Modello di matrice extracellulare tridimensionale dell'osso per Osteosarcoma
April 12th, 2019
Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.
Questo metodo fornisce una strategia efficiente per la preparazione di impalcature funzionali per la ricerca sul tumore osseo. Decellularizzato la matrice extracelonnare ossea, ha mostrato una sierocompatibilità variabile per la sopravvivenza e le attività delle cellule osteosarcoma. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la coltura delle cellule osteosarcoma nella matrice derivata dalle ossa mostra una morfologia altamente eterogenea simile a un'istopatologia clinica dell'osteosarcoma.
Il metodo fornisce un modello ideale per indagare lo sviluppo, la progressione della sensibilità farmacologica dei tumori ossei, come l'osteosarcoma, il sarcoma di Ewing e le altre metastasi maligne dei tumori all'osso. Per iniziare, ottenere topi BALB / c di quattro o sei settimane, dopo aver eutanasiato un topo usando forbici chirurgiche sterili, tagliare fibule fresche, tibia e femore da un arto posteriore. Con l'aiuto di pinzette, staccare il tessuto epiteliale e quindi rimuovere il più possibile il tessuto molle.
Risciacquare le ossa delle gambe con una soluzione PBS sterile da 10 mM due volte per rimuovere il sangue in un piatto di sei centimetri. Immergere le ossa in un piatto con 75%etanolo per tre minuti, quindi risciacquare con PBS due volte. Conservare le ossa pulite in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri con tubo PBS sterile a 80 gradi Celsius.
Scongelare le ossa congelate a temperatura ambiente e poi congelare di nuovo a 80 gradi Celsius per un'ora. Sottoposere le ossa a più di due cicli di congelamento-disgelo per la lisi cellulare e la rottura dei tessuti. Quindi, posizionare le ossa in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri riempito con HCl normale 0,5 e incubare durante la notte a temperatura ambiente su uno shaker orbitale con tremori delicati per garantire una copertura completa e uniforme delle ossa.
Dopo la decalcificazione, decantare completamente la soluzione di acido cloridrico e sciacquare le ossa sotto l'acqua corrente per un'ora. Quindi, utilizzare acqua distillata per lavare le ossa due volte per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale. Decantare completamente la soluzione.
Per estrarre i lipidi in ossa demineralizzate, posizionare le ossa in un tubo di centrifuga da 50 millilitri con una miscela 1:1 di metanolo e cloroformio. Avvolgere il tubo con un foglio di stagno per evitare la luce per la prevenzione della decomposizione cloroformio. E metti il tubo su uno shaker orbitale per un'ora.
Quindi, utilizzare una pinzetta per trasferire le ossa in un altro tubo di metanolo con lamina di stagno per 30 minuti. Rimuovere completamente il metanolo e lavare con acqua distillata due volte per 15 minuti su uno shaker orbitale. Decantare l'acqua di lavaggio finale e procedere in condizioni sterili.
Risciacquare le ossa in un piatto di sei centimetri con PBS sterile per tre minuti. Aggiungere 40 millilitri di soluzione sterile 0,05%TE in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e incubare le ossa per 23 ore in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Scartare la soluzione TE e risciacquare due volte con PBS sterile integrato con 90 g/mL di ampicillina e 90 g/mL di kanamicina per 15 minuti ciascuno sullo shaker orbitale.
Dopo aver decantato completamente il lavaggio finale, reintegrare nuovamente con 40 millilitri di PBS sterile con antibiotici. Lavare accuratamente per 24 ore a temperatura ambiente con scuotimenti delicati per ottenere un'efficace sterilizzazione degli spazi porosi. Quindi, trasferire le ossa in un tubo di centrifuga da 50 millilitri riempito con PBS sterile con antibiotici.
La matrice extracellulare ossea preparata può essere conservata a quattro gradi Celsius per due mesi. Immergere bem in 75% di etanolo in un piatto e agitare delicatamente il piatto a mano per 30 secondi. Quindi risciacquare con PBS per 30 secondi, due volte.
Trasferire il BEM su una piastra di coltura cellulare pulita a sei pozzi. Aggiungere due millilitri di mezzo di coltura completo ad ogni pozzo. Incubare il BEM durante la notte in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
Ottenere linee cellulari del sistema operativo umano in 100 microlitri di PBS prerifabburato contenenti rosso fenolo indicatore. Utilizzare una pipetta per sospendere le celle del sistema operativo con la concentrazione approssimativa di 1 per 10 al 5°. Dopo che il BEM è completamente imbevuto nel mezzo, dalle epifisi prossimali o distali, perforare l'ago alla cavità midollare di BEM e iniettare cellule del sistema operativo in BEM.
Incubare il modello OS-BEM per un minimo di due ore in un'atmosfera umidificata del 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per garantire che le cellule iniettate aderiscano saldamente al BEM. Quindi, estrae il piatto dall'incubatrice. Aggiungere un mezzo di coltura millilitro sulla piastra e tenerlo nell'incubatrice durante la notte per rivestire completamente la superficie della coltura BEM.
Trasferire delicatamente il modello OS-BEM in un nuovo pozzo di una piastra a sei pozzetti con una pinzetta sterile e rialimentare un mezzo di coltura fresco millilitro. Cultura il modello per 14 giorni nell'incubatore. Durante l'incubazione di 14 giorni, continuare a monitorare il colore medio.
Se il mezzo si trasforma in arancione, o anche giallo, aggiornare immediatamente il mezzo scartando metà del vecchio mezzo e aggiungendo un nuovo mezzo per mantenere un ambiente sano per le cellule del sistema operativo. Mantenere lo stato delle cellule di monitoraggio al microscopio a fluorescenza invertita. Quando le celle del sistema operativo si espandono a piastra, trasferire delicatamente il modello OS-BEM in un altro nuovo pozzo con pinzette sterili.
Dopo 14 giorni di coltura, sciacquare delicatamente il modello OS-BEM con PBS per rimuovere il mezzo di coltura. Quindi trasferire in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere la formalina tamponata al 10% da fissare per l'identificazione istologica. Dopo la demineralizzazione e la decellularizzazione, BEM sembra essere traslucido con una maggiore resilienza e tenacia rispetto all'osso nativo del topo.
Un piccolo residuo muscolare nello spazio della cavità midollare può essere chiaramente osservato. L'imaging a campo brillante dell'osso nativo e del BEM decellularizzato, mostra la rimozione completa dei nuclei cellulari. La struttura porosa naturale nella disposizione della rete di collagene è ben tenuta nel BEM decellularizzato.
Inoltre, la colorazione immunoistochimica per collagene I e collagene IV mostra che i principali componenti della matrice extracellulare sono conservati nella tibia del topo dopo la decellularizzazione. Durante la coltura di 14 giorni, sia il periostio che l'endosteo sono infiltrati dall'espansione delle cellule del sistema operativo. Le cellule del sistema operativo sul BEM decellularizzato mostrano una morfologia altamente eterogenea simile alle caratteristiche citopatologiche di una sezione del sistema operativo.
L'analisi immunoistochimica dopo la coltivazione nel modello BEM per 14 giorni mostra grandi vantaggi nelle colture a lungo termine. Inoltre, cellule del sistema operativo e coltura BEM, glicoproteina a matrice ossea altamente espressa, che è specifica per la matrice osteoide. Il modello tridimensionale di questo in vitro è stato utilizzato per dimostrare con successo un'eterogeneità fenotipico e un meccanismo regolatore di differenziazione dell'osteosarcoma.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Il modello di matrice extracellulare ossea (BEM) per l'osteosarcoma (OS) è stabilito come un supporto adatto per imitare la crescita del tumore primario in vitro. Questo modello aiuta nello studio dell'eterogeneità istologica e citogenica dell'OS.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Ricerca sui tumori ossei
- Osteosarcoma
- Istopatologia
Sfondo
- Il modello BEM è cruciale per comprendere l'osteosarcoma.
- La matrice extracellulare ossea decellularizzata mostra una serocompatibilità variabile.
- Le cellule dell'osteosarcoma mostrano una morfologia eterogenea in questo modello.
- Questo modello riflette l'istopatologia clinica dell'osteosarcoma.
Obiettivo dello studio
- Investigare lo sviluppo e la progressione dei tumori ossei.
- Valutare le sensibilità ai farmaci nell'osteosarcoma e nei tumori correlati.
- Fornire un supporto funzionale per gli studi in vitro.
Metodi utilizzati
- Preparazione della matrice extracellulare ossea decellularizzata.
- Coltura di cellule di osteosarcoma nella matrice derivata dall'osso.
- Utilizzo di topi BALB/c per ottenere campioni ossei.
- Tecniche chirurgiche per la preparazione del tessuto.
Risultati principali
- Le cellule di osteosarcoma coltivate nel modello BEM mostrano una morfologia eterogenea.
- Il modello imita l'istopatologia clinica dell'osteosarcoma.
- La serocompatibilità variabile supporta la sopravvivenza e l'attività cellulare.
- Fornisce informazioni sulle sensibilità ai farmaci e sulla progressione del tumore.
Conclusioni
- Il modello BEM è efficace per studiare l'osteosarcoma.
- Offre un ambiente realistico per la ricerca in vitro.
- Questo metodo migliora la comprensione della biologia dei tumori ossei.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
