBS per preparare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione a cella singola in tubi fax.Utilizzare un citometro a flusso per eccitare la GFP e raccogliere i livelli di fluorescenza FITC come delineato nel protocollo di testo. Per effettuare una curva di calibrazione, effettuare da otto a 10 diluizioni del 2'FL standard nell'intervallo compreso tra zero e 2500 milligrammi per litro. Culturare le cellule di biorilevamento 2'FL e indurle con le diluizioni standard delineate nel protocollo di testo.Inizia una cultura di un ceppo di produzione 2'FL in cinque millilitri di supporti LB e coltivalo durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, sottocultura all'1% in 250 millilitri di mezzi minimi preparati e aggiungere glicerolo a una concentrazione finale di 10 grammi per litro. Incubare a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la coltura e OD600 tra zero punto cinque e zero punti sette.Quindi aggiungere IPTG a una concentrazione finale di zero punti cinque millimolare e lattosio a una concentrazione finale di due grammi per litro. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento continuo per 24 ore. Il giorno successivo, trasferire la coltura notturna su tubi sterili da 50 millilitri e centrifugare a 900 volte g per 15 minuti.Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in acqua deionizzata. Ripetere questo lavaggio tre volte per rimuovere eventuali lattosio residuo. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di acqua deionizzata.Posizionare le cellule sul ghiaccio e utilizzare un sonicatore al 30% di potenza in impulsi di 30 secondi per lisciviare la sospensione cellulare. Centrifugare le cellule liti a 2.000 volte g per 25 minuti. Rimuovere il supernatante e passarlo attraverso un filtro sterile.Conservare il supernatante filtrato a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'analisi. Successivamente, inoculare una coltura di cellule di biorilevamento 2'FL. Nella fase di registro intermedio, indurre le cellule con il llysato cellulare a concentrazioni equivalenti a quelle di quei 2'FL utilizzati per effettuare la curva di taratura.Eseguire la calibrazione come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, eseguire i campioni su un citometro a flusso. Generare una curva di risposta alla dose tracciando l'uscita di fluorescenza rispetto alla concentrazione di oligosaccaride e confrontare la risposta degli standard con il lisato cellulare.In primo luogo, sciogliere fl alfalyzed beta galattosidasi a 1.000 unità per millilitro in un cloruro di magnesio millimolare. Per determinare la concentrazione ottimale di enzima necessaria, far crescere un inoculo di cellule di biorilevamento 2'FL e nella fase di registro intermedio, indurre con lattosio e 2'FL. A 100 colture di microliteri, aggiungere quantità variabili di beta galattosidasi fino a 12 unità.Lascia che le culture crescano durante la notte a 37 gradi Celsius con continui scuotimenti. Misurare la fluorescenza descritta nel protocollo di testo e calcolare le unità ottimali di enzima necessarie determinando la concentrazione minima enzimatica per ottenere l'attenuazione del segnale desiderata. A 2'FL cellule produttrici coltivate per 24 ore aggiungere le unità ottimali di beta galattosidasi e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius, determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza.Per prima cosa, inizia una coltura da 25 millilitri di un ceppo di produzione 2'FL. Una volta che il ceppo è indotto nella fase di log medio, incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, inoculare una cultura E.coli BL21 nei media LB.Coltivalo fino alla fase di registro intermedio a 37 gradi Celsius, quindi aggiungi 15 millilitri di questa cultura alla cultura 2'FL di 24 ore. Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi, determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza.Per iniziare, inizia una coltura di 25 millilitri di un ceppo di produzione 2'FL. Una volta che il ceppo è indotto nella fase a metà log, incubare la coltura a 37 gradi celsius per 24 ore. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% alla coltura e agitare bene.Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Quindi, centrifugare la sospensione a 900 volte g per 15 minuti. Raccogliere il supernatante e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius per far precipitare il lattosio.Passare la soluzione attraverso la carta da filtro per rimuovere il lattosio precipitato. Raccogliere il filtrato che contiene il lisato cellulare e determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza. In questo studio, viene utilizzata una strategia ad alta produttività per il rilevamento specifico del collegamento di oligosaccaridi di latte umano fucosilati.Ciò si ottiene costruendo bio-sensori interi a cellule dall'ingegneria genetica E.Coli che, al momento dell'induzione con glicani specifici, rispondono con un segnale fluorescente. Il segnale fluorescente in diverse condizioni di induzione, come analizzato su un citometro di flusso, mostra un aumento di 100 volte della fluorescenza con il biosensore 2'FL rispetto al controllo solo vettoriale o al biosensore per 3'FL. Questo mostra l'elevata specificità di collegamento del biosensore.La sensibilità del saggio può essere determinata generando una curva di risposta alla dose con vari livelli di carboidrati. La gamma lineare dinamica di rilevamento 2'FL, è considerata compresa tra 40 e 400 milligrammi per litro e il limite di rilevamento è di quattro milligrammi per litro. Questo saggio può essere effettuato nel corso di una giornata lavorativa come si vede nelle misurazioni a scatto della dinamica dell'espressione del reporter.Le cellule di biorilevamento possono essere utilizzate per rilevare e quantificare 2'FL da un ceppo di produzione 2'FL ingegnerizzato utilizzando una serie di strategie per ridurre il segnale dal lattosio esogeno in modo che il segnale letto corrisponda direttamente alla concentrazione di 2'FL. Una strategia è quella di degradare enzimaticamente il lattosio usando una beta galattosidasi che non agisce sul lattosio modificato. Un'altra strategia ha utilizzato l'etanolo che non solo precipita selettivamente il lattosio, ma lelysisce anche le cellule produttrici poiché lalisi delle cellule è un passo verso il basso necessario.Infine, il metodo più efficace ma dispendioso in termini di tempo è quello di pelletare e lavare le cellule prima dellalisi cellulare per rilasciare il 2'FL intracellulare. Una volta stabilito questo metodo, siamo stati in grado di espandere il repertorio di bersagli di oligosaccaridi usando diversi enzimi. Attualmente, possiamo rilevare nove diversi oligosaccaridi e stiamo lavorando su di più.Durante l'ottimizzazione di questo saggio, abbiamo notato che la robustezza dei nostri enzimi ci ha permesso di trovare una tecnica che dà un collegamento specifico letto in circa cinque minuti. Sebbene nessuno dei reagenti qui utilizzati sia particolarmente pericoloso, coloro che utilizzano questo metodo dovrebbero seguire procedure standard di biohazard e biocontenimento, incluso l'uso di DPI adeguati.

analysis-fucosylated-human-milk-trisaccharides-biotechnological

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Si inizia con una coltura di biosensori batterici sospesa in un mezzo.Questi batteri ingegnerizzati producono un fattore di trascrizione che, unendosi a uno specifico metabolita fecale, attiva un promotore associato a un gene reporter fluorescente.A questa coltura, aggiungi un campione di feci umane filtrato contenente metaboliti, come il lattato, coinvolti nelle interazioni ospite-microbioma.Diluire questa miscela con un mezzo fresco per mantenere un volume di reazione ottimale.Incubare senza...

Rilevamento dei metaboliti fecali umani tramite un biosensore batterico

Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

Presentiamo un metodo modulare automatizzato ad alto rendimento per l'identificazione e la caratterizzazione di esopolisaccaridi microbici su piccola scala. Questo metodo combina una rapida preselezione per analizzare la quantità totale di polisaccaridi secreti con un'impronta digitale dettagliata dei carboidrati per consentire lo screening rapido di ceppi batterici appena isolati o di intere collezioni di ceppi.

Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.

Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

In precedenza era stato sviluppato un sistema per l'analisi automatizzata e rapida dei glicani sulle proteine. Questo articolo presenta il protocollo per l'"analisi glico-qualitativa", ottimizzato per un ampio spettro di utenti, come quelli impegnati nell'analisi delle strutture dei glicani nei biofarmaci e in altri materiali glicoconiugati.

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Studi recenti evidenziano il ruolo degli enzimi del microbiota intestinale umano nella metabolizzazione dei glicosidi C. Qui, presentiamo una metodologia completa che integra tecniche di chimica analitica (LC-MS/MS e NMR) con approcci di biologia strutturale per caratterizzare sistematicamente le catene di reazione strutturali ed enzimatiche di questi enzimi che metabolizzano il glicoside C.

Approcci di Biologia Strutturale e Chimica Analitica per la Caratterizzazione degli Enzimi Metabolici C-Glicosidici nel Microbiota Intestinale Umano

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Scopri un metodo ad alto rendimento per rilevare e quantificare gli oligosaccaridi fucosilati del latte umano utilizzando biosensori cellulari ingegnerizzati geneticamente. Questa tecnica accelera la ricerca nutrizionale.

Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Esplora altri video