Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

Questo protocollo è significativo perché questo è un metodo efficiente per l'isolamento del tessuto oculare pupale di Drosophila per molteplici applicazioni a valle. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la rapida dissezione di un gran numero di occhi pupali senza danneggiare il tessuto. La dissezione della retina pupale Drosophila sarà una sfida per i principianti.

Praticare la tecnica è il modo migliore per migliorare la velocità delle dissezioni e la qualità dei risultati. Dopo aver posizionato le pupe di Drosophila su un piatto di sezionazione nera, posare un nuovo pezzo di nastro a doppia mano sul piatto sezionato, lontano dalle pupe, e utilizzare un paio di forcep per posizionare con cura il lato dorsale delle pupe sul nastro. Posizionare il piatto al microscopio stereo e utilizzare le forcep per rimuovere l'opercolo di ogni pupa.

Usa le forbici a microdisezione per tagliare ogni custodia pupale, consentendone l'apertura per rivelare la testa, il torace e il segmento addominale anteriore e fissare i bordi della custodia pupale al nastro bi lateralmente. Perforare l'addome di ogni pupa con forcep affilate e rimuovere la pupa dal suo caso pupale. Posizionare la pupa sul piatto di dissezione, lontano dal nastro, e coprire la pupa con 400 microlitri di PBS ghiacciato.

Usa le forcep per afferrare ognuna dall'addome e usa le forbici a microdisezione per fare un'incisione trasversale pulita attraverso il torace, tagliando le pupe a metà. Usando due paia di forcep fini, afferrare i bordi tagliati di ogni epitelio toracico e aprire gradualmente il torace e la capsula della testa, esponendo il complesso occhio-cervello e il tessuto adiposo circostante. Quindi, senza afferrare il tessuto, usa le forcelle per guidare ogni complesso oculare traslucido, bianco singolo, a forma di manubrio, lontano dai resti della capsula della testa.

Dopo aver sezionato da sei a 10 pupe, tagliare una punta di micropipetta con una lama di rasoio pulita a un diametro di circa un millimetro e lubrificare la punta con una miscela di PBS e grasso. Utilizzare la punta della pipetta lubrificata per trasferire i complessi occhio-cervello in un pozzo di un piatto di vetro a nove pozzetti contenente 400 microlitri di PBS sul ghiaccio, quindi trasferire il tessuto in 20 microlitri di PBS in almeno 250 microlitri di fissivo per un'incubazione di 35 minuti sul ghiaccio. Al termine della fissazione, utilizzare la stessa punta della pipetta per trasferire il tessuto in un terzo pozzo contenente 400 microlitri di PBS fresco per cinque o 10 minuti sul ghiaccio.

Per bloccare qualsiasi legame anticorpale non specifico, trasferire i complessi occhio-cervello in 400 microlitri di PBS più Triton X per un'incubazione da 10 a 60 minuti sul ghiaccio. Al termine dell'incubazione, aliquote 10 microlitri della soluzione anticorpale primaria nel numero necessario di pozzi di una piastra microwell da 72 pozzetti e utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P10 con una punta modificata da 0,5 millimetri lubrificata con PBS più Triton X per trasferire non più di cinque complessi occhio-cervello e non più di tre microlitri di PBS in ogni pozzo di soluzione anticorpale. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, lavare i campioni due volte in 400 microlitri di PBS più Triton X in un pozzo di un piatto di vetro a nove porri per cinque-10 minuti per lavaggio.

Dopo il terzo lavaggio, trasferire il tessuto in 100 microlitri di un'appropriata soluzione anticorpale secondaria per due ore a temperatura ambiente, protetta dalla luce, dopo tre lavaggi da cinque a 10 minuti in 400 microlitri di PBS più Triton X e un lavaggio in PBS. Quindi, equilibrare i campioni in 200 microlitri di mezzo di montaggio per una o due ore. Alla fine dell'incubazione, trasferire i campioni su uno scivolo al microscopio e utilizzare un robusto ago di tungsteno per inchiodare un complesso occhio-cervello allo scivolo al microscopio sezionato.

Quindi, utilizzare un ago di tungsteno fine per tagliare ogni occhio lontano dal lobo ottico associato e per manovrare ogni occhio sulla superficie dello scivolo del microscopio in modo che la superficie basale dell'occhio sia adiacente allo scivolo. Quindi, applicare un coverslip pulito sui campioni e sigillare il coverslip con smalto per unghie. Per preparare il tessuto oculare pupale per l'analisi della macchia occidentale, prima sezionare da 10 a 16 pupe come precedentemente dimostrato in due lotti, da 10 a 15 minuti di distanza in PBS integrati con proteasi e inibitori della fosfatasi.

Dopo aver risciacquato brevemente i complessi occhio-cervello isolati due volte in singoli pozzi di un piatto di vetro a nove pozzetti su ghiaccio in 400 microlitri di PBS più inibitori, trasferire tutti i complessi occhio-cervello in 400 microlitri di PBS ghiacciato più inibitori decantati su un piatto di sezionatura nero pulito. Al microscopio a sezionatura pulita, utilizzare un robusto ago di tungsteno e una lama di rasoio fine per tagliare in modo pulito ogni occhio dal lobo ottico e utilizzare una punta lubrificata per trasferire i complessi occhio-cervello in cinque microlitri di PBS più inibitori in un tubo di microcentrifugo da 500 microlitri sul ghiaccio. Quindi, aggiungere cinque microlitri del tampone di lisi tissutale occidentale e 10 microlitri di tampone di campioni proteici concentrati 2X al tubo.

Per elaborare i complessi occhio-cervello per l'estrazione dell'RNA, indossando guanti, pulire il banco da banco, il microscopio, gli strumenti di sezionazione e i piatti di sezionatura nera con reagente di decontaminazione al 70% etanolo e RNasi. Dopo aver permesso all'area di asciugarsi, sezionare un totale di 30-40 pupe in lotti da sei a otto. Dopo che ogni lotto di complessi occhio-cervello è stato sezionato, trasferire i complessi occhio-cervello dal piatto a nove pozzetti in 400 microlitri di PBS fresco, ghiacciato e privo di nucleasi su un piatto di sezionazione pulito e utilizzare un robusto ago di tungsteno e una lama di rasoio fine per tagliare in modo pulito ogni occhio dal lobo ottico.

Una volta rimossi tutti gli occhi per un lotto, trasferirli in un tubo di microcentrifugo sterile e privo di RNasi e congelare flash i campioni in azoto liquido prima di procedere al lotto successivo. L'occhio pupale è un tessuto facilmente accessibile che funge da modello eccellente per indagare i processi di sviluppo, compresi quelli che guidano la morfogenesi. Circa 40 ore dopo la formazione del puparium, si ottiene la disposizione finale delle cellule.

Questa è un'età ideale in cui valutare le conseguenze di una mutazione genetica o di un'espressione genica modificata. Ad esempio, seguendo l'espressione ectopica di Diap1, un inibitore del nucleo dell'apoptosi, il conseguente aumento del numero di cellule del reticolo può essere paragonato a quello osservato in una retina di controllo. L'apoptosi può anche essere valutata più direttamente utilizzando anticorpi per attivare una caspasi-1 di morte o utilizzando altri approcci per rilevare le cellule morenti.

Le analisi western dei lisati oculari possono essere utilizzate per determinare la presenza o l'espressione relativa di proteine di interesse o per confrontare l'espressione proteica in diversi punti di tempo di sviluppo. È importante notare che sezionare più di 60 occhi per genotipo o condizione sperimentale è ottimale per isolare un RNA sufficiente di alta qualità. La cosa più importante da ricordare è che la retina pupale è estremamente fragile e deve essere presa molta cura durante la sua dissezione per garantirne l'integrità.