Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio
27 marzo 2019
Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.
Questo insieme di protocolli di standardizzazione può essere utilizzato per offrire nuove informazioni sul solco oculare superiore, o SOS, una struttura scoperta di recente dell'occhio in via di sviluppo. Questi protocolli consentiranno a qualsiasi sperimentatore in tutto il mondo di visualizzare chiaramente l'SOS durante lo sviluppo degli occhi zebrafish. Inizia posizionando il fattore di differenziazione della crescita eterozigote sei Zebrafish maschio e femmina su lati separati di un divisore in un serbatoio di acqua declorolato la sera prima del loro accoppiamento.
La mattina successiva, rimuovere il divisore e lasciare che il pesce si riprodutti per non più di 30 minuti. Alla fine del periodo di riproduzione, raccogliere gli embrioni in piastre di Petri contenenti mezzo E3 per la loro incubazione in un incubatore di 28,5 gradi. A 20 ore dalla concimazione, sostituire il supernatante con mezzo E3 integrato 0,004%1-Fenil-2-tiourea per prevenire la produzione di pigmenti ed esaminare gli embrioni con microscopia ottica per confermare che sono tutti nella fase di sviluppo appropriata.
Posizionare i campioni al microscopio di sezionamento. Scartare eventuali embrioni immaturi per lo sviluppo e utilizzare forcep fini per smontare delicatamente i coriaci. Visualizza l'SOS, che può apparire come un'indentazione o una linea al margine dorsale dell'occhio.
Quindi, ordina gli embrioni che mostrano un ritardo di chiusura dell'SOS rispetto a quelli che non lo fanno. Per fotografare questi embrioni utilizzando un microscopio sezionato, preparare una piastra di Petri contenente l'1%di agarosio nel mezzo E3 e pungere leggermente il centro dell'agarosio per creare un buco poco profondo in cui è possibile posizionare il tuorlo dell'embrione. Quindi, posizionare un embrione anestetizzato lateralmente sull'agarosio.
Per identificare gli embrioni utilizzando un microscopio composto o confocale, trasferire un embrione in una piastra di Petri di 35 millimetri contenente un piccolo bolo di agarosio a punti di fusione basso 1% non gelato nel mezzo E3 e utilizzare una lenza fine per posizionare rapidamente l'embrione nella posizione laterale. Quando l'agarosio si è raffreddato, versare abbastanza mezzo E3 nel piatto per coprire l'agarosio e utilizzare una lente obiettivo di immersione in acqua 20x per visualizzare l'SOS. Dopo l'imaging, estrarre delicatamente l'agarosio dall'embrione e fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% o consentire al pesce zebra di continuare il suo sviluppo.
Per visualizzare l'SOS mediante espressione di mRNA fluorescente, utilizzare un apparato di microiniezione per iniettare 300 picogrammi di mRNA GFP-CAX potenziato in embrioni allo stadio di una cellula. Quindi, utilizzare uno stereoscopio fluorescente per schermare gli embrioni con un'espressione GFP migliorata brillante e ottenere immagini degli embrioni con uno dei metodi di imaging come dimostrato. Per la colorazione immunofluorescente a montaggio intero della laminina di zebrafish embrionale, dechorionare gli embrioni come dimostrato e fissare gli embrioni in un tubo di microcentrifugo in paraformaldeide al 4% preparata al momento per due ore su uno shaker a temperatura ambiente.
Al termine della fissazione, lavare gli embrioni quattro volte in PBS più Tween, o PBST, per cinque minuti per lavaggio seguito da permeabilizzazione in 10 microgrammi per millilitro o Proteinasi K a temperatura ambiente per cinque minuti. Lavare gli embrioni permeabili quattro volte in PBST come dimostrato e bloccare gli embrioni nel siero di capra al 5% e due milligrammi per millilitro di albumina di siero bovino in PBST per una o due ore su uno shaker a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione di blocco, incubare gli embrioni nell'anticorpo anti-laminide primario di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker.
La mattina seguente, lavare gli embrioni cinque volte in PBST per 15 minuti per lavaggio ed etichettare i tessuti con un anticorpo secondario appropriato durante la notte a quattro gradi Celsius sullo shaker protetto dalla luce. La mattina seguente, lavare gli embrioni quattro volte in PBST per 15 minuti per lavaggio e posizionare gli embrioni in una piccola piastra di Petri contenente PBST fresco. Usando forcep fini, interrompere delicatamente i tuorli e rimuovere le cellule del tuorlo attraverso un lieve raschiamento delle sacche di tuorlo.
Trasferire gli embrioni deyolked nel 30% di glicerolo appena preparato in PBS, assicurandosi di posizionare gli embrioni sopra la soluzione e trasferendo il meno possibile la soluzione precedente e attendere che gli embrioni affondino sul fondo del tubo. Quando gli embrioni hanno raggiunto il fondo del contenitore, trasferirli al 50% sequenziale e al 70% di glicerolo nelle soluzioni PBS, come appena dimostrato. Dopo che gli embrioni sono affondati sul fondo del contenitore del 70% di glicerolo, trasferire i campioni su un piccolo piatto di plastica per la dissezione e severare gli embrioni posteriori alle hindbraine.
Utilizzando strumenti di dissezione fine, spostare una testa su uno scivolo di vetro con il meno glicerolo possibile e inserire delicatamente un perno di minuzie fine nel ventricolo del probrain dall'interno, spingendo verso il basso per separare le metà destra e sinistra della testa l'una dall'altra. Quando la testa è stata completamente raccordata lungo la linea mediana, montare ogni lato della linea mediana della testa verso il basso, lato oculare verso l'alto. L'SOS è osservabile attraverso il microscopio sezionante a 20-23 ore dopo la fecondazione e attraverso l'imaging a contrasto di interferenza differenziale come una linea sottile nell'occhio dorsale che separa le metà nasali e temporali della retina in via di sviluppo.
Inoltre, una sottile indentazione può essere visibile nel confine dorsale dell'occhio. Dopo la colorazione immunofluorescente della laminina, la linea sottile può essere confermata come membrana basale. Quando la chiusura sos è ritardata, la sua presenza prolungata può essere osservata come una pronunciata fenditura nel lato dorsale dell'occhio sotto un microscopio sezionante.
Se osservata al microscopio composto utilizzando l'imaging a contrasto di interferenza differenziale, questa caratteristica è ancora più prominente con i lati nasale e temporale dell'occhio separati dall'SOS, che è chiaramente visibile come una linea nell'occhio dorsale. Entro 28 ore dalla fecondazione in zebrafish di tipo selvatico, la colorazione laminina dimostra chiaramente che l'SOS è completamente chiuso, rendendolo il palcoscenico ideale per monitorare i ritardi nella chiusura della fessura. L'iniezione di mRNA GFP-CAX potenziato consente la visualizzazione delle membrane cellulari di embrioni vivi o fissi per tracciare i cambiamenti nella morfologia delle cellule che portano alla chiusura sos.
Visualizzare l'SOS può essere difficile, in quanto è stretto e transitorio. Tuttavia, è imperativo mantenere un metodo di punteggio coerente quando si valutano i ritardi di chiusura nei punti di tempo successivi. Queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la corretta formazione e chiusura dell'SOS.
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Panoramica
Questo articolo presenta protocolli standardizzati per l'osservazione del solco oculare superiore (SOS), una struttura recentemente identificata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, le tecniche descritte aiuteranno i ricercatori a identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del SOS durante lo sviluppo oculare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Zebrafish come organismo modello
Sfondo
- Il solco oculare superiore è una struttura evolutivamente conservata.
- Comprendere la sua formazione è fondamentale per ottenere informazioni sullo sviluppo dell'occhio nei vertebrati.
- Il pesce zebra rappresenta un modello efficace per lo studio dello sviluppo embrionale.
- I protocolli standardizzati migliorano la riproducibilità della ricerca.
Scopo dello studio
- Fornire una metodologia chiara per la visualizzazione del SOS.
- Facilitare la ricerca sui fattori che influenzano lo sviluppo del SOS.
- Standardizzare le tecniche per garantire l'accessibilità globale nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Allevamento di zebrafish eterozigoti in un ambiente controllato.
- Incubazione degli embrioni in mezzo E3 per favorire lo sviluppo.
- Utilizzo di 1-fenil-2-tiourea per inibire la produzione di pigmento.
- Impiego della microscopia ottica per confermare lo stadio di sviluppo.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita della SOS durante lo sviluppo dell'occhio del pesce zebra.
- I protocolli permettono un'osservazione costante in diversi studi.
- Acquisizione di informazioni sui processi di sviluppo della SOS.
- I metodi standardizzati possono essere adattati a diverse impostazioni di ricerca.
Conclusioni
- I protocolli stabiliti forniscono una base per futuri studi sul SOS.
- Comprendere il SOS può portare a intuizioni più ampie sull'evoluzione dell'occhio nei vertebrati.
- La standardizzazione favorisce la collaborazione e la riproducibilità nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione di strutture temporanee dello sviluppo, come il solco oculare superiore (SOS), permette una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione precoce dei bersagli, chiarificando i percorsi morfogenetici. Protocolli di imaging standardizzati supportano schermate fenotipiche riproducibili nei modelli di pesce zebra, migliorando l'affidabilità predittiva nei saggi di biologia dello sviluppo. Questo approccio facilita l'identificazione di fattori genetici o farmacologici che influenzano la chiusura della fessura oculare, con rilevanza diretta per la modellizzazione dei disturbi congeniti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di formazione e chiusura della fessura oculare.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale dei geni coinvolti nella dinamica della fessura oculare.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio identificando ritardi nella chiusura della fessura oculare come letture fenotipiche di interruzioni del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante una visualizzazione consistente dello sviluppo somitico a 20–23 hpf.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione del saggio e la riproducibilità attraverso parametri definiti di staging e acquisizione delle immagini.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma in diverse modalità di microscopia, inclusa la microscopia a luce, su composti e confocale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza per le malattie attraverso la modellizzazione della coloboma dell'aspetto superiore nello sviluppo dell'occhio nei vertebrati.
- De-risking Meccanicistico: Descrive una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, collegando i tempi di chiusura di SOS all'integrità della membrana basale della laminina.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette il monitoraggio dei ritardi nella chiusura della fessura come biomarcatori dell'integrità delle vie di sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta che va dalla Fase Iniziale di Scoperta all'Identificazione del Compound Guida, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nello sviluppo dell'occhio nei vertebrati.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica di ipotesi mediante la visualizzazione della fessura della retina (SOS) come un'indentazione dorsale della coppa ottica che separa le metà retiniche nasale e temporale.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso una stadiazione riproducibile dell'embrione e la visualizzazione della SOS mediante contrasto di interferenza differenziale o marcatura fluorescente.
- Analisi: Evidenzia output quantitativi come la persistenza della SOS oltre le 28 hpf come fenotipo misurabile di ritardo utile per screening genetici o farmacologici.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica confermando la chiusura della SOS mediante colorazione per laminina, un marcatore conservato della membrana basale.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per lo studio di strutture oculari vertebrate conservate attraverso diverse specie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella morfogenesi oculare.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della visualizzazione del SOS su diverse piattaforme microscopiche.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nella modellizzazione dei disturbi dello sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate sulla cinetica di chiusura del SOS come biomarcatore fenotipico.
Considerazioni sull'Implementazione
- Competenze scientifiche richieste in embriologia del pesce zebra e tecniche di micromanipolazione.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi microscopi stereoscopici e microscopi ottici con obiettivi a immersione in acqua.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per lo stadio degli embrioni, la valutazione del SOS e i tempi delle sessioni di acquisizione immagini.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, come topo, pollo o tritone, per la visualizzazione conservata del SOS.
- Limitazioni pratiche, tra cui la natura ristretta e transitoria del SOS, che richiede metodi di valutazione coerenti per l'analisi del ritardo nella chiusura.
