Name: Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per laneuplodia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Scopri il sequenziamento a semiconduttore per il test genetico preimpianto per l'aneuploidia. Questo metodo rapido ed economico riduce i tempi di analisi a 2-4 ore, garantendo screening affidabile degli embrioni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è stato sostenuto dal Fondo generale di ricerca (Ref n. 14162417) di Hong Kong, dalla National Natural Science Foundation of China (Ref. n. 81860272), il principale piano di ricerca della Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref No. AB16380219) e il China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) dalla Cina.

<ol><li>Balaban, B., Urman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oocyte+morphology+on+embryo+development+and+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+standard+blastocyst+morphology%2C+euploidy+and+implantation%3A+An+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li>
<li>Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in embryos.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).</li>
<li>Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+chromosomal+imbalance+in+human+embryos+using+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization.</a> Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).</li>
<li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+analysis+of+human+blastocysts+with+the+use+of+FISH%2C+CGH+and+aCGH%3A+Scientific+data+and+technical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation.</a> Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).</li>
<li>Calhaz-Jorge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assisted+reproductive+technology+in+Europe%2C+2013%3A+Results+generated+from+European+registers+by+ESHRE%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE.</a> Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).</li>
<li>Dyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+committee+for+monitoring+assisted+reproductive+technologies+world+report%3A+Assisted+reproductive+technology+2008%2C+2009+and+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010.</a> Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).</li>
<li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li>
<li>Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+Comprehensive+Chromosome+Screening+Technology+Improve+IVF%2FICSI+Outcomes%3F+A+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis.</a> PloS One. 10 (10), e0140779(2015).</li>
<li>Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+microarray-based+24+chromosome+aneuploidy+screening+demonstrates+that+cleavage-stage+FISH+poorly+predicts+aneuploidy+in+embryos+that+develop+to+morphologically+normal+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).</li>
<li>Barbash-Hazan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+aneuploid+embryos+undergo+self-correction+in+correlation+with+their+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).</li>
<li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+cytogenetic+analysis+of+the+human+blastocyst+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage.</a> Fertility and Sterility. 90 (11), S36(2008).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+next-generation+sequencing-based+protocol+for+24-chromosome+aneuploidy+screening+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos.</a> Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+preimplantation+genetic+screening+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li>
<li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+preimplantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Prenatal+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li>
<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium%2FEmbryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis%2Fscreening+%28PGD%2FPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li>
<li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252(2017).</li>
<li>Munné, S., Grifo, J., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism%3A+%E2%80%9Csurvival+of+the+fittest%E2%80%9D+versus+%E2%80%9Cno+embryo+left+behind%E2%80%9D%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”.</a> Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).</li>
<li>Del Carmen Nogales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+of+chromosome+abnormality+affects+embryo+morphology+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).</li>
<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li>
<li>Deleye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shallow+whole+genome+sequencing+is+well+suited+for+the+detection+of+chromosomal+aberrations+in+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).</li>
<li>Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mosaicism+throughout+human+preimplantation+development+in+vitro%3A+incidence%2C+type%2C+and+relevance+to+embryo+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.</a> Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).</li>
<li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diverso da altre chimiche di sequenziamento, il sequencer qui descritto usa il semiconduttore per il rilevamento dei nucleotidi. Il chip stesso è un dispositivo elettronico che rileva gli ionidi idrogeno mediante l'incorporazione di base 17, basata sulla polimerasi, che consente il tempo di sequenziamento di 2,4 h del programma Proton. Inoltre, il chip è un chip di microwell che permette la localizzazione di una molecola bersaglio, che è diversa dalla chimica di sequenziamento delle celle di fluss...

La scelta di embrioni vitali di buona qualità con numeri di copia cromosomica normale (euploide) per il trasferimento nella riproduzione assistita aiuta a migliorare gli esiti della gravidanza. Tradizionalmente, il sistema di classificazione morfologica ben consolidato è ampiamente utilizzato per la valutazione degli embrioni a causa della sua facile disponibilità e della natura non invasiva. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica può fornire solo informazioni limitate sulla qualità dell'embrione1 e sul potenziale di impianto2. Una ragione fondamentale è la sua incapacità di valutare la composizione cromosomica degli embrioni.
L'aneuploidia cromosomica (numero di copie anomale di cromosomi) è una delle principali cause che portano all'arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell'impianto o alla perdita della gravidanza. L'insorgenza di aneuploidia è stata ben documentata negli embrioni umani, che rappresentail 60%,70% negli embrioni in fase di scissione 3,4 e 50%-60% nelle blastocisti5. Questo, in una certa misura, ha contribuito al collo di bottiglia nel miglioramento del tasso di gravidanza del trattamento di fecondazione in vitro (IVF), che ha mantenuto a circa il 35%,40%6,7. Pertanto, la selezione di embrioni euploidi per il trasferimento è creduta per essere utile per migliorare gli esiti della gravidanza. A tal fine, sono stati ulteriormente sviluppati test genetici preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A) per studiare la vitalità degli embrioni utilizzando approcci genetici. Ci sono un numero crescente di studi controllati randomizzati e studi di coorte che supportano il ruolo cruciale di PGT-A. È stato dimostrato che l'applicazione di PGT-A riduce il tasso di aborto spontaneo e aumenta il tasso di gravidanza clinica e il tasso di impianto8, tasso di gravidanza in corso e tasso di natalità vivo9.
Storicamente, diversi metodi sono stati applicati in PGT-A, come la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH), l'ibridazione genomica comparativa (CGH), l'ibridazione genomica comparativa (CGH), la cGH di array e il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP)-microarray. Studi precedenti hanno indicato che PGT-A per gli embrioni in fase di scissione di FISH produce risultati scarsamente coerenti con quelli ottenuti dallo screening cromosomico completo (CCS) delle blastocisti corrispondenti utilizzando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Queste discrepanze possono essere attribuite al mosaicismo cromosomico, ai manufatti tecnici FISH o all'autocorrezione embrionale degli errori di segregazione cromosomica durante lo sviluppo11. È stato ampiamente riconosciuto che l'utilizzo di biopsie del trophectoderm blastocistico (TE) per PGT-A basati su array come array-CGH o SNP-microarray è efficace per identificare lo squilibrio cromosomico negli embrioni10,12. Recentemente, il sequenziamento di nuova generazione a cella singola (NGS) fornisce un approccio ad alta produttività ed economico per l'analisi genetica e ha dimostrato l'applicabilità clinica in PGT-A13,14,15, che lo rendono un approccio promettente alternativa ai metodi attualmente disponibili.
Qui, presentiamo un metodo NGS basato su semiconduttori veloce, robusto e a basso costo per lo screening dell'aneuploidia negli embrioni umani. Il primo passo del flusso di lavoro è l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, utilizzando un kit WGA a cella singola, seguito dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori.
Attraverso il rilevamento degliioni H che vengono rilasciati da ogni incorporazione di triplofosfato deossiribonucleoside durante la sintesi del filamento di DNA, il sistema trasferisce i segnali chimici (pH change) catturati dagli elementi semiconduttori ai dati digitali diretti , che vengono ulteriormente interpretati nelle informazioni sulla sequenza del DNA. Eliminando la necessità di costosi rilevamenti ottici e reazioni di sequenziamento complesse, questa semplice chimica di sequenziamento riduce il costo totale del reagente e riduce il tempo di esecuzione del sequenziamento in 2 o 4 ore16. Ancora più importante, in base alle specifiche delle prestazioni del produttore, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori può generare fino a 15 GB di dati di sequenziamento (dipende dalla qualità della libreria) per corsa, che è significativamente superiore rispetto ad alcuni degli altri sequencer producendo solo circa 3-4 GB di dati (con 2 x 75 bp di lunghezza di lettura)17. Nelle applicazioni cliniche di PGT-A, questa piattaforma può ottenere 24 campioni per chip generando fino a 80 milioni di letture17 e almeno un milione di letture univoche di ogni campione. La profondità di lettura può garantire che ogni campione abbia una copertura dell'intero genoma di 0,05x. I vantaggi di cui sopra di questa piattaforma lo rendono un metodo di screening ideale e quindi, facilitare le sue ampie applicazioni in PGT-A18.

<table><tbody><tr><td>Provette per PCR, 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, Ca2+ e Mg2+ senza</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M NaOH (1,0N)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>Per soluzione di fusione. Provette Eppendorf LoBind di grado molecolare</td></tr><tr><td>, 1,5 mL</td> Kit libreria di frammenti <td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 Sistema di purificazione dell'acqua o Equivalente 18 M&Omega; sistema di libreria di</td> frammenti <td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus ThermoFisher</td><td></td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Tampone di amplificazione</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Enzima di amplificazione</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr>Piastra <td></td><td></td><td>di amplificazione Ion OneTouch</td><td>Nel kit: Alimentatori Ion OneTouch 2 (codice A26367). Componente del kit esteso nel foglio 5</td></tr><tr><td>Ion PI Annealing Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyOne Beads Capture Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Breaking Solution (tappo nero)</td><td></td><td></td><td>Nel kit: Ion PI Hi? Q Soluzioni OT2 200 (codice A26429). Componente del kit esteso nel foglio 5</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Tampone di estrazione cellulare</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-00.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Enzima di estrazione cellulare</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Kit chip Ion PI v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>Minifuga chip ionico, 230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Kit libreria</td> frammenti <td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Kit libreria frammenti Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ&ndash; Temperatura Bagno a secco</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 Instrument</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher Numero di catalogo: 4474778.</td></tr><tr><td>Kit libreria frammenti Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>ThermoFisher Codice prodotto: 4469495. Componente del kit esteso nel foglio 5</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>Questo può essere sostituito da etanolo assoluto di grado molecolare di qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Tampone di diluizione enzimatica per l'estrazione</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-01.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Tampone di diluizione enzimatica per l'estrazione</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-02.</td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>Questo modello è stato sostituito dal fluorimetro Qubit 4, numero di catalogo: Q33226.</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit ds DNA HS</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Provette per saggi Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione schiumogena PI ionica</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Indice per la codifica a barre delle librerie</td><td>BaseCare</td><td></td><td>Questo è un indice preparato internamente. Gli utenti possono acquistare prodotti commerciali dai kit di adattatori per codici a barre ThermoFisher Ion Xpress (Cat. No. 4474517)</td></tr><tr><td>Ion PI Loading Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencour AMPure XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnete (rack magnetico)</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuga</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Kit libreria</td> frammenti <td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Questo può essere sostituito da un'altra marca.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Acqua senza nucleasi</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Ion OneTouch Bottiglia</td><td></td><td></td><td>di olio Ion PI Hi? Q Soluzioni OT2 200 (codice A26429). Componente del kit esteso nel Foglio 5</td></tr><tr><td>Kit libreria di frammenti Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente del kit esteso nel Foglio 3</td></tr><tr>Standard <td></td><td></td> di<td>DNA a doppio filamento</td><td>Si tratta di uno standard di DNA preparato internamente per la calibrazione di Qubit prima della quantificazione della libreria.</td></tr><tr><td>Tampone di preamplificazione PicoPLEX WGA</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Enzima di preamplificazione</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>Questo può essere sostituito dal sistema di amplificazione del DNA SurePlex, numero di catalogo: PR-40-415101-03.</td></tr><tr><td>Libreria Amplification Primer Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente del kit esteso nel foglio 3</td></tr><tr><td>Ion OneTouch Reaction Filter</td><td></td><td></td><td>Componente del kit esteso nel foglio 5</td></tr><tr><td>Router</td><td></td><td></td> di recupero <td>Componente del kit esteso nel foglio 5</td></tr><tr><td>Tubi</td><td></td><td></td> di recupero <td>Componente del kit esteso nel foglio 5</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> <td>di risospensione ISP</td></tr><tr><td>Ion Proton</td><td>ThermoFisher</td><td>DA8600</td><td>Questo modello è importato da Da An Gene Co., LTD. della Sun Yat-Sen University da ThermoFisher ed è stato certificato dalla China Food and Drug Administration per applicazioni cliniche. Il numero di catalogo di ThermoFisher è 4476610.</td></tr><tr><td>Ion PI Ciao? Q Sequenziamento Polimerasi</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sequencing Primer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>server per sequenziatore</td><td>Lenovo</td><td>T260</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Sphere Particles Platinum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 25mm Filtri per siringa</td><td>ThermoFisher</td><td>724-2045</td><td>Dimensione dei pori: 0,45 m. Specifico per fluidi acquosi.</td></tr><tr><td>Ion PI Ciao? Q W2 Soluzione</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 1X W3 Soluzione</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Ion PGM Ciao? Q View Kit di sequenziamento</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>Componente del kit esteso nel foglio 2</td></tr><tr><td>Kit libreria di frammenti Ion Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Componente del kit esteso nel foglio 3</td></tr><tr><td>Kit Ion PI Hi-Q Sequencing 200 (1 ciclo di sequenziamento per inizializzazione)</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>Componente del kit esteso nel foglio 4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi? Q OT2 200 Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>Kit esteso componente in Foglio 5</td></tr></tbody></table>

sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

L'aneuploidia cromosomica, una delle principali cause che portano all'arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell'impianto o alla perdita della gravidanza, è stata ben documentata negli embrioni umani. Il test genetico preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A) è un test genetico che migliora significativamente i risultati riproduttivi rilevando anomalie cromosomiche degli embrioni. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) fornisce un approccio ad alto valore avanzato ed economico per l'analisi genetica e ha dimostrato l'applicabilità clinica in PGT-A. Qui, presentiamo un metodo NGS a base di semiconduttori rapido e a basso costo per lo screening dell'aneeuploidia negli embrioni. Il primo passo del flusso di lavoro è l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, seguita dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori. Generalmente, per un'applicazione PGT-A, 24 campioni possono essere caricati e sequenziati su ogni chip generando 60-80 milioni di letture ad una lunghezza di lettura media di 150 coppie di base. Il metodo fornisce un protocollo raffinato per l'esecuzione di amplificazione del modello e l'arricchimento della libreria di sequenziamento, rendendo il rilevamento PGT-A riproducibile, ad alta produttività, conveniente e risparmio di tempo. Il tempo di esecuzione di questo sequencer a semiconduttore è di sole 2 o 4 ore, riducendo il tempo di consegna dalla ricezione di campioni all'emissione di rapporti in 5 giorni. Tutti questi vantaggi rendono questo saggio un metodo ideale per rilevare aneuploidi cromosomici da embrioni e quindi facilitare la sua ampia applicazione in PGT-A.

Sulla base di questo protocollo modificato, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori è stata per la prima volta, applicata per PGT-A. Abbiamo testato sulle biopsie sia da blastomeri in fase di scissione che da embrioni dello stadio di blastocisti. Si suggerisce che le cellule biopsied subiscono WGA il più presto possibile per prevenire qualsiasi degradazione del DNA. Uno studio precedente ha confrontato le prestazioni di diversi metodi WGA e ha indicato che il metodo che abbiam...

Qui, introduciamo un metodo di sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneeuploidy (PGT-A) con i vantaggi di tempi di consegna brevi, bassi costi e alta produttività.

Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Il protocollo che presentiamo qui è un semiconduttore rapido e a basso costo, metodi basati sul sequenziamento per lo screening dell'aneuploidia negli embrioni. Il protocollo perfezionato per l'esecuzione dell'amplificazione dei modelli e le disposizioni della libreria di sequenziamento rendono il rilevamento PGTA riproducibile, ad alta velocità effettiva, economico e risparmio di tempo. Il runtime di questo sequenziatore semiconduttore è di solo due o quattro ore.Riduzione dei tempi di consegna dalla ricezione dei campioni all'emissione di report in cinque giorni. Questo metodo fornisce il sequenziamento del genoma per lo screening dell'aneuploidia, la variazione del numero di copia e le chiamate al polimorfismo mono nucleotidico. A causa della diversa chimica del sequenziamento, la libreria preparata da questo protocollo non può essere sequenziata direttamente su altri sistemi di sequenziamento.Ma lo stesso sequencer, ma diversa preparazione della libreria, è in grado di eseguire screening prenatali non invasivi. A dimostrare la procedura sarà Xiangchun Guo, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare il sequenziamento, vortice ogni libreria diluita e girare brevemente quattro volte sulla mini centrifuga per tre secondi ogni volta.Quindi, prendi cinque microlitri di ogni libreria, per mettere in comune nel tubo senza nucleo, un punto cinque millilitri. Vortice la libreria mista e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di rottura a due nuovi tubi di recupero.Installare i nuovi tubi di recupero, il router di recupero e la piastra di amplificazione. Mescolare invertendo la bottiglia d'olio tre volte. Assicurarsi che sia l'olio che la soluzione di recupero siano pieni di almeno due terzi.Vortice il buffer PCR master mix per 30 secondi e ruotare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Vortice le particelle di sfera e la libreria mista per un minuto e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Successivamente, preparare un mix di li legatura di 2400 microlitri, aggiungendo 172 microlitri di acqua priva di nucleasi, otto microlitri della libreria mista, 120 microlitri del mix enzimatico e 100 microlitri delle particelle di sfera, al tubo contenente 2000 microlitri del buffer PCR master mix.Impostare una pipetta su 800 microlitri e caricare la miscela di legatura sul filtro di reazione attraverso la porta del campione. Invertire la bottiglia d'olio tre volte e utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere 200 microlitri dell'olio di reazione al filtro di reazione. Selezionare il programma Proton e quindi selezionare il pulsante assistito, per assicurarsi che il dispositivo sia stato impostato correttamente, seguendo le istruzioni sul monitor.Quindi fare clic su Avanti per avviare il programma. Caricare 100 microlitri del campione di prodotto PCR emulsione, 130 microlitri delle perline lavate, 300 microlitri della soluzione di lavaggio ES e 300 microlitri della soluzione melt-off nella striscia a otto tubi. Posizionare la striscia a otto tubi sul sistema di arricchimento.Installare una punta di pipetta e un nuovo tubo a due millilitri a punto zero e avviare il programma. Centrifuga il tubo a due millilitri a zero punti a 15.500 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e tenere dieci microlitri del prodotto di arricchimento.Aggiungere 200 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo e mescolare con il vortice. Centrifuga di nuovo il tubo a due millilitri a punto zero. Scartare il supernatante e conservare 10 microlitri del prodotto di arricchimento.Aggiungere 90 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo e mescolare con il vortice. Per preparare il modello, vortice il controllo positivo e girare brevemente. Aggiungere cinque microlitri del controllo positivo a 100 microlitri del prodotto di arricchimento.Vortice e centrifuga a 15.500 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e conservare 10 microlitri del modello. Aggiungere quindi 20 microlitri del primer di sequenziamento e 15 microlitri del buffer di ricottura al tubo del modello.Vortice il tubo e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Incubare il tubo in un ciclore termico con un coperchio riscaldato. Quindi aggiungere 10 microlitri del buffer di carico al tubo.Mescolare pipettando su e giù. Mescolare i 55 microlitri del campione tubazioni su e giù e caricare il campione sul pozzo di carico del chip. Mantenere la punta della pipetta usata e il tubo PCR a due millilitri a punto zero.Posizionare il chip sulla mini centrifuga del chip quando un campione entra nel chip. Controllare la posizione e centrifugare il truciolo per 10 minuti. Preparare il tampone di ricottura al 50% aggiungendo 500 microlitri di tampone di ricottura e 500 microlitri di acqua priva di nucleasi in un tubo di un punto cinque millilitro.Preparare la soluzione di lavaggio, aggiungendo 500 microlitri di tampone di ricottura e 500 microlitri di 100%2-propanolo in un tubo da un punto cinque millilitri. Quindi, preparare la miscela schiumografica, aggiungendo 49 microlitri del tampone di ricottura del 50% e un microlitro della soluzione schiumografica a due nuovi tubi da un punto cinque millilitri. Pipettare l'aria in una delle miscele schiumosi e caricare 120 microlitri delle bolle nel pozzo di carico.Trasferire il liquido espulso eccessivo dall'uscita al pozzo di carico e centrifugare il chip per 30 secondi sulla mini centrifuga del chip. Ripetere il processo per la seconda miscela schiumosa. Aggiungere 55 microlitri del tampone di ricottura del 50% al tubo di due millilitri mantenuto a zero punti.Utilizzare la punta della pipetta mantenuta per pipettare su e giù. Caricare tutti i 55 microlitri del tampone di ricottura sul pozzo di carico. Centrifugare il chip per 30 secondi sulla mini centrifuga del chip designata.Caricare 100 microlitri della soluzione di lavaggio nel pozzo di caricamento del truciolo e scartare il liquido espulso dal pozzo di uscita. Ripetere questa fase di caricamento una volta. Caricare 100 microlitri del buffer di ricottura del 50%, nel pozzo di caricamento del truciolo.Ripetere questo passaggio di caricamento per un totale di tre volte. Aggiungere 60 microlitri del tampone di ricottura del 50% e sei microlitri dell'enzima di sequenziamento in un nuovo tubo millilitro di un punto cinque. Mescolare pipettando su e giù.Pipettare lentamente 65 microlitri di questa soluzione mista nel pozzo di caricamento del truciolo, evitando bolle. Tenere il chip lontano dalla luce e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Infine, dopo l'incubazione, caricare immediatamente il chip sul sequencer e fare clic su Avvia l'esecuzione del sequenziamento sullo schermo per iniziare a sequenziare.Un'analisi statistica retrospettiva su 186 fasi di scissione e 1135 embrioni in stadio di blastocista ha portato a tassi di successo del WGA di oltre il 95% in entrambi i tipi di campioni. I tassi di guasto del controllo di qualità di sequenziamento sono stati del 3,4% nel gruppo di fase di scissione e solo dell'1,9% nel gruppo di fase blastocista. Oltre all'aneuploidia, i dati di sequenziamento possono essere utilizzati per altre analisi.Ad esempio, copiare le variazioni di numero con una dimensione inferiore a cinque megabase, o analisi del DNA mycondrial, a seconda della profondità e della qualità del sequenziamento. Con il miglioramento della chiamata del numero di copie, i ricercatori possono indagare ulteriormente il futuro del mosaicismo cromosomico negli embrioni umani allo stadio iniziale.

semiconductor-sequencing-for-preimplantation-genetic-testing-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Mutagenesi bisolfito è il gold standard per l'analisi della metilazione del DNA. Il nostro protocollo modificato per l'analisi consente di metilazione del DNA al livello di singola cellula ed è stato specificamente progettato per i singoli ovociti. Può anche essere utilizzato per il clivaggio stadio embrioni.

Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un potente strumento per la caratterizzazione genomica che è limitato per l'alto tasso di errore della piattaforma (~0.5–2.0%). Descriviamo i nostri metodi di sequenziamento di correzione d'errore che ci permettono di ovviare il tasso di errore NGS e rilevare le mutazioni alle frazioni di variante allele rare come 0,0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

L'obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l'anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l'embrione.

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Il presente studio riporta un protocollo per lo screening cromosomico di embrioni umani che utilizza un terreno di coltura esausto, che evita la biopsia embrionale e consente l'identificazione della ploidia cromosomica utilizzando NGS. Il presente articolo presenta la procedura dettagliata, compresa la preparazione del terreno di coltura, l'amplificazione dell'intero genoma (WGA), la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l'analisi dei dati.

Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica

Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l'aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell'amplificazione dell'intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.

Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

Questo protocollo propone procedure di laboratorio olistiche necessarie per rilevare polimorfismi a singolo nucleotide in campioni di cancro gastrico basate su una piattaforma di sequenziamento a semiconduttore ioneico. Vengono inoltre descritte in dettaglio le sequenze target, gli adattatori di legatura, l'amplificazione e la purificazione della libreria e i criteri di controllo della qualità.

Rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide multigenico nel carcinoma gastrico basato su una piattaforma di sequenziamento a semiconduttore ionico

Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Riportiamo qui i metodi sulla manipolazione genetica molecolare del ceppo Po1g di Yarrowia lipolytica per migliorare l'efficienza della delezione genica. I ceppi ingegnerizzati di Y. lipolytica risultanti hanno potenziali applicazioni nella produzione di biocarburanti e biochimici.

Ingegneria genetica di un lievito non convenzionale per i biocarburanti rinnovabili e produzione biochimica

Scopri il sequenziamento a semiconduttore per il test genetico preimpianto per l'aneuploidia. Questo metodo rapido ed economico riduce i tempi di analisi a 2-4 ore, garantendo screening affidabile degli embrioni.

Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

Esplora altri video