Colorimetrico analisi di alcalino fosfatasi attività in Biofilm di S. aureus
12 aprile 2019
In questo manoscritto, abbiamo stabilito un metodo di alto rendimento per quantificare l'attività della fosfatasi alcalina nella coltura di biofilm di S. aureus dalla piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti
Questo protocollo ha presentato un metodo facile e affidabile per misurare l'attività della fosfatasi alcalinizzata nella cultura del biofilm S.aureus. Ci aiuterà a comprendere la funzione di ALP nella formazione di biofilm. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'elevata produttività.
È molto sensibile e facile da eseguire. A dimostrare la procedura sarà Kevin Danikowski, ex studente dell'Harper College. Per preparare il TSB, aggiungere il digerimento pancreatico della caseina, il digestione papaica della farina di soia, il cloruro di sodio, il destrosio e il fosfato di dipotassio in acqua distillata.
Coprire il pallone con un foglio di alluminio e metterlo in autoclave per sterilizzare prima dell'uso. Per preparare una TSA, aggiungere l'agar al TSB e metterlo in autoclave per la sterilizzazione. Quindi lascialo raffreddare a temperatura ambiente.
Quindi, versalo nella piastra di Petri con un rapporto di 20 millilitri per piatto. Per preparare un mezzo di coltura di biofilm, aggiungere glucosio al TSB autoclavato per ottenere la concentrazione di 10 grammi per litro. Utilizzando un kit di filtrazione sottovuoto, filtrare la soluzione con un filtro delle dimensioni di un poro di 0,2 micrometri.
Per inoculare, utilizzare un circuito di inoculazione sterilizzato per scegliere una singola colonia di Staph aureus dalla piastra di Petri e posizionarlo nel tubo di coltura riempito con 10 millilitri di TSB. Metti il tubo nell'incubatrice per crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. Con una micropipetta, disegnare 100 microlitri di coltura notturna e trasferirli in un tubo di coltura riempito con 10 millilitri di TSB con glucosio per una diluizione del rapporto volume 1:100.
Vortice delicatamente da mescolare per una concentrazione costante. Utilizzare una micropipetta per trasferire 200 microlitri di coltura diluita in un totale di 18 pozzali da una piastra da 96 pozzi. Incubare la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per 24 ore per la formazione di biofilm.
Per la migliore formazione di biofilm di S.aureus, è meglio scegliere una piastra piatta o rotonda del fondo 96. Successivamente, inclinare leggermente la piastra per decantare il supernatante per aspirazione dal bordo di ogni pozzo. Lavare ogni bene con 1X PBS.
Mettere la piastra nella centrifuga per girare per cinque minuti a 8.000 giri al minuto e decantare il supernatante per aspirazione. Aggiungere 75 microlitri di substrato ALP tamponato costituito da PNPP disponibile in commercio a ciascun pozzo e utilizzare un timer per registrare ogni punto di tempo in triplice copia. Dopo ogni punto di incubazione, aggiungere 75 microlitri di cinque idrossido di sodio molare a ciascuno dei tre pozzi per fermare la reazione.
Centrifuga la piastra per cinque minuti a 800 giri al minuto. Utilizzare una pipetta per trasferire 100 microlitri di supernatante in una nuova piastra di pozzo 96 per la misurazione calorimetrica. Utilizzare un lettore di piastre a 96 po porsi per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 405 nanometri.
Utilizzare i pozzi del punto di tempo di 30 minuti per controllare il rumore di fondo. Ripetere l'intero esperimento in tre piastre di pozzo 96. Questo protocollo sviluppa un saggio rapido e affidabile per misurare l'attività alp nel biofilm S.aureus che non richiede isolamento proteico.
Il risultato rappresentativo dell'attività ALP mostra una tendenza aumentata fino a 75 minuti. Dopo 75 minuti, non è stato osservato alcun aumento dell'attività alp. È molto importante stabilire una buona cultura del biofilm e potrebbero essere necessarie alcune prove da padroneggiare.
Puoi confermare la formazione di biofilm eseguendo un saggio di viola cristallo come precedentemente riportato da noi e da altri o puoi pre-trattare la piastra con plasma umano per facilitare la formazione di biofilm. Dopo il suo sviluppo, è possibile schermare potenziali inibitori dell'ALP che potrebbero interferire nella formazione di biofilm. Il risultato fornirà importanti informazioni per la gestione del biofilm in campo medico.
Cinque idrossido di sodio molare potrebbero essere pericolosi in caso di contatto. Assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione.
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Panoramica
Questo manoscritto presenta un metodo ad alto rendimento per quantificare l'attività della fosfatasi alcalina in colture di biofilm di S. aureus mediante una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti. Il metodo è stato ideato per essere sensibile e semplice da eseguire, facilitando la ricerca sul ruolo della fosfatasi alcalina nella formazione del biofilm.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Ricerca sui biofilm
- Enzimologia
Sfondo
- La fosfatasi alcalina (ALP) è un enzima coinvolto in diversi processi biologici.
- Comprendere il ruolo dell'ALP nella formazione dei biofilm è fondamentale per gli studi microbiologici.
- I metodi ad alto rendimento sono essenziali per una raccolta efficiente dei dati nella ricerca.
- I biofilm sono comunità complesse di microrganismi che possono influenzare la salute e l'industria.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per misurare l'attività della fosfatasi alcalina (ALP) nei biofilm.
- Migliorare la comprensione della funzione della fosfatasi alcalina (ALP) nella formazione dei biofilm.
- Fornire un protocollo facilmente adottabile da parte dei ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di TSB utilizzando digestione pancreatica della caseina, digestione papainica della farina di soia, cloruro di sodio, destrosio e fosfato bicalcico.
- Utilizzo di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti per l'analisi ad alto rendimento.
- Misurazione dell'attività della fosfatasi alcalina in colture di biofilm di S. aureus.
- Dimostrazione della procedura da parte di Kevin Danikowski, ex studente del Harper College.
Risultati principali
- Il metodo quantifica con successo l'attività della fosfatasi alcalina nelle colture di biofilm.
- L'elevata sensibilità della tecnica consente misurazioni accurate.
- Il protocollo è semplice e può essere facilmente implementato in diversi laboratori.
- Le informazioni ottenute da questo studio possono orientare future ricerche sui biofilm.
Conclusioni
- Il metodo consolidato è efficace per lo studio della fosfatasi alcalina nei biofilm.
- Questa ricerca contribuisce alla comprensione della dinamica dei biofilm.
- Studi futuri possono basarsi su questo protocollo per esplorare altri aspetti della biologia dei biofilm.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo metodo consente una quantificazione rapida e ad alto rendimento dell'attività della fosfatasi alcalina nel biofilm di S. aureus senza isolamento delle proteine, supportando la validazione precoce del bersaglio nella scoperta di agenti antimicrobici. Fornendo un segnale sensibile e riproducibile dell'attività enzimatica extracellulare, facilita l'eliminazione dei rischi meccanicistici delle ipotesi terapeutiche legate ai biofilm. La compatibilità del saggio con formati a piastre a 96 pozzetti permette un'integrazione senza soluzione di continuità nelle cascade di screening per l'identificazione dei composti promettenti e la costruzione di previsioni affidabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica secondo cui la fosfatasi alcalina contribuisce alla formazione e al mantenimento dei biofilm.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dell'obiettivo attraverso la misurazione quantitativa dell'attività enzimatica in sistemi di biofilm integri.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando la modulazione della fosfatasi alcalina a fenotipi di inibizione del biofilm.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara un formato standardizzato ad alto rendimento per valutare gli effetti dei composti sui marcatori enzimatici extracellulari.
- Output quantitativo: Genera misurazioni basate sull'assorbanza a 405 nm che consentono l'analisi dose-risposta e la conferma dei risultati positivi.
- Scalabilità: Utilizza un formato a piastra da 96 pozzetti per supportare lo screening di medie dimensioni di librerie di inibitori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Collega l'attività della ALP al biofilm di S. aureus, un fattore di virulenza chiave nelle infezioni correlate a dispositivi e in quelle croniche.
- Continuità traslazionale: Fornisce un'analisi allineata a un biomarcatore che collega la scoperta alla sperimentazione preclinica dell'efficacia.
- Decisioni adeguate al rischio: Fornisce indicazioni per criteri di avanzamento/cessazione basati sull'interazione con il bersaglio e sull'impatto fenotipico nei modelli di biofilm.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo la validazione del bersaglio per guidare l'identificazione dei composti promettenti e la valutazione preclinica di strategie anti-biofilm.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando la fosfatasi alcalina (ALP) come output funzionale del metabolismo del biofilm.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili adatte allo screening di librerie di composti in piastre microtitolazione.
- Analisi: Consente misurazioni cinetiche e a punto fisso che permettono il confronto statistico tra condizioni trattate e di controllo.
- Ricerca traslazionale: Si integra nello sviluppo di biomarcatori collegando l'attività enzimatica alla formazione del biofilm e a potenziali interventi terapeutici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di enzimi extracellulari nei biofilm microbici in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica sul ruolo della fosfatasi alcalina (ALP) nel biofilm.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, sensibilità e riproducibilità attraverso un semplice lettore colorimetrico.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo lo screening rapido di modulatori della fosfatasi alcalina con chiari collegamenti fenotipici al biofilm.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio collegando la modulazione dell'obiettivo all'efficacia anti-biofilm.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base di microbiologia per la coltura asettica di biofilm e la manipolazione di S. aureus.
- Richiede l'accesso a un lettore di piastre a 96 pozzetti in grado di misurare l'assorbanza a 405 nm.
- Necessita della standardizzazione delle condizioni di formazione del biofilm tra pozzetti e piastre per confronti affidabili.
- Comporta considerazioni di ottimizzazione quando si estende ad altre specie batteriche o marcatori extracellulari.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di controllare l'assorbanza di fondo e garantire un'adeguata arresto della reazione con NaOH.
