Name: Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Impara a purificare la frazione ricca di filopodia dendritica da neuroni ippocampali coltivati utilizzando l'affinità tra TLCN e vitronectina. Questo metodo consente di identificare proteine attive nelle sinapsi immature.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Shigeo Okabe e Hitomi Matsuno per la cultura a bassa densità dei neuroni ippocampali, Masayoshi Mishina per topi carenti di TLCN, Sachiko Mitsui e Momoko Shiozaki per l'assistenza tecnica, e membri del laboratorio Yoshihara per discussioni utili . Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354 e JP24500392 e MEXT KAKENHI Grant Nos. da JP23123525 a YF e JP20022046, JP18H04683 e da JP18H05146 a YY.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di RIKEN Wako.
1. Cultura dei neuroni ippocampali
<ol><li>Preparazione del mezzo culturale
	<ol>
<li>Preparazione del mix di vitamine 200x. Sciogliere 100 mg di sale di emicalcio acido Pantotenico, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di i-inositolo, 100 mg di niacinamide, 100 mg di HCl piruridossiale e 100 mg di tiamina HCl in 500 mL di acqua ultrapura. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparazione della soluzione Riboflavin. Sciogliere 100 mg di Riboflavin in 500 mL di acqua ultrapura utilizzando un mescolatore magnetico. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparazione di 1 M CaCl2. Sciogliere 7,35 g di CaCl2x 2H2O in 50 mL di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico.</li>
		<li>Preparazione del mezzo essenziale minimo (MEM). Sciogliere 400 mg di KCl, 6800 mg di NaCl, 2.200 mg di NaHCO3, 158 mg di NaH2PO4a 2H2O, 7000 mg di D-glucosio, e 200 mg di MgSO4-7H2O in 950 mL di acqua ultrapura utilizzando uno stirrer magnetico.</li>
		<li>Titralata 1,8 mL di 1 M CaCl2 al MEM in modo gocciolamento utilizzando un pipet da 1 mL con un'agitazione costante su un agitatore magnetico. Regolare il pH del MEM su pH 7.25 con 1 mol/L HCl.</li>
		<li>Aggiungere al MEM 5 mL di miscela di vitamina 200x e 200 l di riboflavina. Regolare il volume della soluzione a 1.000 mL con acqua ultrapura. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtro da 0,22 m e conservarla a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparazione di 10x soluzioni stock DNase-I. Sciogliere 100 mg di DNase-I in 12,5 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks ', filtrare attraverso un filtro aliquota 0,22 m, in tubi da 1,5 mL, e conservare i tubi a -20 .</li>
		<li>Preparazione della soluzione di stock di citosina a z-D-arabinofuranoside (Ara-C). Sciogliere 25 mg di Ara-C in 8,93 mL di acqua ultrapura (concentrazione finale di 10 mM), filtrare attraverso un filtro da 0,22 m, in tubi da 1,5 mL e conservarlo a -20 gradi centigradi</li>
		<li>Preparazione del mezzo di placcatura. Mescolare 1 mL di soluzione aminoacide MEM, 750 -L di 1 M HEPES, 1 mL di B27, 125 L di 200 mM di glutammina, 250 mL di penicillina/streptomicina, 2,5 mL di siero bovino fetale (FBS) e 44,375 mL di MEM in un tubo da 50 mL.</li>
		<li>Preparazione del mezzo di arresto. Mescolare 1 mL di soluzione aminoacido MEM, 750 -L di 1 M HEPES, 5 mL di FBS (finale 10%) e 43,25 mL di MEM in un tubo da 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di piatti poli-L-Lysine
	<ol>
<li>Piatto di coltura di cellule plastiche da 35 mm con 0,2 mg/mL di idrobromofo poli-L-lisina per 1 giorno a 25 gradi centigradi. NOT:</</c2> Poly-L-lysina non deve essere utilizzato al posto dell'idrobromofopoli poli-L-lisina.</li>
		<li>Lavare i piatti con 2 mL di acqua ultrapura 3 volte. Incubare i piatti con 1,5 mL di stop medio a 25 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione dei neuroni ippocampali dall'embrione di topo
	<ol>
<li>Fonte tissutale di neuroni ippocampali. Dissecitare l'ippocampo da topi C57BL6/J carenti di tipo selvaggio e TLCN nei giorni embrionali 16-17 secondo il metodo di Lu et al.19.</li>
		<li>Incubato sezionato ippocampi in 0.25% trypsin e 1x DNaseI in HBSS contenente 15 mHe, pH 7.2 per 15 min a 37 s con agitazione ogni 3 min. Rimuovere la soluzione. Incubare gli ippocampi in 10 mL di STOP medio per inattivare la trypsin a 4 gradi centigradi per 5 minuti.</li>
		<li>Spostare gli ippocampi in 10 mL di fresco DI STOP medio e incubare a 4 gradi C per 5 min. Spostare l'ippocampo in 10 mL di fresco di medio STOP fresco e incubare a 4 gradi centigradi per altri 5 min. tubo mL. Dissociare gli ippocampi in neuroni isolati pipettando 20 volte usando un pipet da 1 mL. NOT:</</c3> La punta del tubo da 1 mL tocca leggermente il fondo del tubo da 15 mL durante la dissociazione degli ippocampi.</li>
		<li>Aggiungere 9 mL di mezzo di placcatura e filtrare attraverso un colino da 70 m in un tubo da 50 mL. Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro e regolare a 3,5 x 104 celle / mL nel mezzo di placcatura.</li>
		<li>Mezzo ASpirato STOP da piatti poli-L-lisini. Placcare le cellule su piatti poli-L-Lisini rivestiti a 7 x 104 celle/piatto (2 mL/piatto).</li>
		<li>Dopo 60-64 h di incubazione al di sotto del 5% di CO2 a 37 gradi centigradi, aggiungere 2 -L di soluzione di ara-C ai neuroni e scuotere il piatto lentamente. Conservare i piatti della coltura in una scatola umidizzata senza cambiare il mezzo di coltura sotto il 5% di CO2 a 37 gradi centigradi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Purificazione della Frazione dendritica ricca di filopodia
<ol><li>Dopo 13 giorni in vitro (DIV), aggiungere microsfere magnetiche in polistirolo (3 x 106 particelle/piatto) a 20 piatti contenenti i neuroni coltivati. Dopo 1 giorno, lavare i neuroni in 1 mL di PBS con agitazione 3 volte per rimuovere le microsfere medie e non associate. Dopo aver rimosso PBS, decisi i neuroni con 500 s/piatto di tampone di lisi (PBS contenente 0,01% Triton X-100, cocktail inibitore della proteasi senza EDTA e cocktail inibitore della fosfosi).</li>
	<li>Raccogliere il lisato con un raschietto cellulare e spostare il lisato a microtubi a basso legame proteico (10 tubi). Impostare i tubi su un separatore magnete e attendere 1 min. Raccogliere il supernatante e usarlo come la frazione non associata per la colorazione d'argento e l'analisi macchia occidentale.</li>
	<li>Trasferire le perline in un nuovo microtubo a basso legame proteico, impostato su un separatore magnetico e rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere 500 l di lisi tampone e lavare le perline utilizzando un mixer vortice per 15 s. Impostare il tubo su un separatore magnete, attendere 1 min, rimuovere il supernatante, e aggiungere 500 L di tampone di lisi. Ripetere il lavaggio delle perline 10 volte e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Elute proteine legate alle perline (la frazione vincolata) con l'aggiunta di 50 - L di 1x buffer campione SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, e 10% glicerolo) e far bollire il tubo a 98 gradi centigradi per 5 min. Centrifugare il tubo a 860 x g per 10 s e il tubo impostare il tubo su un separatore magnetico per 1 min. Raccogliere il supernatante e usarlo come frazione legata. NOT:</</c2> Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Misurare le concentrazioni proteiche delle frazioni non legate e legate dal saggio della proteina BCA. Visualizza le soluzioni proteiche con il blu bromofenolo e regola la concentrazione a 5 ng/L per SDS-PAGE.</li>
</ol>3. Colorazione d'argento e analisi blot occidentale
<ol><li>Separare le frazioni associate e non associate (50 ng) da SDS-PAGE utilizzando un gel sfumato 5-20%. Macchia d'argento il gel.</li>
	<li>Blot occidentale con anti-TLCN-C (1/3,000), vitronectina anti-bovina (1/5,000), anti-actina (1/1,000) e anti-tubulina anti-thapoling (1/5,000) come anticorpi primari e HRP-congioso anti-coniglio IgG (1/5.000) come anticorpo secondario. Visualizza gli antigeni usando il reagente di rilevamento del rilevamento del bloting occidentale chemiluminescente e un imager chemiluminescenza.</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo sviluppato un metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia utilizzando affinità tra la molecola di adesione cellulare TLCN e la proteina matrice extracellulare vitronectina. Rispetto alla frazione PSD, potrebbe essere possibile identificare le proteine sinaptiche che agiscono sulla sinapsi immatura dalla frazione dendritica ricca di filopodia. Così, i costituenti della frazione dendritica ricca di filopodia sono diversi da quelli della frazione PSD del 74%. A differenza della frazione PSD...

Si pensa che la filopodi dendritica sia precursore delle spine. I filamenti di Actin nella filopodi adendriticane regolano l'estensione e la retrazione 1,2,3. Dopo aver contattato un assone, la filopodia dendritica selezionata inizia la loro maturazione in spine, e si forma una sinapsi4,5. I componenti delle spine sono stati determinati dall'analisi completa delle frazioni di densità postsinaptica6,7, mentre i componenti della filopodia dendritica rimangono in gran parte sconosciuti. È stato dimostrato che telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, e EphB regolano la formazione di filopodi dendritici5,8,9 ,10,11, mentre un metodo non è stato sviluppato per l'analisi completa delle molecole presenti nella filopodia dendritica.
TLCN (ICAM-5) è specificamente espresso dai neuroni spinosi nel segmento cerebrale più rostrale, il telencephalon12. TLCN ha 9 domini simili a Ig nella sua regione extracellulare, una regione transmembrana e una coda citoplasmica13. TLCN si lega alla vitronectina (VN) e all'integrina LFA-1 nella sua regione extracellulare, alla presenilina nella sua regione transmembrana, e alla fosfora-ERM e alla z-actinina nella sua regione citoplasmica5,8,14,15 ,16. TLCN si lega al citoscheletro dell'actina attraverso il fosforo-ERM su punta di filopodia dendritica e di z-actininina nelle spine e negli alberi dendritici8,16.
Abbiamo dimostrato che la sovraespressione del TLCN ha migliorato la formazione di filopodi a dendritici e ha indotto la reversione delle spine alla filopodia10. La forma attiva costituiscista di ezrin legata alla regione citoplasmica TLCN e la formazione di filopodia dendritica migliorata8. Così, TLCN regola la formazione di filopodi dendritici attraverso proteine che legano l'atto. Esselens et al. ha dimostrato che le microsfere hanno indotto l'accumulo di TLCN sui neuroni coltivati17. Abbiamo dimostrato che le strutture della coppa fagocitica si sono formate sui dendriti neuronali intorno alle microsfere rivestite di VN in modo dipendente dalla TLCN15. Costituenti di filopodi dendritici sono simili a quelli della coppa fagocitica. È difficile raccogliere la filopodi dendritica, ma è relativamente più facile raccogliere la coppa fagocitica utilizzando microsfere magnetiche. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodia dendritica18. Qui, descriviamo il metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mLl MCT a basso legame</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm piastre per colture cellulari</td><td>in plastica Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clone3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>clone AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Moesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clone 38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>Crolide di calcio, idrato</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di colina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Citosina beta-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>D-Acido pantotenico sale emicalcico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnete</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Reagente di rilevamento</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gel gradiente</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>Acido folico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coniugato anti-coniglio IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>i-Inositolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Fuji Film</td><td>LAS-1000 mini</td><td>Per il rilevamento della luminescenza dalla membrana WB</td></tr><tr><td>Microsfere magnetiche di polistirene</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM soluzione di amminoacidi</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM L-Arginina cloridrato, 5 mM L-Cistina, 10 mM L-Istidina cloridrato-H2O, 20 mM L-Isoleucina, 20 mM L-Leucina, 19,8 mM L-Lisina cloridrato, 5,1 mM L-Metionina, 10 mM L-Fenilalanina, 20 mM L-Treonina, 2,5 mM L-Triptofano, 10 mM L-Tirosina e 20 mM L-Valina</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi di dimensioni mini-lastra</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Idrobromuro di poli-L-lisina</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>Piridossale HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain 2 Kit wako</td><td></td><td>Wako 291-5031</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Cella di trasferimento semi-secca</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultra pura</td><td>MilliQ</td><td></td><td>Per la produzione di acqua ultra pura</td></tr></tbody></table>

purificazione della frazione ricca di filopodia dendritica

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

I filodidi dendrici sono sporche sottili e lunghe basate sul filamento di actin, e si estendono e si ritraggono come se cercassero un assone bersaglio. Quando la filopodia dendritica stabilisce il contatto con un assone bersaglio, iniziano a maturare in spine, portando alla formazione di una sinapsi. La telencefine (TLCN) è abbondantemente localizzata nella filopodia dendritica ed è gradualmente esclusa dalle spine. La sovraespressione del TLCN nei neuroni ippocampali coltivati induce la formazione di filopodia dendritica. Abbiamo dimostrato che la telencefine si lega fortemente a una molecola di matrice extracellulare, la vitronectina. Le microsfere rivestite di cellavanguardia in vitronectine hanno indotto la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Nella tazza fagocitica, si accumulano proteine che legano il TLCN, come Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), e F-actin, il che suggerisce che i componenti della coppa fagocitica sono simili a quelli della filodia dendritica. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodi a dendritica. Le perle di polistirene magnetico sono state rivestite con vitronectina, che è abbondantemente presente nel mezzo di coltura dei neuroni ippocampali e che induce la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Dopo 24 h di incubazione, le tazze fagocitiche erano leggermente solubili con detergente e raccolte utilizzando un separatore magnete. Dopo aver lavato le perline, le proteine leganti sono state eluite e analizzate dalla colorazione d'argento e dalla gonfiore occidentale. Nella frazione vincolante, TLCN e actin erano abbondantemente presenti. Inoltre, molte proteine identificate dalla frazione sono state localizzate alla filopodica dendritica; così, abbiamo chiamato la frazione di legame come la frazione dendritica ricca di filopodia. Questo articolo descrive i dettagli relativi al metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

Nei neuroni ippocampali coltivati, TLCN è stato abbondantemente localizzato alla filopodia dendritica, albero, e soma e colocalizzato con F-actin (Figura 1A, B). Quando le microsfere di polistirolo sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati, le perline sono state automaticamente rivestite con vitronectina (VN) derivata dal siero bovino fetale (FBS) nel mezzo di coltura; erano principalmente legati ai dendriti, e indotto la formazion...

In questo protocollo, introduciamo un metodo per purificare la frazione dendritica ricca di filopodia dalla struttura di protrusione simile a una coppa fagocitica sui neuroni ippocampali coltivati sfruttando l'affinità specifica e forte tra un filopopodiale dendritico molecola di adesione, TLCN, e una molecola di matrice extracellulare, vitronectina.

Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Rispetto alla frazione PSD, può essere possibile identificare la proteina sinaptica che agisce sulla sinapsi immatura attorno alla frazione ricca di filopodi dendritici. Abbiamo usato il neurone vivo per indurre la formazione di tappi fagocitici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la proteina attiva nella genesi artificiale potrebbe essere identificata dalla frazione ricca di filopodi dendritici.Per iniziare, preparare 200x Vitamin Mix sciogliendo 100 mg di vitamina B5, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di I-inositolo, 100 mg di vitamina B3, 100 mg di cloridrato di vitamina B6 e 100 mg di cloridrato di tiammina in 500 ml di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico. Mescolare con cura l'aliquota in tubi da 50 ml e conservarla a 20 gradi Celsius. Per preparare la soluzione di riboflavina, sciogliere 100 mg di riboflavina in 500 mg di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico.Mescolare con cura l'aliquota in tubi da 50 ml e conservare a 20 gradi Celsius. Per preparare un cloruro di calcio molare sciogliere 7,35 grammi di diidrato di cloruro di calcio in 50 ml di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico. Per la prepara

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la purificazione...

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

Invasione La generazione, la purificazione e la cellula del intracellulari, aggresomes citoplasmatici pieno di proteine ​​DISC1 lunghezza da colture cellulari e di una etichetta, multimerico DISC1 frammento di proteina ricombinante...

Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

Espressione eterologa e purificazione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) sono sfide importanti e fattori limitanti per lo sviluppo di terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. Questo protocollo descrive due metodi per l'isolamento di quantitativi milligrammo di CFTR adatti per studi funzionali e strutturali.

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Riportiamo un protocollo utilizzando celle a fluorescenza-attivato di smistamento per isolare le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) con elevata purezza dal midollo osseo di topi lupus inclini per gli studi funzionali del PDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Qui, presentiamo un protocollo di dissociazione delle cellule per isolare in modo efficiente le cellule presenti in abbondanza bassa all'interno del sistema visivo di Drosophila attraverso celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS).

Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila

Questo protocollo di frazionamento consentirà ai ricercatori di isolare proteine citoplasmatiche, nucleari, mitocondriali e di membrana da cellule di mammifero. Le ultime due frazioni subcellulari vengono ulteriormente purificate tramite gradiente di densità isopicnica.

Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica

Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.

Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena

La ricostituzione in vitro delle proteine citoscheletriche è uno strumento vitale per comprendere le proprietà funzionali di base di queste proteine. Il presente articolo descrive un protocollo per purificare e valutare la qualità dei complessi di settina ricombinanti, che svolgono un ruolo centrale nella divisione e migrazione cellulare.

Purificazione e controllo qualità di complessi di septina ricombinanti per la ricostituzione cellula-free

Impara a purificare la frazione ricca di filopodia dendritica da neuroni ippocampali coltivati utilizzando l'affinità tra TLCN e vitronectina. Questo metodo consente di identificare proteine attive nelle sinapsi immature.

Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Esplora altri video