Name: Assemblaggio di nanorod oro in Metamolecules plasmoniche chirale utilizzando modelli di Origami del DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri come assemblare nanorod oro in metamolecole plasmoniche chirali utilizzando origami del DNA. Questo metodo consente di creare strutture tridimensionali complesse con forti risposte chirottiche per applicazioni in nanotecnologia.

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Gli autori ringraziano S. Voutilainen per la sua assistenza con spettrometro di CD. Gli autori riconoscono la fornitura di servizi e supporto tecnico di Aalto University presso OtaNano - Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC). Questo lavoro è stato supportato dall'Accademia di Finlandia (grant 308992) e programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea sotto il Marie Skłodowska-Curie di sovvenzione n. 71364.

1. progettazione del origami del DNA
<ol><li>Identificare la desiderata relativa disposizione spaziale di AuNRs e la forma adatta del modello origami del DNA (Figura 1A). Stimare i parametri strutturali dell'AuNRs e i modelli di origami. Individuare le posizioni approssimative di staples che hanno bisogno di ulteriore modifica (Figura 1B).</li>
	<li>Scaricare e installare caDNAno18 per progettare un modello di origami del DNA. In caDNAno, instradare i fili dell'impalcatura e fiocco secondo la forma desiderata del modello e generare la sequenza di fili graffetta facendo clic Sullo strumento Seq. Fare clic Sullo strumento vernice e segnare i fili dei punti metallici che richiedono un'ulteriore modifica (Figura 1C).</li>
	<li>Fare clic su Strumento di esportazione per esportare le sequenze di DNA fiocco (Figura 1C) in un file CSV.</li>
	<li>Design double-stranded serrature per fissare l' angolo Θ tra i due fasci di origami. A seconda dell'orientamento relativo dei due fasci, il costrutto di origami possa adattare - o destri (LH/RH) chirali configurazione spaziale (Figura 1B).</li>
	<li>Importare file CSV il staples in un'applicazione di foglio di calcolo. Aggiungere una sequenza di10 di polyA all'estremità delle graffette utilizzati per l'assemblaggio di AuNR (maniglie). Modificare i fili graffetta sui siti serratura progettata con sequenze di blocco. Nota: Gli assembly nei risultati rappresentativi contengono 36 maniglie sporgenti all'estremità 3' dei fili del fiocco, 18 su ogni pacco di origami di DNA, equamente distribuito sui due eliche in parallelo ogni 21 nt. La distanza tra la prima e l'ultima posizione di impugnatura è 168 nt, circa 57 nm (Vedi il file allegato caDNAno).</li>
</ol>2. montaggio dei modelli di origami del DNA
<ol><li>Preparare un brodo di lavoro di filamenti di poliesteri in fiocco (SM), compresi i fili con maniglie e serrature, mescolando uguali quantità di concentrazione-normalizzata fiocco oligonucleotidi (ad es., 100 µM). Nota: Origami strutture contengono solitamente parecchie centinaia di filamenti di poliesteri in fiocco. Punti metallici sono in genere acquistati da fornitori specializzata nella sintesi chimica degli oligonucleotidi di DNA in pozzetti (ad es., 96 pozzetti) piastre.</li>
	<li>Per 500 µ l di origami di 10 nM, mescolare 50 µ l di Tris-EDTA (TE, 10x), 100 µ l di MgCl2 (100 mM), 25 µ l di NaCl (100 mM), 175 µ l di H2O, 100 µ l di SM (0,5 µM), 5 µ l di fili di blocco (5 µM) e un'impalcatura di 50 µ l (100 nM).</li>
	<li>Tempri la miscela in un termociclatore da 80 ° C a 20 ° C come descritto nella tabella 1.</li>
</ol>3. purificazione di origami del DNA
Nota: Questa sezione descrive il protocollo per la purificazione del gel dell'agarosi. Modelli di origami del DNA possono essere purificati anche utilizzando approcci alternativi38,39.
<ol><li>Per il gel 1%, sciogliere 1 g di agarosio in 100 mL di Tris-Borato-EDTA (TBE, 0.5 x) riscaldando la miscela in un forno a microonde. Aggiungere 10 µ l di 10.000 x macchia di DNA in base alla specifica di macchia. Per ridurre al minimo l'esposizione a luce UV nella fase di estrazione (punto 3.6), utilizzare una macchia di DNA che possa essere visualizzata sotto eccitazione blu.</li>
	<li>Raffreddare la soluzione a circa 40 ° C e aggiungere lentamente 1 mL di MgCl2 (1.3 M) mentre si stringono. Cast gel e incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Impostare il dispositivo per elettroforesi e versare in esecuzione buffer freddo (4 ° C) (0,5 x TBE con 11 mM MgCl2) nella casella di gel. Mettere la vaschetta del gel in un bagno di acqua ghiacciata.</li>
	<li>Aggiungere tampone di caricamento ai campioni origami (buffer di caricamento 6 x contiene 15% polysucrose 400 e 0,25% bromofenolo in acqua). Caricare i campioni nei pozzetti con un volume adeguato secondo il pettine usato (ad es., 50 µ l per un pettine 8 pozzetti di 1,5 mm di spessore).</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi per 2 h a 80 V. Nota: Per caratterizzare l'origami e separare la struttura aperta e chiusa, utilizzare gel 2% invece di 1% e prolungare il tempo di esecuzione a 4 h.</li>
	<li>Immagine del gel con il gel imager (Figura 2). Utilizzare un transilluminatore luce blu per visualizzare le bande, tagliare la banda di origami, smash il gel su un parafilm ed estrarre il liquido. La resa di recupero è di circa il 40%.</li>
	<li>Dispensare il liquido in un'unità filtro centrifugo e spin a 3.000 x g per 5 min, misurare l'assorbimento della soluzione origami a 260 nm con uno spettrometro UV-visibile (UV-VIS). Stimare la concentrazione di origami utilizzando un coefficiente di estinzione di 1,3 x 108 M-1ma-1. Nota: La concentrazione tipica di origami soluzione dopo purificazione del gel dell'agarosi è 1-2 nM.</li>
	<li>Archiviare i modelli di origami purificata a 4 ° C per un uso successivo.</li>
</ol>4. sintesi di nanorod oro
Nota: Il protocollo per la sintesi di AuNR è adattato da letteratura precedente40 con modifiche minori.
<ol><li>Lavare tutti i bicchieri con acqua regia per 5 min, sciacquare con acqua, e trattare con ultrasuoni con acqua ultrapura e asciugare prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 0,2 M esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4mm AgNO3, 64 mM L (+)-acido ascorbico e 6mm NaBH4. Usare acqua fredda (4 ° C) per sciogliere NaBH4 e tenerlo in frigorifero a 4 ° C. Acido ascorbico soluzione deve essere preparata. Attenzione: CTAB è pericoloso in caso di contatto cutaneo (irritante), contatto con gli occhi (irritante), ingestione e inalazione. Usare indumenti protettivi adatti. In caso di ventilazione insufficiente, usare un apparecchio respiratorio adatto. NaBH4 è estremamente pericoloso in caso di contatto cutaneo (irritante), contatto con gli occhi (irritante), ingestione e inalazione. Indossare occhiali splash, un camice da laboratorio, guanti e un respiratore del vapore e polvere. Assicurarsi di utilizzare un respiratore approvato/certificato o equivalente.</li>
	<li>Preparare i semi di Au.<ol>
<li>Aggiungere 500 µ l di CTAB (0,2 M), 250 µ l di acqua ultrapura e 250 µ l di HAuCl4 (1 mM) in un flaconcino di vetro. Mescolare a 450 giri/min a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Aumentare il tasso di agitazione a 1.200 giri/min. Aggiungere 100 µ l di soluzione fredda di NaBH4 (6 mM, 4 ° C). Dopo 2 minuti, fermare l'agitazione e incubare la soluzione in un bagno di acqua a 30 ° C per 30 min prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare AuNRs.<ol>
<li>Sciogliere 0,55 g di CTAB e 0,037 g di acido 2,6-dihydroxybenzoic in 15 mL di acqua calda (60-65 ° C) in un pallone. Raffreddare la soluzione a 30 ° C, aggiungere 600 µ l di AgNO3 (4 mM) e mescolare a 450 giri/min per 2 min. Quindi, lasciare la soluzione indisturbato per 15 min a 30 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di HAuCl4 (1 mM) alla soluzione e mescolare a 450 giri/min per 15 min aggiungere 120 µ l di L (+)-acido ascorbico (64 mM) e poi, immediatamente, mescolare a 1.200 giri/min per 30 µ l di aggiungere 12 s. di semi di Au e continuate a mescolare a 1.200 giri/min per 30 s.</li>
		<li>Incubare la soluzione in un bagno di acqua a 30 ° C per 18 h. Non disturba la soluzione e utilizzare un tappo per chiudere il pallone.</li>
		<li>Trasferire la soluzione risultante in provette da centrifuga e centrifugare a 9.500 x g per 12 min a 20 ° C. Eliminare il supernatante, disperdere il pellet in 20 mL di acqua ultrapura ed eseguire un altro passo di centrifugazione.</li>
		<li>Disperdere la pallina finale in 3 mL di acqua distillata. Stimare la concentrazione di AuNRs da una misurazione di assorbimento UV-VIS utilizzando il coefficiente di estinzione per la risonanza plasmonica longitudinale. Il coefficiente di estinzione può essere previsto utilizzando AuNR forma parametri41. Memorizzare la AuNRs a 4 ° C per un ulteriore uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. funzionalizzazione di nanorod oro con DNA single-stranded
Nota: Questa sezione descrive il protocollo per la funzionalizzazione di AuNR con il DNA a singola elica (ssDNA), seguendo il percorso del cosiddetto basso pH adattato da precedente letteratura42. La AuNRs ricoperta di DNA sono purificati mediante centrifugazione; in alternativa, la purificazione può essere effettuata usando l'elettroforesi del gel dell'agarosi.
<ol><li>Incubare 20 µ l di filamenti di DNA di tiolo-funzionalizzate polyT (1 mM) con 20 µ l di preparati tris(2-carboxyethyl) cloridrato di fosfina (TCEP, 14mm) per 1 h per ridurre i legami disolfuro. Nota: Il modulo gruppi tiolo legami con AuNRs, e la sequenza di polyT ibridizza con il manico di10 polyA sul origami, in cui troppi o troppo pochi coppie di basi può causare un malfunzionamento o un assembly instabile. Attenzione: TCEP può causare gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Indossare guanti protettivi abbigliamento/proteggere gli occhi/viso.</li>
	<li>Mix 150 µ l di AuNRs (10 nM) e 40 µ l di tiolo-DNA TCEP-trattato (0,5 mM). Aggiungere alla soluzione di AuNR per raggiungere una concentrazione finale di SDS di 0.05% 1% sodio dodecil solfato (SDS). Regolare il pH a 2,5-3 con ~ 1 µ l di HCl (1 M).</li>
	<li>Incubare per 2 h mentre si stringono alle 70 giri/min. Nota: Il rapporto di AuNR-a-DNA dovrebbe essere nell'ordine di 1:5, 000-15.000, a seconda delle dimensioni delle aste. Per il AuNRs (70 nm, x 30 nm) preparato seguendo il protocollo descritto nella sezione 4, un eccesso di 13.000 del tiolo-DNA è raccomandato.</li>
	<li>Aggiungere NaCl per raggiungere una concertazione di NaCl finale di 0,5 M e incubare per 4 h a temperatura ambiente mentre si stringono alle 70 giri/min. Nota: Un cambiamento di colore in questa fase potrebbe indicare una funzionalizzazione di DNA non riuscita.</li>
	<li>Regolare il pH a ~8.5 con tampone TBE (10x) e incubare per una notte.</li>
	<li>Lavare il DNA-AuNRs 4 x mescolando i campioni con 1 mL di tampone di lavaggio (0,5 x TBE con 0,1% SDS) e centrifugare a 7.000 x g per 30 min. eliminare il surnatante e risospendere il DNA-AuNRs nel liquido restante (~ 40 µ l). Stimare la concentrazione di DNA-AuNRs da una misurazione di assorbimento UV-VIS come descritto nel passaggio 4.4.5. Nota: La soluzione potrebbe diventare un po' 'nuvolosa' a passi 5.3-5.4 la sostituzione CTAB dalla superficie dell'AuNRs dal tiolo-DNA. La soluzione dovrebbe essere chiara al momento fino a ~ 35 ° c per 5 min.</li>
</ol>6. montaggio del nanorod oro sui modelli di origami del DNA
<ol><li>Aggiungere MgCl2 alla soluzione di DNA purificato-AuNRs, a una concentrazione finale di 10 mM. Mescolare il purificato del DNA-AuNRs e origami per un rapporto 10:1. Nota: Un rapporto inferiore può ridurre il rendimento di prodotto43.</li>
	<li>Tempri la miscela in un mixer con un controllo di temperatura da 40 ° C a 20 ° C mentre si stringono a 400 giri/min, la procedura descritta nella tabella 2. Nota: Per la caratterizzazione di CD, il campione può essere misurato dopo questo passaggio senza ulteriore purificazione.</li>
	<li>Utilizzare l'elettroforesi del gel dell'agarosi per 0,7% (3,5 h a 80 V) per purificare le strutture di origami-AuNR finale.</li>
	<li>Utilizzare un transilluminatore luce bianco per l'imaging. Tagliare la banda di prodotto (dimero origami-AuNR) (Figura 3), smash il gel su un parafilm ed estrarre il liquido. Pipetta il liquido in un'unità filtro centrifugo e spin a 3.000 x g per 5 min. Risospendere il origami-AuNRs nella soluzione. Il rendimento di recupero dal gel è di circa il 50%.</li>
	<li>Stimare la concentrazione delle strutture origami-AuNR da una misurazione di assorbimento UV-VIS come descritto nel passaggio 4.4.5.</li>
</ol>7. formazione immagine di microscopia elettronica di trasmissione
Nota: Questa formiato di uranile (UFo) protocollo di colorazione è adattato da precedente letteratura44.
<ol><li>Mix 200 µ l di soluzione di UFo (0,75%) e 1 µ l di NaOH (5 M) e vortex immediatamente per 2-3 min. Centrifugare la soluzione macchia per 3-4 min a 14.000 x g. Proteggere la macchia da esposizione alla luce (ad es., avvolgendolo nella carta stagnola). Attenzione: UFo è tossico se inalato o ingerito e può causare irritazione agli occhi. Nel caso di esposizioni brevi e minime, utilizzare un dispositivo di filtro respiratorio. Nel caso di esposizioni più intense e, utilizzare un apparecchio di protezione respiratoria self-contained. Indossare i guanti. Il materiale dei guanti deve essere impermeabile e resistente agli UFo e le sue soluzioni. Indossare occhiali, sigillati ermeticamente.</li>
	<li>Effluvio rivestita di carbonio/formvar griglie TEM per 6 s appena prima dell'uso per aumentare l'idrofilia e promuovere l'incollaggio delle strutture. Pipettare 5 µ l del campione gocce sulla griglia TEM, incubare per 5-8 minuti e rimuovere la goccia toccando delicatamente una carta da filtro con il bordo della griglia.</li>
	<li>Pipettare uno grande (~ 20 µ l) e uno piccolo (~ 10 µ l) goccia della soluzione macchia su un parafilm. Mettere la griglia sul drop soluzione piccola macchia e asciugare immediatamente toccando la carta da filtro con il bordo della griglia. Poi, messo sulla goccia di soluzione di grande macchia per 30 s.</li>
	<li>Rimuovere il liquido sulla griglia toccando la carta da filtro con il bordo della griglia. Posizionare la griglia nel supporto griglia. Attendere che la griglia ad asciugare per almeno 10 min.</li>
	<li>Caratterizzare i campioni di origami (Figura 4), AuNRs (Figura 5) e origami-AuNRs (Figura 6) di TEM.</li>
</ol>8. misurazione di dicroismo circolare
<ol><li>Eliminazione dei fogli inceppati dello spettrometro di CD con N2 per 20 min. Nota: La maggior parte degli spettrometri CD richiedono l'eliminazione con N2 prima accensione della lampada. Consultare il manuale di spettrometro di CD.</li>
	<li>Impostare la larghezza di banda, intervallo di scansione e acquisizione step. Nota: L'intervallo di scansione dipende dalla proprietà ottiche di AuNRs, che dipendono dalle dimensioni dell'AuNRs.</li>
	<li>Misura CD vuoto con buffer.</li>
	<li>Misurare gli spettri CD di origami-AuNR campioni (Figura 7). Nota: Utilizzare quarti o le provette di vetro per la misura di CD. Cuvette in plastica non sono adatti per la spettroscopia CD. Inoltre, la maggior parte CD spettrometri consentono l'acquisizione simultanea di assorbimento e CD dati.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo introduce l'intero flusso di lavoro di progettazione, assemblaggio, purificazione e caratterizzazione di DNA origami base chirali assembly di AuNRs. I modelli di origami di DNA utilizzati nel protocollo sono particolarmente adatti per la fabbricazione degli assembly stimoli-sensible a reagire. Vari tipi di risposte e functionalizes può essere incorporato nei filamenti serratura che definiscono lo stato chirale di origami modello (Figura 1B)24,25,26,31. Per gli assembly statici, modelli a forma di blocco più semplici sono spesso sufficienti14,45,46,47.
L'approccio di base di origami di DNA per la fabbricazione di Nanostrutture plasmoniche eredita limitazioni del DNA origami tecnica48. La dimensione dei modelli origami è in genere limitata dalle dimensioni del filo del patibolo. La stabilità delle strutture di DNA è ridotta in condizioni di legge-sale. Il costo di fiocco sintetico fili rimane piuttosto elevato. Tuttavia, recenti sviluppi nel campo della nanotecnologia del DNA strutturale si prevede di superare queste limitazioni49,50,51,52,53,54 , 55.
Rispetto ad altri approcci molecolari basati per la generazione di assembly chirali di AuNRs34,35,36,37, origami di DNA fornisce un alto livello di precisione spaziale e programmabilità.
Per ottenere risposte ottiche affidabile e riproducibile di assembly chirali, si consiglia di adattare i protocolli per AuNR sintesi40, poiché la qualità e le proprietà ottiche dei prodotti commerciali possono variare tra i batch. Ulteriore ricottura (punto 6.2) sono spesso fondamentale per garantire il fissaggio corretto di AuNRs ai modelli di origami del DNA (Figura 6).
Infine, il protocollo qui descritto non è limitato agli assembly chirali. Origami di DNA fornisce una piattaforma molto flessibile per la fabbricazione di Nanostrutture plasmoniche complesso9,10.

Nanostrutture di DNA, origami di DNA, in particolare, sono stati ampiamente usati per organizzare molecole e altri componenti su scala nanometrica (ad es., proteine e le nanoparticelle [NP]), con precisione nanometrica in geometrie quasi arbitrario1,2 , 3 , 4 , 5. la capacità di organizzare il metallo NPs sui modelli di origami del DNA con un alto rendimento e precisione consente la fabbricazione di strutture plasmoniche con proprietà ottiche romanzo6,7,8, 9 , 10. tecnica di origami di DNA è particolarmente utile per la generazione di strutture plasmoniche chirali, che richiedono architetture realmente tridimensionale11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'intero processo di fabbricazione delle assemblee chirali basati su modelli origami di DNA di AuNRs. Il software utilizzato per il design21 e struttura Pronostico22,23 di origami di DNA è intuitiva e liberamente disponibile. La fabbricazione di origami e la sintesi di AuNR utilizzare comuni attrezzature di laboratorio di biochimica (ad es., thermocyclers, elettroforesi del gel, piastre, centrifughe). Le strutture sono caratterizzate tramite spettroscopia TEM e CD standard.
La fabbricazione di Nanostrutture plasmoniche simili con metodi top-down (ad es., Litografia a fascio di elettroni) richiederebbe piuttosto complicate e costose attrezzature. Inoltre, modelli di origami del DNA forniscono la possibilità di incorporare riconfigurabilità strutturali in assembly plasmoniche24,25,26,27,28,29 ,30,31,32,33, che è estremamente impegnativo per le strutture fabbricate con tecniche di litografia. Rispetto ad altri approcci molecolari basati34,35,36,37, fabbricazione di base di origami del DNA fornisce un alto livello di precisione spaziale e programmabilità.

<table><tbody><tr><td>Acido 2,6-diidrossibenzoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D109606-25</td><td>98+%</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA1141414</td><td>99,90%</td></tr><tr><td>Transilluminatore a luce blu&nbsp;</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-06</td><td>FastGene LED Transilluminatore</td></tr><tr><td>Bromofenolo Blu</td><td>Acros Organics 403160050</td><td></td><td>Per gel di agarorosio tampone di caricamento</td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe</td><td>Merck Millipore</td><td>42600</td><td>Estrazione del DNA dall'agarosio</td></tr><tr><td>Spettrometro CD Chirascan</td><td>Cuvetta di fotofisica</td><td></td><td></td>applicata</tr><tr><td></td><td>Hellma</td><td>105-202-85-40</td><td>Provette di quarzo SUPRASIL</td></tr><tr><td>DNA lobind</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biospettrometro&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6135000904</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP525-10</td><td>Polisaccarosio 400 (per tampone di caricamento in gel di agararosio)</td></tr><tr><td>Set di elettroforesi su gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Gel Doc XR+ System...</td></tr><tr><td>HAuCl4&boll; 3H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA3640006</td><td>99,99%</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Scharlau</td><td>AC07441000</td><td>1M</td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9151-100</td><td>BioXtra, acido 98+%</td></tr><tr><td>L(+)-ascorbico</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td>99+%</td></tr><tr><td>M13p7560 filamento di scaffold</td><td>Tilibit nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500</td><td>BioXtra, 99+%</td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Acros Organics</td><td>200050250</td><td>99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-500</td><td>BioXtra, 99,5+%NaOH</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500</td><td>BioXtra, 98+%</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668-1EA</td><td>PARAFILM M</td></tr><tr><td>tampone PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td>Biologia molecolare</td></tr><tr><td>Sistema ProFlex PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255-250</td><td>99+%</td></tr><tr><td>Fili di graffette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sybr Safe</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S33102</td><td>Per</td></tr><tr><td>tampone TBE per colorazione DNA (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td> Buffer TE per <td>biologia molecolare</td></tr><tr><td>(10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP24771</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>FEI Tecnai F12</td></tr><tr><td>Tiolo-funzionalizzato&nbsp; ssDNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biomers.net</tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI20491</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura (Tipo 1)</td><td></td><td></td><td>Sistema Milli-Q Direct 8</td></tr><tr><td>Uranyl Formate</td><td>Tebu-bio</td><td>24762-1</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore a luce bianca</td><td>UVP</td><td>TW-26</td><td></td></tr></tbody></table>

assemblaggio di nanorod oro in metamolecules plasmoniche chirale utilizzando modelli di origami del dna

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

L'indirizzabilità inerente di strutture di DNA origami li rende modelli ideale per la disposizione delle nanoparticelle metalliche in complesse Nanostrutture plasmoniche. L'alta precisione spaziale di un assembly basato su modelli origami del DNA permette di controllare l'accoppiamento tra plasmoniche risonanze delle singole particelle e sartoria proprietà ottiche di nanostrutture costruito. Recentemente, sistemi chirali plasmoniche attirato molta attenzione a causa della stretta correlazione tra la configurazione spaziale delle assemblee plasmoniche e le loro risposte ottiche (ad es., dicroismo circolare [CD]). In questo protocollo, descriviamo l'intero flusso di lavoro per la generazione di DNA origami base chirali assemblee di nanorod oro (AuNRs). Il protocollo comprende una descrizione dettagliata dei principi di progettazione e procedure sperimentali per la realizzazione di modelli di origami del DNA, la sintesi di AuNRs e il montaggio di origami-AuNR strutture. Inoltre, la caratterizzazione delle strutture mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e spettroscopia CD è inclusa. Il protocollo descritto non è limitato alle configurazioni chirali e può essere adattato per la costruzione di varie architetture plasmoniche.

Immagini TEM di assembly finale origami-AuNR, AuNRs e modelli di origami del DNA sono indicate in Figura 4, Figura 5e Figura 6A, rispettivamente. A causa della loro preferenza di associazione alle griglie TEM, origami-AuNR assembly sono solitamente visti come fasci paralleli origami e coni retinici (Figura 6A). Ricottura termica è necessaria per il corretto allineamento di AuNRs sui modelli di origami (Figura 6A, B). Il protocollo consente alti rendimenti dell'Assemblea del AuNRs in metamolecules chirali con forti plasmoniche CD risposte (Figura 7).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tempo</td>
		</tr>
<tr>
<td>80</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>79 - 71</td>
			<td>1 ° C/1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>70 - 66</td>
			<td>1 ° C/5 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>65 - 60</td>
			<td>1 ° C/30 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>59 - 37</td>
			<td>1 ° C/60 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>36 - 30</td>
			<td>1 ° C/15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>29 - 20</td>
			<td>1 ° C/5 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>Tenere premuto</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Le temperature e le tariffe per la ricottura termica di modelli di origami del DNA.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura (° C)</td>
			<td>Tempo (min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>36</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>32</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>Tenere premuto</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: temperature e tempi di permanenza per la ricottura dei modelli di origami del DNA e AuNRs. Il tasso di raffreddamento tra i passaggi è impostato a 0,1 ° C/min. I campioni di DNA origami-AuNR vengono ricotti mentre si stringono a 400 giri/min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig1.jpg"> Figura 1 : Design di DNA basato su modelli origami chirali metamolecules. (A) identificare la disposizione spaziale relativa desiderata di nanorod oro (AuNRs) e una forma adatta del modello origami del DNA. (B) stimare i parametri strutturali di AuNRs (DAuNR, LAuNR) e il modello di origami (Worigami, Lorigami, Θ). Individuare le posizioni approssimative delle graffette che hanno bisogno di ulteriore modifica. (C) progettazione di modelli di origami del DNA utilizzando caDNAno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig2.jpg"> Figura 2 : L'elettroforesi su gel di agarosio di origami. (A) purificazione con elettroforesi in gel d'agarosio 1% per 2 ore a 80 v (B) caratterizzazione con elettroforesi su gel di agarosio al 2% per 4 h a 80 V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig3.jpg"> Figura 3 : La purificazione di elettroforesi del gel dell'agarosi di origami-AuNRs. Gel (0,7%) è stato eseguito per 3,5 h a 80 V per i campioni preparati seguendo la procedura di assemblaggio con differenti rapporti di origami di DNA AuNR (20:1, 5:1) e campioni (rapporto 10:1-AuNRs-a-origami di DNA) con o senza procedura di ricottura. Per le immagini TEM dei campioni in bande di 1, 2 e 3, vedere la Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig4.jpg"> Figura 4 : Immagine TEM di rappresentante dei modelli di origami del DNA. La struttura di origami è costituito da due fasci 14-elica (80 nm, x 16 nm, x 8 nm) collegati tra loro dal filo dell'impalcatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig5.jpg"> Figura 5 : Immagine TEM di rappresentante della AuNRs. Delle dimensioni medie di AuNRs sintetizzato sono 70 x 30 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig6.jpg"> Figura 6 : Immagini TEM di origami-AuNR assembly. (A) AuNR dimeri sull'origami dopo ricottura (banda 1 nella Figura 3). (B) AuNR dimeri sull'origami senza ricottura (band 2 in Figura 3). (C) Origami-AuNR aggrega (banda 3 nella Figura 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig7.jpg"> Figura 7 : Spettri CD degli assembly origami-AuNR. Gli spettri CD di strutture chiuse (i modelli di origami fissati dai fili di blocco in una configurazione di mano destra, con il 50° tra due fasci di origami) e la struttura aperta (i modelli di origami senza fili di blocco). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo il protocollo dettagliato per l'assemblaggio del DNA origami-basato di nanorod oro in metamolecules chirali plasmoniche con forte chiroottiche risposte. Il protocollo non è limitato alle configurazioni chirali e può essere facilmente adattato per la realizzazione di varie architetture plasmoniche.

Assemblaggio di nanorod oro in Metamolecules plasmoniche chirale utilizzando modelli di Origami del DNA

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

Questo metodo consente la fabbricazione di assemblaggi plasmonici chirali tridimensionali con forti risposte chiropticali. Il vantaggio principale di questo approccio è che consente la fabbricazione di nanostrutture metalliche complesse utilizzando strumenti software liberamente disponibili e attrezzature comuni per laboratori biochimici. A dimostrare la procedura saranno Yike Huang uno studente laureato e Minh-Kha Nguyen un postdoc del mio laboratorio.Utilizzare caDNAno per progettare un modello di origami di DNA. Instradare l'impalcatura in fili di graffetta in base alla forma desiderata del modello. Quindi generare le sequenze di filamenti di graffetta facendo clic sull'utensile di sequenza.Fare clic su strumento di vernice e contrassegnare i fili di graffetta che richiedono ulteriori modifiche. Fare clic su Esporta strumento per esportare le sequenze di graffette del DNA in un file CSV. Quindi importare il file CSV in un'applicazione foglio di calcolo.Aggiungete una sequenza di poliadenina alla fine delle graffette da utilizzare come maniglie per l'assemblaggio di nanorodi d'oro. Modificate i fili di graffetta nei siti di blocco progettati con sequenze di blocco. Preparare un materiale di lavoro di trefoli di base, compresi i fili con maniglie e serrature, mescolando quantità uguali di oligonucleotidi di base normalizzati a concentrazione.Quindi preparare la miscela di origami come descritto nel protocollo di testo. Ricottura la miscela nel termociclo da 80 gradi a 20 gradi Celsius. Per un gel all'1%, sciogliere un grammo di agarosio in 100 millilitri di TBE riscaldando la miscela nel forno a microonde.Aggiungere 10 microlitri di macchia di DNA 10.000X secondo le specifiche di macchia. Per ridurre al minimo l'esposizione alla luce UV nella fase di estrazione utilizzare una macchia di DNA che può essere visualizzato sotto eccitazione blu. Gettare il gel e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi mettere la scatola di gel in un bagno d'acqua ghiacciata. Aggiungere il buffer di carico ai campioni di origami e caricare i campioni nei pozzi con un volume adeguato in base al cono utilizzato. Eseguire l'elettroforesi per due ore a 80 volt.Immagine del gel con l'imager in gel. Utilizzare un transilluminatore a luce blu per visualizzare le bande e tagliare la banda degli origami. Quindi rompere il gel sul parafilm ed estrarre il liquido.La resa di recupero è di circa il 40%Pipettare il liquido in un'unità filtrante centrifuga e girare a 3.000 volte G per cinque minuti. Misurare l'assorbimento della soluzione di origami a 260 nanometri con uno spettrometro visibile UV. Per preparare le nanorodi d'oro, sciogliere 0,55 grammi di CTAB e 0,037 grammi di acido 2, 6-diidrossibenzoico in 15 millilitri di acqua calda in un pallone fondo rotondo.Dopo aver raffreddato la soluzione a 30 gradi Celsius, aggiungere 600 microlitri di nitrato d'argento millimolare e mescolare a 450 giri/min per due minuti. Lasciare la soluzione indisturbata per 15 minuti a 30 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di un tetracloroaurato di idrogeno millimolare alla soluzione e mescolare a 450 giri/min per 15 minuti.Inoltre, aggiungere 120 microlitri di acido L-ascorbico millimolare e mescolare immediatamente a 1.200 giri/min per 30 secondi. Ora, aggiungi 12 microlitri di semi d'oro e continua a mescolare a 1.200 giri/min per 30 secondi. Incubare la soluzione in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per 18 ore.Non disturbare la soluzione e utilizzare un tappo per chiudere il pallone. Trasferire la soluzione risultante in tubi di centrifuga e centrifuga a 9.500 volte G per 12 minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il supernatante e disperdere il pellet in 20 millilitri di acqua ultra pura.Eseguire un'altra fase di centrifugazione e quindi disperdere il pellet finale in tre millilitri di acqua distillata. Stimare la concentrazione di nanorod d'oro da una misurazione dell'assorbimento visibile UV usando il coefficiente di estinzione per la risonanza longitudinale del plasmone. Mescolare 150 microlitri di 10 nanorodi d'oro nanomolare e 40 microlitri di DNA tiolo trattato con TCEP da 0,5 millimolare.Aggiungere l'1%SDS alla soluzione di nanorodo d'oro fino a raggiungere una concentrazione finale di SDS dello 0,05%. Regolare il PH tra 2,5 e tre con circa un microlitro di un HCL molare. Incubare per due ore tremando a 70 giri/min.Aggiungere cloruro di sodio per raggiungere una concentrazione finale di cloruro di sodio di 0,5 molare e incubare per quattro ore a temperatura ambiente tremando a 70 giri/min. Quindi, regolare il PH a circa 8,5 con tampone TBE 10X e incubare durante la notte. Lavare le nanorodi d'oro del DNA quattro volte mescolando i campioni con un millilitro di tampone di lavaggio e centrifuga a 7.000 volte G per 30 minuti.Rimuovere il supernatante e rimescolare le nanorodi d'oro del DNA nel liquido rimanente. Stimare la concentrazione di nanorod d'oro al DNA da una misurazione dell'assorbimento visibile UV come prima. Aggiungere cloruro di magnesio alla soluzione di nanorod d'oro dna purificato ad una concentrazione finale di 10 millimolare.Mescolare le nanorode d'oro del DNA purificate e gli origami a un rapporto 10 a uno e produrre la miscela in un mixer con un controllo della temperatura da 40 gradi Celsius a 20 gradi Celsius mentre si trema a 400 giri/min. Utilizzare l'elettroforesi del gel di agarosio allo 0,7% per purificare le strutture finali di nanorodo d'oro origami. Per l'imaging TEM, mescolare 200 microlitri di soluzione di formato 0,75%uranil e 1 microlitro di cinque idrossido di sodio molare.Vortice subito per due o tre minuti. Centrifugare la soluzione di macchia per tre o quattro minuti a 14.000 volte G.Quindi, proteggere la macchia dall'esposizione alla luce avvolgendolo in un foglio di alluminio. Dopo aver aumentato l'idrofalicità delle griglie TEM come descritto nel protocollo di testo, la pipetta cinque campioni di microliter cade sulla griglia TEM.Dopo un'incubazione da cinque a otto minuti, rimuovere la goccia toccando delicatamente una carta da filtro con il bordo della griglia. Ora, pipetta una grande goccia e una piccola goccia della soluzione di macchia su un pezzo di parafilm. Mettere la griglia sulla piccola soluzione di macchia cadere e asciugare immediatamente toccando la carta filtrante con il bordo della griglia.Quindi, mettilo sulla grande caduta della soluzione di macchia per 30 secondi. Qui è mostrata un'immagine TEM dei modelli di origami di DNA. La struttura degli origami è costituita da due fasci a 14 eliche collegati tra loro dal filo dell'impalcatura.Qui viene mostrata un'immagine TEM rappresentativa delle nanorodi d'oro. Le dimensioni medie delle nanorodi d'oro sintetizzata sono di 70 per 30 nanometri. Questa immagine mostra dimeri nanorod d'oro sugli origami dopo la ricottura.A causa della loro preferenza vincolante per le griglie TEM, gli assiemi nanorod d'oro origami sono solitamente visti come fasci e aste di origami paralleli. Il protocollo consente alte rese dell'assemblaggio di nanorodi d'oro in meta-molecole chirali con forti risposte di dicroismo circolare plasmonico. Qui sono mostrati gli spettri delle strutture chiuse e le strutture aperte.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare le proprietà ottiche plasmoniche di complesse nanostrutture metalliche auto-assemblate. Come descritto nel protocollo di testo, in questo metodo vengono utilizzate diverse sostanze chimiche pericolose. Si prega di controllare attentamente la scheda di dati di sicurezza del materiale e prendere le precauzioni necessarie.

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