Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Questo protocollo delinea una semplice preparazione per l'imaging AFM di vescicole extracellulari in forme idratate e essiccate, la loro immobilizzazione elettrostatica, la scansione superficiale, l'identificazione vescicale e l'analisi e l'interpretazione dei dati. Il vantaggio principale di questa tecnica è la comoda fissazione elettrostatica delle vescicole sulla superficie della pelle e l'analisi post-imaging per tenere conto della distorsione della forma causata dall'immobilizzazione. I risultati ottenuti per il dimensionamento delle vescicole sono coerenti con il Gold Standard CryoTEM Imaging che rimane una tecnica costosa e impegnativa.

Se sei un nuovo utente AFM, inizia con la caratterizzazione dei campioni secchi prima di procedere ai campioni idratati. Perché ci sono numerosi fattori aggiuntivi che possono influire sull'acquisizione idratata del campione. Per iniziare, isolare le vescicole extracellulari da un bio-fluido come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento.

Successivamente, collegare saldamente un disco di mica a un disco di campione magnetico in acciaio inossidabile. Scindere il disco di mica utilizzando un rasoio affilato per esporre un nuovo strato di materiale. A temperatura ambiente, trattare la superficie superiore della mica per dieci secondi con cento micro litri di una soluzione di cloruro di nichel II da dieci millimolari.

Ciò modifica la carica della superficie da negativa a positiva. Cancellare la soluzione di cloruro di nichel II con una salvietta priva di pelucchi o carta assorbente. Quindi, lavare la superficie della mica tre volte con acqua deionizzata e asciugarla con un flusso di azoto secco.

Posizionare il disco campione AFM con la mica modificata della superficie attaccata in una piastra di Petri. Successivamente, diluire gli esosomi con PBS per ottenere una concentrazione tra quattro e quaranta miliardi di particelle per millilitro di soluzione. Convalidare la concentrazione di particelle diluite utilizzando l'analisi di tracciamento delle nano particelle.

Formare una goccia di sessile sulla superficie della mica svuotando un centinaio di microlitri della soluzione esosoma diluita da una pipetta. Quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e sigillare con pellicola di parafene per ridurre l'evaporazione del campione. Incubare in frigorifero per dodici ore.

Dopo l'incubazione, aspirare attentamente dall'80 al 90% del campione senza disturbare la superficie. A questo punto, gli esosomi saranno elettrostaticamente immobilizzati sul substrato di mica. Quando si imaging campioni idratati, sciacquare la superficie tre volte con PBS.

Fare attenzione a mantenere il campione idratato durante tutto il processo di risciacquo. Dopo aver lavato la superficie della mica con PBS, rimuovere dall'80 al 90% del liquido e pipettare quaranta microlitri di PBS fresco per coprire il campione. Il campione idratato è pronto per l'imaging.

Quando si imaging l'EV essiccato, rimuovere i sali dalla superficie risciacquando il substrato tre volte con acqua deionizzata. Dopo aver aspirato il maggior liquido possibile, senza toccare la superficie, asciugare il resto con un flusso di azoto secco. Per visualizzare le vescicole extracellulari essiccate, selezionare un cantilever progettato per la scansione nell'aria in modalità di maschiatura e imaging senza contatto e montarlo sul supporto della sonda.

Posizionare il campione sullo stadio AFM. Il disco magnetico in acciaio inossidabile immobilizzerà il campione sul palco. Posizionare il supporto della sonda nell'AFM.

Lasciare il tempo alla preparazione e allo stadio di equilibrare termicamente. Utilizzare la modalità di maschiatura per scansionare un'area rastered 5x5 micron in 512 linee ad una velocità di scansione di un hertz. Acquisisci sia le immagini di altezza che di fase in quanto forniscono informazioni gratuite sulla topografia e sulle proprietà superficiali del campione.

Il tempo di scansione aumenterà con un'area con immagini e il numero di righe selezionate per formare l'immagine, ma diminuirà con la velocità di scansione. Poiché i tassi di scansione rapidi possono influire sulla qualità dell'immagine, la velocità di rastering dovrebbe essere un equilibrio tra il tempo di acquisizione e la qualità dell'immagine. Per visualizzare vescicole idratate, selezionare un sbalzino appropriato per la scansione di campioni morbidi e idratati e montare il sbalzino su un supporto per sonda progettato per la scansione in liquidi.

Bagnare la punta della sbalziera con PBS per ridurre la probabilità di introdurre bolle d'aria nel liquido durante la scansione. Quindi, immobilizzare il campione sullo stadio AFM. Una volta che il campione si equilibra termicamente, immagini la superficie della mica idratata in modalità di maschiatura.

Acquisisci sia le immagini di altezza che di fase. Per analizzare le immagini scattate, passare prima alle modalità SPM selezionate del processo dati, seguite da Suggerimento', quindi scegliere Suggerimento modello'Selezionare la geometria e le dimensioni della punta utilizzata per scansionare il campione e fare clic su OK'Correggere gli artefatti di erosione della punta eseguendo la ricostruzione della superficie. Aprire l'immagine.

Scegliere Processo dati dal menu,quindi Selezionare Modalità SPM'seguito da Suggerimento', quindi Scegliere Ricostruzione superficie', quindi fare clic su OK'Avanti, selezionare Processo dati, seguito da Livello' e scegliere Livello piano'per allineare il piano di imaging e abbinare il piano XY di laboratorio rimuovendo l'inclinazione nel substrato dai dati di scansione. Allineare le righe dell'immagine selezionando Processo dati'seguito da Dati corretti', quindi scegliere Allinea righe'Sono disponibili diverse opzioni di allineamento, inclusa la mediana, o che è un algoritmo che trova un'altezza media di ogni riga di scansione e la sottrae dai dati. Passare quindi a Processo dati'seguito da Dati corretti' e scegliere Rimuovi cicatrici'Rimuoverà gli errori di scansione comuni noti come Cicatrici'Per allineare la superficie mica all'altezza zero, passare al menu Processo dati' e selezionare Appiattisci base'nel menu a discesa Livello'.

Identificare le vescicole cellulari aggiuntive sulla superficie scansionata andando al menu Grani e utilizzando Mark by Threshold'Questo algoritmo identifica gli esosomi immobilizzati in superficie come particelle che sporgono dal substrato di superficie zero per l'altezza al di sopra della soglia selezionata dall'utente. Selezionare una soglia compresa tra uno e tre nanometri. Ciò eliminerà la maggior parte delle interferenze sul retro.

Infine, eseguire la caratterizzazione geometrica e dimensionale delle vescicole identificate utilizzando gli algoritmi di distribuzione disponibili accessibili dal menu Dei grani. Esportare i dati AFM da Gwyddion per l'analisi specializzata da parte di altri strumenti computazionali e programmi per computer personalizzati. La modifica della superficie del cloruro di nichel si traduce in un'immobilizzazione di vescicole cellulari extra che dipendono dal tempo.

La concentrazione superficiale delle vescicole immobilizzate è eccessivamente densa dopo 24 ore di incubazione, mentre l'incubazione di 12 ore porta a meno esosomi e dati di scansione più facili da analizzare con precisione. Questa immagine AFM mostra esosomi MCF7 idratati immobilizzati elettrostaticamente sulla superficie della mica modificata. La corrispondente immagine di fase AFM conferma che i grani nell'immagine di altezza sono nanoparticelle morbide come ci si dovrebbe aspettare per le vescicole di membrana.

I dati di altezza per tre vescicole lungo la stessa linea sono mostrati qui. Questi profili illustrano una forma appiattita causata dall'attrazione elettrostatica degli esosomi sulla superficie di carica positiva della mica modificata. La distorsione della forma è evidente in una vista ingrandita della vescicola immobilizzata e della sua sezione trasversale.

Per stimare la dimensione globulare degli esosomi nella soluzione, on può corrispondere ai volumi racchiusi da involucri di membrana immobilizzati superficiali e sferici. La distribuzione delle dimensioni delle vescicole globulari nella soluzione è stata determinata dai dati AFM di 561 vescicole immobilizzate. Le dimensioni delle vesciche nelle immagini CryoTEM sono coerenti con i risultati AFM.

Prima di imaging degli esosomi irdrati, è importante ricordare di risciacquare accuratamente la superficie con PBS. Ciò rimuoverà gli esosomi in entrata e ne impedirà l'attaccamento alla punta AFM. Quando si imagingno gli esosomi essiccati, assicurarsi di utilizzare l'acqua DI per aumentare il substrato.

Il lavaggio DI impedirà la formazione di cristalli di sale sulla superficie mentre il substrato si asciuga. Se presenti, i cristalli di sale renderanno difficile l'elaborazione delle immagini.