Name: Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Impara a coltivare e caratterizzare organoidi irradiati da ghiandole mammarie murine per studiare il reclutamento delle cellule tumorali. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi di recidiva del cancro.

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Ringraziamo la Dott. ssa Laura L. Bronsart per aver fornito GFP e i macrofagi RAW 264,7 con etichetta dTomato. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH Grant #R00CA201304.

Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e i protocolli istituzionali approvati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali Vanderbilt University.
1. preparazione di topi e l'acquisizione di cellule (adattato da Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Sacrificio atimici nu/nu topi (8-10 settimane di età) utilizzando Co2 asfissia seguita da lussazione cervicale. Pulire la pelle utilizzando 70% etanolo.</li>
	<li>Reinviare le ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze. Rimuovere i linfonodi prima della resezione. Risciacquare in sterile 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Figura 1a).</li>
	<li>Posizionarlo in provette da 15 mL con 10 mL di Dulbecco ' s Modified Eagle media/miscela nutriente F12 (DMEM/F12) per il trasporto. I campioni possono essere conservati durante la notte a 4 ° c o trasformati immediatamente. Continuate a ghiaccio.</li>
	<li>Irradiare campioni a 20 GY utilizzando una fonte di cesio (Figura 1B).</li>
	<li>45 minuti dopo l'irradiazione, posizionare le ghiandole mammarie in una piastra cellulare sterile da 35 mm e tritare con scalpelli (Figura 1C, D). Mince con circa 40 colpi fino a quando il tessuto si rilassa e si ottengono pezzi che non sono più grandi di circa 1 mm2 in zona.</li>
	<li>Trasferire alla soluzione di collagenasi in una provetta da centrifuga da 50 mL. La soluzione di collagenasi è costituita da 2 mg/mL di collagenasi (vedere tabella dei materiali), 2 mg/ml di tripsina, 5% v/v di siero bovino fetale (FBS), 5 μg/ml di insulina e 50 μg/ml di gentamicina nei media DMEM/F12. Utilizzare 10 mL di soluzione di collagenasi per mouse.</li>
	<li>Mettere in un bagno d'acqua a 37 ° c, Vortex ogni 10 min per 30-60 min. la digestione è completa quando la soluzione di collagenasi è torbida (Figura 1e, F).</li>
	<li>Ruotare la soluzione digerita a 450 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Saranno osservati tre strati. Il supernatante è composto da grasso, lo strato intermedio è una soluzione acquosa, e il fondo è un pellet. Il pellet apparirà rosso in quanto è una miscela di cellule epiteliali, cellule stromali individuali e globuli rossi (Figura 1g).</li>
	<li>Prima del contatto, precoat tutte le pipette, puntali per pipette e provette centrifughe con soluzione di albumina bovina (BSA). La soluzione BSA è costituita da 2,5 w/v% BSA in salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Per il pre-rivestimento, semplicemente aggiungere quindi rimuovere la soluzione BSA all'interno della punta della pipetta e tubi. La soluzione BSA può essere riutilizzata, anche se deve essere filtrata sterile prima di ogni esperimento.</li>
	<li>Per un ulteriore recupero, trasferire il supernatante ad un nuovo tubo da 15 mL rivestito con BSA. Pipettare su e giù vigorosamente per disperdere lo strato di grasso. Centrifugare a 450 x g per 10 minuti a RT. aspirare il supernatante, lasciando una piccola quantità di media nel tubo per evitare di aspirare il pellet cellulare.</li>
	<li>Aspirare lo strato acquoso dal tubo con il pellet originale.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 al tubo con il pellet originale e trasferire al secondo tubo. Pipettare vigorosamente per combinare e risospendere i due pellet.</li>
	<li>Centrifugare a 450 x g per 10 minuti a RT. aspirare il supernatante e aggiungere 4 ml di DMEM/F12 al tubo.</li>
	<li>Aggiungere 40 μl di deossiribonucleasi (DNAse) alla sospensione e agitare delicatamente a mano per 2-5 min alla soluzione RT. DNAse è costituito da 4 U/ml di dnasi in DMEM/F12.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL di DMEM/F12 e pipettare accuratamente. Centrifugare il tubo a 450 x g per 10 min a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante al marchio 0,5 mL. Risospendere in 10 mL di DMEM/F12 e pipettare accuratamente.</li>
	<li>Impulso a 450 x g e Stop 4 s dopo aver raggiunto quella velocità.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.16-1.17 altre tre volte per purificare gli organoidi tramite differenziazione centrifuga. Il pellet dovrebbe ora essere un colore Biancaneve costituito solo da organoidi epiteliali (Figura 1h). Nota: gli organoidi possono anche essere filtrati utilizzando filtri a rete sterile da 40 μm. Dopo il passo 1,16, pipettare i supporti contenenti organoidi attraverso un filtro in una provetta da centrifuga, quindi risciacquare con 5 o 10 mL di supporti DMEM/F12. Capovolgere il filtro su una nuova provetta centrifuga da 50 mL. Passare 10 mL di media DMEM/F12 attraverso, andando il modo opposto per risciacquare qualsiasi retentate. Il retentato deve consistere in organoidi, e il filtrato deve consistere principalmente di cellule stromali, che possono essere scartate o mantenute se lo si desidera.</li>
</ol>2. determinare la densità e placcatura organoidi
<ol><li>Risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12. Pipettare accuratamente per creare una soluzione omogenea.</li>
	<li>Trasferire 50 μL in una capsula di Petri da 30 mm e visualizzarla sotto un microscopio a contrasto di fase a 20x. Contare il numero di organoidi con un contatore tally. Nota: qui i puntali per pipette sono stati costantemente utilizzati con un diametro minimo di 457 μm, che è 5-10 volte il diametro degli organoidi che vengono seminati. Per il trasferimento di volumi di 2 mL o più grandi (ad es. passi 1,16 e 2,1), utilizzare pipette sierologiche con diametri della punta superiori a 1.500 μm.</li>
	<li>Calcola la densità organoide utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg"> La densità desiderata è 1.000 organoidi/mL per semplificare ulteriormente la diluizione. Se la densità è troppo bassa, centrifugare a 450 x g per 5 min e aspirare media. Aggiungere i supporti necessari per raggiungere 1.000 organoidi/mL e pipettare accuratamente per creare una miscela omogenea.<ol>
<li>Per coltivare organoidi in una matrice proteica, i semi organoidi ad una concentrazione di 1 organoide/L in collagene di tipo 1 diluito a 87% o nella membrana seminterrato estratta dal sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm. Mentre si lavora con i campioni, tenere il ghiaccio.</li>
		<li>Per congelare gli organoidi, trasferire il volume desiderato in una provetta centrifuga separata. Girare verso il basso a 450 x g per 5 min. aspirate media, e quindi aggiungere lo stesso volume di 90% FBS/10% DMSO. Risospendere gli organoidi e poi l'aliquota in criotubi. Trasferire a-80 ° c e poi all'azoto liquido entro una settimana.</li>
		<li>Per scongelare, riscaldare in un bagnomaria a 37 ° c per un min. Centrifugare a 450 x g per 5 min, quindi aspirare i mezzi di congelamento. Risciacquare con DPBS sterile, quindi centrifugare nuovamente. Aspirate DPBS e aggiungete un supporto organoide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipettare 50 μL (50 organoidi) in ciascun pozzetto della piastra di adesione bassa (Figura 1I).</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di supporto organoide per portare il volume di lavoro totale a 200 μL. il supporto organoide è composto da 1% di penicillina-streptomicina e 1% di insulina-transferrina-selenio (ITS) nei media DMEM/F12.</li>
	<li>Ogni 2 giorni sostituire i supporti con attenzione. Nota: le piastre a bassa adesione non sono trattate con colture tissutali; Pertanto, le cellule possono essere facilmente staccate. Aspirare lentamente il supporto inclinando la piastra e inserendo la punta della pipetta sul bordo di ogni pozzetto. Lasciare una piccola quantità di media nella parte inferiore del pozzo. Aggiungere lentamente nuovi supporti per evitare di applicare forze di taglio inutili agli organoidi.</li>
</ol>3. co-coltura con i macrofagi
<ol><li>Mantenere GFP o i macrofagi RAW 264,7 etichettati con dTomato nei supporti DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina. Seme 1 x 104,5 x 104, o 1 x 105 cellule/ml in media organoide.</li>
	<li>Utilizzare il contrasto di fase in tempo reale delle cellule e l'imaging fluorescente per monitorare l'infiltrazione dei macrofiti.</li>
</ol>4. colorazione immunofluorescenza degli organoidi
Nota: gli organoidi possono essere macchiati in pozzi a bassa adesione o possono essere trasferiti a vetrini a camera. Per il trasferimento, pipettare delicatamente su e giù fino a quando gli organoidi si sono staccati dalle piastre. Trasferire ai vetrini della camera e incubare per 4-8 h per consentire agli organoidi di aderire alla superficie della piastra.
<ol><li>Rimuovere il fluido organoide dai pozzetti aspirando con cautela. Fissare i campioni con il 10% di formalina tamponata neutra per 15 minuti in RT.</li>
	<li>Lavare 3X 5 min in 1X PBS. Se lo si desidera, i campioni fissi possono essere conservati a 4 ° c per una settimana per ulteriori macchie.</li>
	<li>Permeabilizzare con 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicole per 5 min. Nota: per macchiarsi di F-actina, incubare i campioni con colorante nucleare di bisbenzimide diluito 1:1000 e 1,67 nM in 1% in PBS/BSA per 1 h a RT. Quindi, procedere al passaggio 4,8.</li>
	<li>Bermeabilize con 0.5 PBS. I campioni possono essere conservati in immagini 4opy e immagini immunofluorescenti. meccanismi che contribuiscono alla RLOCK CTC con il 5% di siero di capra normale in 0,1% PBS/polietilenglicole sorbitan monolaurato (PBST) per 1 h a RT. Lavare 3X 5 min con PBS.</li>
	<li>Incubare con anti-cytokeratin 14 diluito 1:1000, E-cadherin diluito 1:200 o stretto Junction protein One diluito 1:100 in 1% NGS in PBST per 1 h a RT. Lavare 3X 5 min in PBST.</li>
	<li>Incubare con capra anti-coniglio secondario diluito 1:200 con 1% NGS/PBST per 1 h a RT. coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.</li>
	<li>Lavare 3X 5 min in PBS. Utilizzare il colorante nucleare (vedere tabella dei materiali) per macchiare i nuclei.</li>
	<li>Lavare 3X 5 min in PBS. Se si utilizza la slitta a camera, montare con un coprioggetti. Conservare avvolto in lamina a 4 ° c per un massimo di 2 settimane.</li>
</ol>

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<li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per la crescita riproducibile e la caratterizzazione di organoidi mammari irradiati (Figura 1). Una dose di irradiazione di 20 GY è stata applicata allo specchio precedenti modelli in vivo di reclutamento di cellule tumorali5. L'irradiazione delle ghiandole mammarie ex vivo prima della formazione organoide ha permesso di isolare gli effetti di danno da radiazioni senza una corrispondente infiltrazione di cellule immun...

Circa il 60% dei pazienti con triplo cancro al seno negativo (TNBC) sceglie la terapia di conservazione del seno (BCT) come forma di trattamento1. In questa modalità di trattamento, il tumore contenente parte del tessuto mammario viene rimosso, e il tessuto normale circostante è esposto a radiazioni ionizzanti per uccidere eventuali cellule tumorali residue. Il trattamento riduce la recidiva in gran parte della popolazione di cancro al seno; Tuttavia, circa 13,5% dei pazienti trattati con TNBC esperienza locoregionale recidive2. Pertanto, studiando come la radiazione può reclutare cellule tumorali circolanti (CTCs) porterà a importanti approfondimenti sulla ricorrenza locale3,4.
Il lavoro precedente ha dimostrato che la radiazione del tessuto normale aumenta il reclutamento di vari tipi di cellule5. Nei modelli preclinici di TNBC, l'irradiazione del tessuto normale ha aumentato il macrofago e successivamente il reclutamento delle cellule tumorali nei tessuti normali5. Stato immunitario influenzato il reclutamento delle cellule tumorali nei siti irradiati, con la migrazione delle cellule tumorali osservata in soggetti immunocompromessi. Ricapitolando queste interazioni utilizzando organoidi derivati da ghiandole mammarie permetterà l'osservazione della migrazione cellulare e interazioni cellulare-stromali in tempo reale con microscopia e imaging cellulare vivo per determinare il ruolo del danno da radiazioni in alterare comportamento delle cellule tumorali.
Gli organoidi mammari del topo hanno aiutato a chiarire i passi chiave nello sviluppo della ghiandola mammaria. Un organoide mammario è un costrutto tridimensionale multicellulare di epitelio mammario isolato che è più grande di 50 μm6,7,8,9,10. Usando organoidi epiteliali primari, Simian et al. ha valutato i fattori necessari per la ramificazione nella ghiandola mammaria7. Ha scoperto che la diffusione può avvenire senza una transizione epiteliale a mesenchimale, fornendo informazioni sulla cascata metastatica8. I metodi per la generazione e la caratterizzazione di organoidi dal tessuto della ghiandola mammaria sono ben consolidati6,11,12,13. Tuttavia, a nostra conoscenza, non sono stati segnalati metodi per la coltivazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie. Un protocollo per la coltivazione e la caratterizzazione di organoidi irradiati sarebbe un passo critico nella ricapitolazione del reclutamento di cellule immunitarie e tumorali indotta da radiazioni.
In questo articolo riportiamo un metodo per coltivare e caratterizzare organoidi epiteliali mammari irradiati in micropiastre a bassa adesione rivestite con un polimero idrofilo che supporta la formazione di sferoidi. Questi organoidi sono stati co-coltivati con macrofagi per esaminare la cinetica di infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo lavoro può essere esteso per includere organoidi co-coltura con cellule adiposo per ricapitolare caratteristiche mammarie, cellule di cancro al seno per visualizzare il reclutamento delle cellule tumorali, e CD8 + cellule T per studiare le interazioni del tumore-immunitarie. I protocolli precedentemente stabiliti possono essere utilizzati per valutare gli organoidi irradiati. I modelli precedenti che cocoltivano organoidi mammari e cellule immunitarie hanno fatto luce sui meccanismi di metastasi e diffusione. Ha riscontrato che la regolazione delle cellule T CD4 + dei macrofagi associati al tumore ha migliorato un fenotipo metastatico di adenocarcinomi mammari14. I modelli di co-coltura sono stati utilizzati anche per chiarire i meccanismi di sviluppo biologico. Chiarito il ruolo delle cellule T CD4 + come down-regolatori di organogenesi mammaria15. Tuttavia, il nostro gruppo è il primo a stabilire una procedura per visualizzare come l'irraggiamento del tessuto normale influenza il comportamento delle cellule immunitarie. Poiché l'irraggiamento tissutale normale è stato dimostrato per migliorare il reclutamento delle cellule tumorali5, questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per analizzare come il comportamento delle cellule tumorali è alterato dall'irradiazione di tessuti e cellule normali, portando ad una maggiore comprensione del recidiva di cancro.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina tamponata neutra</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-citocheratina 14</td><td>abcam</td><td>ab181595</td><td>Lotto: GR3200524-3</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium Histolyticum, tipo VIII</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>E-Caderina</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>24E10</td><td>Lotto: 13</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio secondario</td><td>abcam ab150077</td><td>verde Lotto: GR3203000-1</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio secondario</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>rosso Lotto: GR3192711-1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>Lotto: TG2611041</td></tr><tr><td>Insulina (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio, 100x</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane (membrana basale estratta dal sarcoma del topo di Engelbreth-Holm-Swarm)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96 pozzetti</td><td>Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Falloidina</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>Lotto: GR3214582-16</td></tr><tr><td>Proteina a giunzione stretta 1</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>Lotto: C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole)</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (Monolaurato di polietilenglicole sorbitano)</td><td>Sigma</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Gli organoidi derivati dal tessuto digerito sono costrutti tridimensionali (3D) multicellulari che ricapitolano meglio le condizioni in vivo rispetto ai monostrati cellulari. Anche se non possono modellare completamente la complessità in vivo, mantengono alcune funzionalità dell'organo originale. Nei modelli tumorali, gli organoidi sono comunemente usati per studiare l'invasione delle cellule tumorali. Questo protocollo mira a sviluppare e caratterizzare gli organoidi dal normale e irradiato tessuto della ghiandola mammaria del topo per valutare la risposta alle radiazioni nei tessuti normali. Questi organoidi possono essere applicati a futuri studi di cancro in vitro per valutare le interazioni delle cellule tumorali con organoidi irradiati. Le ghiandole mammarie sono state resecate, irradiate a 20 GY e digerite in una soluzione di collagenasi VIII. Gli organoidi epiteliali sono stati separati tramite differenziazione centrifuga e gli organoidi 3D sono stati sviluppati in micropiastre 96 e a bassa adesione. Gli organoidi hanno espresso il caratteristico marcatore epiteliale citcheratina 14. L'interazione macrofage con gli organoidi è stata osservata negli esperimenti di co-coltura. Questo modello può essere utile per studiare le interazioni tumorale-stromali, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la polarizzazione dei macrofati all'interno di un microambiente irradiato.

Gli organoidi mammari epiteliali irradiati sono stati ottenuti con successo dalle ghiandole mammarie del topo, elaborati e coltivati su piastre a bassa adesione (Figura 1). La resa organoide è stata testata dalla semina in diversi ambienti di crescita (Figura 2a-G). La semina delle cellule direttamente sulla coltura tissutale trattata di piastre cellulari da 10 cm ha prodotto una crescita eccessiva delle cellule fibroblasti. I fibroblasti sono stati identificati sotto micros...

Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.

Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Questo protocollo può essere utilizzato e ulteriormente sviluppato per analizzare come le radiazioni ionizzanti influenzano il reclutamento delle cellule tumorali, portando a una maggiore comprensione della recidiva del cancro. Gli organoidi mammari sono modelli potenti. Imitano le caratteristiche in vivo di base, ma consentono un facile isolamento delle variabili biologiche.L'uso di piastre a bassa adesione nega le sfide del flusso di lavoro associate alle matrici proteiche. I pazienti con tumore al seno triplo negativo sperimentano recidiva regionale locale a tassi più elevati dopo la terapia. Studiare come le radiazioni influenzano il comportamento del tumore e delle cellule immunitarie porterà a importanti intuizioni sui meccanismi di ricorrenza.A dimostrare la microscopia confocale degli organoidi è Javier Gomez, uno studente laureato nel laboratorio silvera batista. Inizia questa procedura con la rimozione delle ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi sacrificati come descritto nel protocollo di testo. 45 minuti dopo l'irradiazione dei campioni come descritto nel protocollo di testo, posizionare le ghiandole mammarie in una piastra cellulare sterile di 35 millimetri e tritare con bisturi.Tritare con circa 40 colpi fino a quando il tessuto si rilassa e si ottengono pezzi che non sono più grandi di circa un millimetro quadrato di area. Ora trasferisci il tessuto in soluzione di collagenasi in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Utilizzare 10 millilitri di soluzione di collagenasi per topo.Posizionare i tubi campione in un bagno d'acqua per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius, vortice per cinque secondi ogni 10 minuti. La digestione è completa quando la soluzione di collagenasi è torbosa. Far girare la soluzione digerita a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.Ora si osservano tre strati. Il supernatante è composto da grasso, lo strato intermedio è una soluzione acquosa e il fondo è un pellet. Il pellet appare rosso, in quanto è una miscela di cellule epiteliali, singoli globuli stromali e globuli rossi.Pre-rivestire tutte le pipette, le punte delle pipette e i tubi di centrifuga con soluzione BSA prima del contatto mediante aggiunta e rimozione della soluzione BSA. La soluzione BSA può essere riutilizzata, anche se deve essere filtrata sterilemente prima di ogni esperimento. Per un ulteriore recupero, trasferire il supernatante in un tubo fresco da 15 millilitri rivestito di BSA.Pipetta su e giù vigorosamente per disperdere lo strato di grasso. Centrifugare il campione a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lasciando una piccola quantità di supporto nel tubo per evitare di aspirare il pellet cellulare.Ora aspira lo strato acquoso dal tubo con il pellet originale. Aggiungere 10 millilitri di DMEM/F12 al tubo con il pellet originale e trasferirli al secondo tubo. Pipetta vigorosamente per combinare e rimescolare i due pellet.Dopo aver centrifugato a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e aggiungere quattro millilitri di DMEM/F12 al tubo. Aggiungere 40 microlitri di deossiribonucleasi alla sospensione e agitare delicatamente a mano per due o cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere accuratamente sei millilitri di DMEM/F12 e pipetta.Dopo aver centrifugato il tubo a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante al segno di 0,5 millilitri. Resuspend il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12 e pipetta accuratamente. Ora centrifuga il tubo pulsando a 450 volte G e fermandosi quattro secondi dopo aver raggiunto quella velocità.Ripetere i passaggi di lavaggio altre tre volte per purificare gli organoidi tramite differenziazione centrifuga. Il pellet dovrebbe ora essere un colore bianco sconto costituito solo da organoidi epiteliali. Resuspend il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12.Pipetta accuratamente per creare una soluzione omogenea. Trasferire 50 microlitri in una piastra di Petri da 30 millimetri e visualizzarli al microscopio a contrasto di fase a 20X. Contare il numero di organoidi con un contatore tally.Pipetta 50 microlitri di organoidi in ogni pozzo di una piastra a bassa adesione. Aggiungere 150 microlitri di mezzo organoide per portare il volume di lavoro totale a 200 microlitri. Sostituire con cura il mezzo ogni due giorni.Mantenere i macrofagi grezzi con etichetta GFP o D 264,7 in supporti DMEM integrati con 10%FPS e 1%penicillina-streptomicina. Seminare le cellule nel mezzo organoide alla densità desiderata. Usa il contrasto di fase delle cellule vive e l'imaging fluorescente per monitorare l'infiltrazione di macrofagi nel tempo.Rimuovere il mezzo organoide dai pozzi aspirando con cura. Fissare i campioni con formalina tamponata al 10% in modo neutro per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli organoidi fissi tre volte per cinque minuti in 1X PBS.Se lo si desidera, i campioni fissi possono essere conservati a quattro gradi Celsius per una settimana per un'ulteriore colorazione. Dopo il lavaggio, permeabilizzare gli organoidi fissi per cinque minuti. Bloccare gli organoidi fissi con siero di capra normale al 5% nello 0,1%PBST per un'ora a temperatura ambiente prima di lavarsi tre volte per cinque minuti con PBS.Incubare gli organoidi fissi con anti-citocheratina-14, E-cadherina o proteina a giunzione stretta uno, in 1%NGS in PBST per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte per cinque minuti in PBST. Ora incuba gli organoidi con anticorpi secondari anti-coniglio di capra con 1%NGS PBST per un'ora a temperatura ambiente.Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Dopo il lavaggio come prima, utilizzare il colorante nucleare per macchiare i nuclei per circa mezz'ora. Lavare gli organoidi macchiati per cinque minuti in PBS tre volte.Se si utilizza uno scivolo a camera, montare con uno slittamento di copertura. Conservare gli organoidi avvolti in un foglio a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Gli organoidi irradiati potevano essere coltivati in piastre a bassa adesione, o all'interno della membrana basale, ma la crescita più rapida si è verificata nelle piastre a bassa adesione.Gli organoidi ricapitolavano le caratteristiche della ghiandola mammaria. Sono stati osservati costrutti morfologicamente simili a dotti e lobi. Le tendenze di crescita hanno indicato che quando gli organoidi sono stati immediatamente seminati dopo la digestione e lo smistamento, gli organoidi non irradiati sono cresciuti più velocemente degli organoidi irradiati, molto probabilmente a causa dell'arresto della crescita cellulare derivante da meccanismi di riparazione dei danni al DNA.Gli organoidi esprimevano caratteristiche epiteliali, che venivano valutate attraverso la colorazione immunofluorescente. Gli organoidi irradiati hanno espresso marcatori epiteliali. La citocheratina-14, un marcatore di mioepitelio, è stata espressa fortemente sulla superficie degli organoidi irradiati.Inoltre, l'E-cadherina e la proteina a giunzione stretta sono state espresse all'interno delle giunzioni cellulari degli organoidi. Queste proteine sono essenziali per una corretta adesione cellulare. Dopo l'irradiazione, gli organoidi hanno continuato a mantenere le loro caratteristiche epiteliali.La colorazione fluorescente degli organoidi potrebbe essere vista all'interno di piastre a bassa adesione utilizzando la microscopia a fluorescenza. Tuttavia, la visualizzazione più chiara è stata ottenuta tramite microscopia confocale. L'intensità di fluorescenza totale corretta è stata calcolata sottraendo lo sfondo e normalizzando per area organoide.La crescita degli organoidi nelle placche a bassa adesione da 96 pozzi ha anche semplificato gli esperimenti di co-coltura. Se sementi a concentrazioni tipiche della ghiandola mammaria, la colocalizzazione dei macrofagi è aumentata con organoidi irradiati. Quando si esegue questa procedura, le cose più importanti da ricordare sono non digerire eccessivamente gli organoidi e purificare adeguatamente la differenziazione centrifuga.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori esperimenti di co-coltura. Gli organoidi possono essere co-coltivati con cellule tumorali, altre cellule immunitarie e cellule stromali per ricreare il microambiente irradiato associato alla ricorrenza. Questo metodo sarà importante per valutare come il normale danno tissutale influenzi specificamente la dinamica delle cellule immunitarie e alla fine verrà utilizzato per comprendere i meccanismi di reclutamento delle cellule tumorali.Gli organoidi mammari hanno meccanismi chiariti di sviluppo della ghiandola mammaria e hanno un cancro al seno robustamente riassunto in vitro. Speriamo che il nostro modello fornisca informazioni sul reclutamento di cellule tumorali indotte dalle radiazioni.

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