Name: Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri come misurare i tassi di consumo di ossigeno in Caenorhabditis elegans intatti per valutare la funzione mitocondriale senza isolamento. Questo metodo fornisce dati biologici accurati su organismi vivi e mobili.

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Gli autori desidera ringraziare il Dr. Kevin Bittman per la sua guida nello stabilire la Seahorse XFp in laboratorio. National Institutes of Health concedere che gm088213 sostenuto questo lavoro.

Nota: Nella figura 2 fornisce una descrizione schematica del protocollo completo.
1. crescita e sincronizzazione di popolazione del nematode9,10
<ol><li>Trasferire le larve L4 di ambiti di provenienza genetici desiderate (ad es., N2 [wild-type] e sel-12 animali) sulle piastre di supporto (NGM) crescita del nematode (Vedi tabella 1 per ricetta) appena seminati con un prato di Escherichia coli (OP50)11. Utilizzare 100mm almeno due o tre piastre di 60 mm per ogni sforzo. Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata (tra 15 – 25 ° C) per 3 – 4 giorni o fino a quando le piastre sono concentrate con gran numero di uova e vermi gravid.</li>
	<li>Lavare le uova e vermi fuori le piastre utilizzando circa 6 mL di tampone di M9 (Vedi tabella 1 per ricetta) per piastra di 100mm di nematodi e trasferimento con pipette Pasteur in vetro in provette da centrifuga individuale 15 mL per ogni sforzo. Selezione questi tubi verso il basso per 3 min a 6.180 x g e aspirare il buffer di M9, conservando solo il pellet animali e uova.</li>
	<li>Aggiungere 3-4 mL di soluzione di candeggina (Vedi tabella 1 per ricetta) a ciascuna provetta e a intermittenza vortice per 6 min. aggiungere M9 buffer riempire ogni tubo e spin a 6.180 x g per 1 min e aspirare il surnatante. Ripetere questo lavaggio con M9 tre volte e spostare la pallina di uovo a un tubo da 15 mL fresca contiene circa 9 mL di tampone di M9.</li>
	<li>Sincronizzare i vermi appena schiusi da nutante a 20 ° C per 16 – 48 h. Spin questi tubi giù a 6.180 x g per 1,5 min e posato gli animali L1 sincronizzati su piatti individuali di NGM appena seminati con un prato di OP50 (circa 6.000-10.000 animali per piastra di 100 mm) e tenere a 20 ° C.</li>
	<li>Questi animali raggiungerà la fase larvale L4 dopo ~ 42 h. In questo momento, spostare le larve L4 usando un plettro platino per OP50 seminato NGM piastre contenenti 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) per impedire loro di produrre progenie. Nota: Assicurarsi che all'interno di un esperimento tutti i ceppi sono sincronizzati per una simile quantità di tempo. Trattamento di FUdR sterilizza gli animali e previene la produzione di covata e progenie uovo, che potrebbe influenzare OCR. Questi animali sterilizzati saranno analizzati il giorno successivo (animali adulti giorno 1 a ~ 66 h) per il dosaggio. FUdR è stato segnalato per un impatto fisiologia e durata della vita di alcuni vermi mutanti. Di conseguenza, questo dovrebbe essere preso in considerazione quando il farmaco è usato per sterilizzazione12,13,14. Viti senza fine possono essere sterilizzati anche con i mezzi di feminizing mutazioni come fem-1(hc17) o fem-3(e2006). Tuttavia, queste mutazioni potrebbero avere un impatto la funzione mitocondriale.</li>
</ol>2. preparazione di composti da iniettare e idratazione delle sonde
Nota: Durante l'analisi del saggio, entrambi i tassi di respirazione basale e massima dei nematodi sono misurati. Massima respirazione viene attivato negli animali dopo l'aggiunta di Carbonil cianuro-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un ionoforo disgiungere che disturba il potenziale di membrana mitocondriale e quindi la sintesi di ATP con il trasporto di protoni attraverso la membrana mitocondriale, mentre permettendo protone pompaggio, trasporto degli elettroni e consumo di ossigeno di procedere4,15 disgiunto dalla sintesi di ATP (Figura 1). Il passaggio finale nell'analisi comporta l'aggiunta di sodio azide (NaN3), un farmaco che inibisce complessi IV e V in ecc, che permette di determinare la respirazione non mitocondriale16 (Figura 1). La seguente procedura può essere eseguita il giorno prima il dosaggio effettivo.
<ol><li>Preparare 1 mL soluzioni di riserva del FCCP (10 mM in dimetilsolfossido [DMSO]: 1000 x la concentrazione finale del dosaggio) e NaN3 (400 mM in dH2o: 10 x concentrazione finale del dosaggio) e conservare a-20 ° C. Nota: Eseguire una curva di concentrazione per ottimizzare la concentrazione di FCCP necessaria per suscitare la risposta massima di OCR per ogni strumento e la regolazione del laboratorio.</li>
	<li>Idratare la cartuccia sensore aggiungendo 200 µ l di dH2O a ciascun pozzetto (e il serbatoio circostante) nella piastra, assicurando che il sensore sonde sono sommerse in dH2O e archivio durante la notte a temperatura ambiente. Nota: La cartuccia sonde possono essere lasciati sommersi per fino a 72 h, ma nel caso di una prolungata idratazione, le piastre dovrebbero essere avvolti in film di paraffina e conservate a 4 ° C. Se idratazione durante la notte non è possibile, la cartuccia sensore deve essere idratata per almeno 4 ore prima del dosaggio.</li>
	<li>Disattivare l'elemento di riscaldamento all'interno dell'interfaccia di respirometro e conservare lo strumento all'interno di un incubatore di 15 ° C durante la notte a bassa temperatura all'interno dello strumento per impedire il surriscaldamento durante l'analisi del saggio gli animali. Nota: Il respirometro è dotato di un elemento riscaldante ma non può essere raffreddato. All'interno di un incubatore di 15 ° C, il respirometro avrà una temperatura stabile tra 18 – 22 ° C, che è una temperatura sana per manutenzione di c. elegans .</li>
</ol>3. equilibratura di carico e cartuccia droga
<ol><li>Pipettare fuori e scartare il dH2O utilizzato per idratare il sensore sonde e sostituirlo con 200 µ l della soluzione calibratore (pH 7.4) in ciascun pozzetto. Diluire la soluzione di riserva FCCP a 100 µM FCCP in dH2O e aggiungere 20 µ l della soluzione diluita per l'iniezione porta A nella cartuccia sensore. Aggiungere 22 µ l di sodio azide 400 mM alla porta B della cartuccia senor.</li>
	<li>Accendere il respirometro e nella schermata home selezionare Start; verrà visualizzata la pagina di modelli. La pagina di modelli, selezionare vuoto o un modello precedentemente progettato; verrà visualizzata la pagina di gruppi. Nella pagina gruppi, selezionare i pozzi A e H come i pozzi di sfondo e assegnare i rimanenti 6 pozzi nei gruppi appropriati in base al piano sperimentale.</li>
	<li>Premere la freccia in basso a destra per andare alla pagina protocollo. Nella pagina protocollo, assicurarsi che i pulsanti equilibrato, basali e iniezioni 1 e 2 siano selezionati. Su questa pagina, regolare il numero di letture di OCR basale, nonché massima OCR (dopo iniezione 1 con FCCP) e non-mitocondriali OCR (dopo iniezione 2 sodio azide). Nota: Ogni misurazione è preceduta da un mix e passaggio di attesa e i tempi per questi parametri sono riportati nella tabella 2.</li>
	<li>Selezionare la freccia in basso a destra e verrà visualizzato un prompt per caricare il piatto della cartuccia del sensore. Assicurarsi che il piatto della cartuccia sensore è caricato nell'orientamento giusto, seguendo le istruzioni sullo schermo rapido promemoria. Il respirometro sarà ora equilibrare la cartuccia. Nota: Questa equilibrazione fornisce tutto il tempo per sistemare gli animali deve essere analizzato nei pozzetti della piastra delle cellule.</li>
</ol>4. preparazione del verme piatto e analisi del saggio
<ol><li>Aggiungere 200 µ l di tampone di M9 in ognuna delle 8 pozzetti della piastra delle cellule e nei serbatoi che circondano i pozzi.</li>
	<li>Prendono ~ 100 vermi da ogni ceppo sulle piastre NGM non teste di serie e lasciare riposare per 2-3 min bagnato alla fine del plettro platino con buffer di M9 e pick 20 animali età-sincronizzati nei pozzetti B-G, lasciando vuoti i pozzi di sfondo A e H. Nota: Dopo il caricamento ogni bene, attendere circa 2 min per consentire agli animali di depositarsi sul fondo dei pozzetti. Si consiglia, inoltre, che una curva numero di vite senza fine eseguire per ottimizzare il numero di vite senza fine per pozzetto per ogni strumento e la regolazione del laboratorio.</li>
	<li>Ormai, il respirometro deve essere calibrato e cliccando OK sullo schermo, la piastra contenente tampone di calibrazione viene espulso e può essere rimosso dal respirometro, mentre la cartuccia sensore rimane all'interno dello strumento. Sostituire la piastra di calibratore con la piastra che contiene gli animali. Piastra di carico e chiudere lo sportello premendo continua e permettono il dosaggio per l'esecuzione.</li>
</ol>5. analisi dei dati post-esperimento di
<ol><li>Una volta che viene completata l'esecuzione di test, seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo per rimuovere la piastra di cella e cartuccia sensore e inserire un'unità flash nella porta USB per salvare i dati di esecuzione nel formato. War. Rimuovere la cartuccia sensore e consentire agli animali di depositano sul fondo dei pozzetti per circa 2 min. Posizionare le piastre di cella sotto uno stereo microscopio per dissezione e contare il numero di animali per pozzetto.</li>
	<li>Aprire il software di analisi del computer e aprire la scheda di normalizzazione per normalizzare OCR al numero di animali. Applicare etichette appropriate per i vari gruppi sotto la scheda modifica ed esportare il file come un file di prisma per ulteriori analisi. Nota: La media delle prime cinque misurazioni, prima che l'aggiunta di FCCP è l'OCR basale, mentre la media delle cinque misurazioni dopo FCCP aggiunta è l'OCR di massima e la media delle ultime cinque misurazioni (dovrebbe essere fatto almeno due misurazioni) dopo l'aggiunta di azoturo di sodio è il tasso di respirazione non mitocondriale. Il dosaggio dovrà essere ripetuto tre volte per garantire la riproducibilità.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
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<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
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<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
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<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
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<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La respirazione mitocondriale è un indicatore penetrante della funzione mitocondriale; Pertanto, è in grado di misurare i tassi di consumo di ossigeno in un sistema biologico, sia in vitro che in vivo è molto prezioso. Respirometers rilevare i livelli di ossigeno utilizzando base porfirinica fosfori che ottenere placati da ossigeno o tramite sensori di ossigeno amperometrico che si basano sulla generazione di una corrente elettrica proporzionale alla pressione di ossigeno. Elettrodo di Clark rientra nella categoria di qu...

L'adenosina trifosfato (ATP), la principale fonte di energia cellulare, è prodotto nei mitocondri dagli enzimi della catena di trasporto dell'elettrone (ecc) situati nella membrana mitocondriale interna. Piruvato, un metabolita chiave utilizzato per la produzione mitocondriale di ATP, viene importato nella matrice mitocondriale dove è decarbossilata a produrre acetil coenzima A (CoA). Successivamente, acetil CoA entra nel ciclo dell'acido citrico conseguente generazione di nicotinamide adenindinucleotide (NADH), una molecola del trasportatore di elettrone chiave. Come gli elettroni dal NADH sono passati all'ossigeno tramite l'ecc, protoni costruire nello spazio intermembrana mitocondriale, che provoca la generazione di un gradiente elettrochimico attraverso la membrana. Questi protoni scorrerà quindi dallo spazio intermembrana attraverso questo gradiente elettrochimico indietro nella matrice mitocondriale attraverso il poro del protone del trifosfato di adenosina synthase, guidando la sua rotazione e la sintesi di ATP1 (Figura 1).
La funzione mitocondriale non è limitata alla produzione di energia, ma è anche fondamentale per l'omeostasi del calcio, specie reattive dell'ossigeno (ROS) lo scavenging e apoptosi, posizionamento criticamente la loro funzione in organismal salute2. La funzione mitocondriale può essere valutata utilizzando una varietà di saggi, compreso ma non limitato all'analisi che misurano il potenziale di membrana mitocondriale, livelli di ATP e ROS e le concentrazioni nel calcio mitocondriale. Tuttavia, queste analisi forniscono un singolo snapshot della funzione mitocondriale e pertanto potrebbero non fornire una visione completa della salute mitocondriale. Poiché il consumo di ossigeno durante la generazione di ATP fa affidamento su una miriade di reazioni sequenziale, serve come un indicatore superiore della funzione mitocondriale. Interessante, sono state osservate variazioni nei tassi di consumo di ossigeno a causa di disfunzione mitocondriale3,4,5.
I tassi di consumo di ossigeno (OCR) di campioni viventi possono essere misurati usando le tecniche che possono essere suddivisi in due gruppi: amperometrico sensori di ossigeno e base porfirinica fosfori che possono essere spenta mediante ossigeno6. Sensori di ossigeno amperometrico sono stati ampiamente utilizzati su misura OCR in cellule coltivate, tessuti e in sistemi modello, ad esempio c. elegans. Tuttavia, i fosfori base porfirinica contenente respirometers possiedono i seguenti vantaggi: (1) essi consentono un confronto fianco a fianco dei due campioni in triplice copia, (2) richiedono più piccola dimensione del campione (per esempio, 20 worms per pozzetto contro ~ 2, 000−5, 000 worm sezione)7e (3) il respirometro può essere programmato per fare quattro distinte iniezioni composte al desiderato volte nel corso della tiratura sperimentale, eliminando la necessità per l'applicazione manuale.
In questo protocollo, passaggi coinvolti nell'utilizzo di un respirometro di rilevamento dell'ossigeno base porfirinica su misura OCR in live, intatto di c. elegans sono descritti. Mentre esiste un protocollo scritto per l'uso del grande formato, elevato throughput respirometro8, questo protocollo è stato adattato per l'uso con uno strumento di cordiale, accessibile e più piccola scala di bilancio più. Questo protocollo è particolarmente utile per valutare la differenza in OCR tra due ceppi, dove high throughput screening non è necessario e il suo utilizzo sarebbe eccessivo.

<table><tbody><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm, 60 mm</td><td>Kord-Valmark Labware Prodotti</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 1,5 mL</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 22 mm Vetrino coprioggetti</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td> Bacto estratto di lievito BD, Bacto 212705 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Generico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata (dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico anidro (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

La funzione mitocondriale ottimale è critica per l'attività cellulare sano, particolarmente in cellule che hanno richieste di alta energia come quelli del sistema nervoso e muscolare. Coerente con questo, la disfunzione mitocondriale è stata associata con una miriade di malattie neurodegenerative e invecchiamento in generale. Caenorhabditis elegans sono stati un sistema potente modello per chiarire le molte complessità della funzione mitocondriale. La respirazione mitocondriale è un forte indicatore della funzione mitocondriale e sviluppata di recente respirometers offrire una piattaforma di state-of-the-art per misurare la respirazione in cellule. In questo protocollo, mettiamo a disposizione una tecnica per analizzare dal vivo, intatto di c. elegans. Questo protocollo si estende su un periodo di ~ 7 giorni e include passaggi per la coltivazione e la sincronizzazione di c. elegans, (2) preparazione di composti da iniettare e idratazione di sonde, equilibrazione di caricamento e cartuccia di droga (3), (4) preparazione del dosaggio di vite senza fine (1) piatto e analisi del saggio e analisi dei dati post-esperimento (5).

Utilizzando il protocollo descritto nel presente documento, OCR di tipo selvaggio animali e tre diversi sel-12 mutante ceppi sono stati determinati. SEL-12 codifica l'ortologo di c. elegans di presenilin17. Le mutazioni presenilin umana sono l'aberrazione genetica più comune connesso con lo sviluppo del morbo di Alzheimer familiare18. Nostri studi hanno mostrato i livelli elevati del calcio mitocondriale in sel...

La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

La funzione mitocondriale è fondamentale per l'omeostasi cellulare e il tasso di consumo di ossigeno è un indicatore decisivo della salute mitocondriale. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per analizzare il tasso di consumo di ossigeno in C.elegans. Questo protocollo fa uso di C.elegans mobili dal vivo che forniscono una misurazione legale della funzione mitocondriale.Elevando la necessità di isolare i mitocondri, un passo che potrebbe potenzialmente avere un effetto sulla sua integrità. Per iniziare, trasferire larve L4 di background genetici desiderati su un prato appena seminato di Escherichia coli su mezzi di crescita di nematodi o piastre NGM. Utilizzare almeno due piastre da 100 mm o tre piastre da 60 mm per ogni deformazione.Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata per tre o quattro giorni, o fino a quando le piastre non sono concentrate con un gran numero di uova e vermi gravidi. Lavare le uova e i vermi dalle piastre usando circa 6 millilitri di tampone M9 per un piatto di nematodi di 100 millimetri. Utilizzando pipette da pascolo in vetro, trasferire le uova e i vermi in singoli tubi di centrifuga da 15 millilitri per ogni ceppo.Far girare i tubi di queste per tre minuti a 6.180 g. Dopo la centrifugazione, aspirare il tampone M9 mantenendo solo l'animale e il pellet di uova. Aggiungere da tre a quattro millilitri di soluzione di candeggina ad ogni tubo e vortice intermittente per sei minuti.Quindi, aggiungere il buffer M9 per riempire ogni tubo e girare a 6.180 g per un minuto. Aspirare il supernatante e ripetere questo lavaggio con l'M9, tre volte. Dopo il lavaggio, spostare il pellet di uova in un tubo fresco da 15 millilitri contenente circa nove millilitri di tampone M9.Sincronizzare i vermi appena nati nutando a 20 gradi Celsius per 16-48 ore. Dopo aver filato questi tubi a 6.180 g per 1,5 minuti, mettere gli animali L-1 sincronizzati su un prato appena seminato di OP50 su singole piastre NGM. Mantenere i piatti a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali raggiungono lo stadio larvale L-4 dopo circa 42 ore.In questo momento, utilizzare un piccone di platino per spostare le larve L4 su piastre NGM sementi OP50 contenenti 0,5 milligrammi per millilitro di FUdR per impedire alla progenie di produzione. Idratare la cartuccia del sensore aggiungendo 200 microlitri di acqua distillata a ciascun pozzo sulla piastra, assicurando che le sonde del sensore siano sommerse. Conservare i piatti durante la notte a temperatura ambiente.Spegnere l'elemento riscaldante all'interno dell'interfaccia respirometro. Conservare la macchina all'interno di un incubatore di 15 gradi Celsius abbassa la temperatura interna alla macchina e impedisce agli animali di surriscaldarsi durante il test. Dopo l'incubazione notturna, pipettare e scartare l'acqua distillata utilizzata per idratare le sonde del sensore e sostituirla con 200 microlitri della soluzione di calibante in ogni pozzo.Diluire la soluzione stock FCCP a FCCP da 100 micromolari in acqua distillata. Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione diluita alla porta di iniezione A nella cartuccia del sensore. Aggiungere 22 microlitri di azidi di sodio da 400 millimolari alla porta di iniezione B della cartuccia del sensore.Ora accendi il respirometro. Nella schermata iniziale selezionare Avvia e verranno visualizzate le pagine modello. Nella pagina dei modelli selezionare vuoto" o un modello progettato in precedenza.Verrà visualizzata la pagina gruppi. Nella pagina gruppi, selezionare i pozzi A e H come pozzi di sfondo e assegnare i restanti sei pozzi in gruppi appropriati secondo il piano sperimentale. Accedere alla pagina del protocollo facendo clic sulla freccia in basso a destra e assicurarsi che l'equilibrato, il basale e le iniezioni uno e due pulsanti siano selezionati.Regolare il numero di letture dell'OCR basale, nonché dell'OCR massimo e dell'OCR non mitocondriale. Selezionare la freccia nell'angolo in basso a destra. Verrà visualizzata una richiesta di caricamento della piastra della cartuccia del sensore.Assicurarsi che la piastra della cartuccia del sensore sia caricata con il giusto orientamento, seguendo le istruzioni nella schermata del prompt del promemoria. Il respirametro ora equilibra la cartuccia. Aggiungere 200 microlitri di tampone M9 in ciascuno degli otto pozzi e serbatoi circostanti della piastra cellulare.Raccogliere circa 100 vermi da ogni ceppo su piastre NGM non sementi e lasciare riposare per due o tre minuti. Quindi, bagnare la fine del piccone di platino con tampone M9 e raccogliere animali sincronizzati di 20 anni in pozzi da B a G, lasciando vuoti i pozzi di sfondo A e H. Ora, fare clic su OK sul software respirometro per espellere la piastra contenente il buffer di calibrazione.Rimuovere la piastra dal respirometro lasciando la cartuccia del sensore all'interno dello strumento. Sostituire la piastra di calibante con la piastra contenente gli animali. Caricare le piastre e chiudere la porta colpendo continuare e lasciare correre il saggio.Una volta completata l'esecuzione del test, seguire le istruzioni visualizzate per rimuovere la piastra cellulare e la cartuccia del sensore. Inserire un'unità flash nella porta USB per salvare il formato run data war. Rimuovere la cartuccia del sensore e consentire agli animali di depositarsi sul fondo dei pozzi per circa due minuti.Posizionare le lastre cellulari al microscopio stereo sezionando e contare il numero di animali per pozzo. Aprire il software di analisi, seguito dalla scheda di normalizzazione, per normalizzare i tassi di consumo di ossigeno al numero animale. Applicare i livelli appropriati per i vari gruppi nella scheda modifica ed esportare il file come file prisma per ulteriori analisi.La media delle prime cinque misurazioni è l'OCR basale. La media delle cinque misurazioni dopo l'aggiunta di FCCP è l'OCR massimo. Infine, la media delle ultime cinque misurazioni dopo l'aggiunta di azide di sodio è il tasso di respirazione non mitocondriale.Poiché la disregolazione del calcio può comportare una funzione mitocondriale alterata, l'OCR sia nei mutanti sel-12 che negli animali di tipo selvatico è stato misurato per esaminare l'effetto delle mutazioni sel-12 sulla funzione mitocondriale e sulla salute. Gli animali di tipo selvatico mostravano costantemente tassi di OCR basali inferiori a cinque picomoli al minuto, per verme. Mentre tutti e tre i ceppi di mutanti sel-12 mostravano un OCR significativamente elevato, di circa sette picomoli al minuto, per verme.Con l'aggiunta di FCCP, c'è stato un aumento dell'OCR di tipo selvaggio, così come dei mutanti sel-12, come previsto. Gli animali di tipo selvatico hanno mostrato un OCR massimo di circa sette picomoli al minuto, per verme. Mentre i mutanti sel-12 avevano OCR di circa 10 picomoli al minuto, per verme.Usa animali vivi, ben nutriti e sincronizzati in questo saggio ed evita il trasferimento di uova o carcasse in pozzi di dosaggio. Inoltre, la temperatura interna dello strumento non dovrebbe superare i 25 gradi Celsius. Candeggina, FCCP, FUdR e azide di sodio sono tossici.Pertanto, si deve fare attenzione a indossare guanti protettivi durante la preparazione di soluzioni stock e il carico di farmaci.

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