Name: Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara la dissezione della retina pupale di Drosophila melanogaster per immunoistochimica, analisi occidentale ed estrazione di RNA. Questo metodo efficiente preserva l'integrità tissutale per applicazioni downstream multiple.

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Ringraziamo Zack tamburo e nostri recensori per utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da R15GM114729.

1. tessuto preparazione
<ol><li>Messa a punto della drosofila attraversa (come descritto in precedenza20) o cultura ceppi specifici di Drosophila per ottenere pupe del genotipo desiderato. Per garantire che un gran numero di pupe emerga contemporaneamente, stabilire queste culture volare in duplice copia il cibo nutriente media o media di cibo standard generosamente completati con la pasta di lievito.</li>
	<li>Mantenere la drosofila culture a 25 ° C. Per gli incroci che utilizza il sistema di UAS-GAL4, GMR-GAL4 è un driver ideale espresso in cellule di disco larvale occhio posteriore al solco morfogenetico e in tutto lo sviluppo pupale21,22,23, 24. la croce UAS-lacZ X GMR-GAL4 serve come controllo ideale croce come unità di espressione della proteina β-galattosidasi non endogena e inerte.</li>
	<li>Uso la punta di una stecca di bambù 6" che è stata bagnata con acqua distillata per delicatamente sollevare bianchi pre-pupe (Figura 1B) dal lato dei flaconi di coltura sana (Figura 1A) e posizionare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL (Figura 1).</li>
	<li>Posizionare i tubi in una casella di punta della pipetta di plastica insieme a un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata per mantenere la camera a umidità sufficiente per proteggere le pupe da dissecazione (Figura 1). Incubare le pupe a 25 ° C fino alla dissezione.</li>
	<li>Utilizzare una stecca di bambù secco 6" per spingere delicatamente le pupe dal tubo del microcentrifuge e su un nero piatto di dissezione. Porre un pezzo di nastro biadesivo fresca sul piatto da portata per dissezione lontano le pupe.</li>
	<li>Utilizzando un paio di pinze, posizionare il lato dorsale pupe alto (cioè, operculums rivolto verso l'alto, Figura 1B) sul nastro (Figura 2A). Garantire che le pupe aderiscano bene il nastro. Nota: L'umidità sul caso pupal sarà inibiscono l'adesione sicura al nastro, nel qual caso, consentire le pupe asciugare all'aria prima dell'immissione sul nastro biadesivo.</li>
</ol>2. dissezione dei complessi di occhio-cervello
<ol><li>Utilizzare pinze per rimuovere l'opercolo di ogni pupa (Figura 2).</li>
	<li>Usare le forbici microdissection affettare o tagliare aperto il caso pupal di ogni pupa. Falda aprire l'involucro pupa per rivelare la testa, il torace e il segmento addominale anteriore, protezione dei bordi del caso pupal al nastro biadesivo (Figura 2). Nota: Non è necessario rivelare interamente le pupe.</li>
	<li>Perforare l'addome di ogni pupa con pinze taglienti, per afferrare l'animale e rimuoverlo dall'involucro pupa (Figura 2).</li>
	<li>Posizionare le pupe sulla parabola nera dissezione lontano il nastro e coprire con circa 400 µ l di ghiacciata-tamponata-fosfato (PBS, pH 7.4).</li>
	<li>Cogliere ogni pupa di addome con una pinza e con le forbici microdissection, fare un taglio pulito a sezione trasversale attraverso l'intero torace, tagliando la pupa a metà (Figura 2D).</li>
	<li>Rimuovere il residuo posteriore di ciascuna carcassa da PBS e mettere da parte il piatto per dissezione (non scartare, vedere il punto 3.2.1).</li>
	<li>Utilizzando due coppie di una pinzetta, aprire il torace e la testa di ogni pupa per rivelare il complesso di occhio-cervello (Figura 2E). Per effettuare questa operazione, afferrare i bordi di taglio dell'epitelio torace e gradualmente allo strappo per aprire il torace e poi la testa capsula, esponendo il tessuto grasso di occhio-cervello, complessa e circostante.</li>
	<li>Senza afferrare il tessuto, è possibile utilizzare pinze per guidare il complesso di occhio-cervello lontano i resti della testa capsula o scoop il complesso di occhio-cervello dalla capsula testa strappata-Apri. Nota: Il complesso di occhio-cervello è a forma di manubrio, bianco sporco e più trasparente di color crema grasso circostante (Figura 2B, E).</li>
	<li>Con il forcipe, rimuovere con cautela il più grasso connesso con i complessi di occhio-cervello senza toccare il tessuto oculare.</li>
</ol>3. elaborazione del tessuto per immunofluorescenza
<ol><li>Sezionare almeno 6-10 pupe come descritti (passi 2.1-2.9). Nota: Tre o quattro repliche indipendenti di ogni dissezione tendono a produrre dati sufficienti per testare un'ipotesi.</li>
	<li>
Lavaggio e fissazione
	<ol>
<li>Tagliare la punta di un P20 o la punta della pipetta P100 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura di punta a ~ 1 mm di raggio e lubrificare pipettando un mix di PBS e grasso su e giù. Questo grasso può essere ottenuto dai resti carcassa rimossi al punto 2.6.</li>
		<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBS in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio. Utilizzare la punta lubrificata e una micropipetta di spostamento di aria P20 o P100 per trasferire. Nota: Complessi di occhio-cervello saranno rispettare non lubrificati suggerimenti durante il pipettaggio e danneggiati o perso.</li>
		<li>Rimuovere il grasso residuo connesso con tessuto oculare pipettando il PBS su e giù per ruotare delicatamente i complessi di occhio-cervello. In questo e in tutti i successivi lavaggi, non direttamente Pipettare complessi di occhio-cervello su e giù di danneggiare il tessuto fragile dell'occhio.</li>
		<li>I complessi di occhio-cervello in un volume minimo di trasferimento (< 20 µ l) di PBS in almeno 250 µ l di fissativo. Mescolare pipettando su e giù la soluzione. Incubare per 35 min, sul ghiaccio. Nota: La stessa punta lubrificata preparata al punto 3.1.1 può essere utilizzata per questo trasferimento.</li>
		<li>Con la stessa punta della pipetta, trasferire i complessi di occhio-cervello in un contenente ~ 400 µ l di PBS. Mescolare pipettando su e giù la soluzione e incubare per 5-10 min sul ghiaccio, per lavare. Ripetere la fase di lavaggio almeno due volte. Nota: Complessi di occhio-cervello possono essere mantenute per diverse ore nel finale Lavaggio PBS, il ghiaccio, o a 4 ° C, prima di procedere al punto 3.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchiatura dell'anticorpo
	<ol>
<li>Per bloccare il tessuto prima di esposizione a soluzioni dell'anticorpo, è possibile trasferire i complessi di occhio-cervello a ~ 400 µ l di PBT. Utilizzare la punta lubrificata e una micropipetta di spostamento di aria P20 o P100 per il trasferimento. Incubare per 10-60 min, sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi adatti in PBT. Poiché complessi di occhio-cervello vengono incubati in 10 aliquote µ l di soluzione di anticorpo, è necessario che il volume preparato sarà una replica di 10.</li>
		<li>Aliquotare 10 µ l di soluzione di anticorpo in un pozzo pulito di un vassoio di 72 pozzetti microtiter (vedi discussione).</li>
		<li>Tagliare la punta di una pipetta P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura di punta a ~0.5 mm di raggio e lubrificare di pipettaggio PBT su e giù.</li>
		<li>Trasferire non più di 5 complessi di occhio-cervello, in un volume di < 3 µ l di PBS, in ogni 10 µ l di soluzione di anticorpo usando una micropipetta di spostamento di aria P10 e la punta lubrificata.</li>
		<li>Omogeneizzare la soluzione di anticorpo pipettando su e giù la soluzione. Non pipettare i complessi di occhio-cervello su e giù, onde evitare di danneggiare il tessuto.</li>
		<li>Per minimizzare evaporazione della soluzione dell'anticorpo, posizionare un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata nel vassoio microtiter e sigillare il vassoio (ad es., con il coperchio fornito). Incubare per una notte a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello dal vassoio microtiter in ~ 400 µ l di PBT in un piatto di vetro 9-saldata, per lavare. Utilizzare una micropipetta di P10 aria cilindrata e punta lubrificata PBT (preparare come descritto al punto 3.3.4). Mescolare pipettando su e giù la soluzione. Incubare per 5-10 min sul ghiaccio.</li>
		<li>Ripetere la fase di lavaggio almeno due volte. Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per trasferire i complessi di occhio-cervello tra soluzioni di lavaggio.</li>
		<li>Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo appropriati fluoroforo-etichetta anticorpi secondari in PBT come richiesto. 100 µ l di soluzione di anticorpo secondario è sufficiente per ogni batch di pupe di 6-10. Aliquota della soluzione di anticorpo secondario in un piatto di dissezione di vetro 9-saldata.</li>
		<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello in soluzione di anticorpo secondario. Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per il trasferimento.</li>
		<li>Incubare i complessi di occhio-cervello in soluzione di anticorpo secondario per 1-2 h a temperatura ambiente, o 3-5 h a 4 ° C. Per evitare di candeggio di fluorofori dalla luce, coprire la preparazione con un foglio. Nota: La durata ottimale di incubazione in soluzione di anticorpo secondario può differire secondo gli anticorpi primari e secondari utilizzati.</li>
		<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBT in un piatto di vetro 9-Pozzo, per lavare. Mescolare pipettando su e giù la soluzione. Incubare per 5-10 min sul ghiaccio. Questo passaggio di lavaggio deve essere ripetuto almeno due volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ancoraggio secondario
	<ol>
<li>Per un ancoraggio secondario, trasferire i complessi di occhio-cervello per almeno 200 µ l di fissativo e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente o 35 minuti a 4 ° C. Nota: Ancoraggio secondario si irrigidisce il tessuto dell'occhio, che agevola il montaggio (punto 3.5).</li>
		<li>Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per trasferire complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBT in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio, per lavare per 5 min.</li>
		<li>Ripetere la fase di lavaggio almeno una volta.</li>
		<li>Uso un P20 o una micropipetta P100 aria cilindrata e punta lubrificata PBT per trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBS in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio, di risciacquare per 1-2 minuti mantenere il tessuto in movimento di pipettaggio PBS, ma non il tessuto , su e giù per evitare che complessi di occhio-cervello da sedimentazione e aderendo al vetro piatto durante il PBS-risciacquo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaggio
	<ol>
<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 200 µ l di supporti di montaggio. Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per trasferire i complessi di occhio-cervello. Consentire al tessuto di equilibrare in media per 1-2 h di montaggio.</li>
		<li>Mettere una goccia di µ l di 5-8 di mezzi di montaggio fresco su un vetrino pulito.</li>
		<li>Tagliare una punta di P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura di punta a ~0.5 mm di raggio e utilizzare questo e una micropipetta di spostamento di aria P10 per trasferire i complessi di occhio-cervello in 5-8 µ l di supporti di montaggio nella goccia di supporti di montaggio sulla diapositiva.</li>
		<li>Utilizzare due aghi di tungsteno per separare gli occhi da lobi ottici. Pin di un complesso di occhio-cervello alla diapositiva con un ago di tungsteno robusto e affettare ogni occhio dal suo lobo ottico associato con un ago di tungsteno (Figura 2F).</li>
		<li>Utilizzare l'ago di tungsteno per manovrare ogni occhio alla superficie del vetrino microscopio con la superficie basale di ogni occhio adiacente alla diapositiva. Delicatamente abbassare un coprivetrino pulito sopra il tessuto e fissarlo con smalto. Nota: Organizzare gli occhi sulla diapositiva in modo che sono vicino a vicenda o in una linea faciliterà la microscopia successiva.</li>
		<li>Immagine le retine usando la microscopia confocale o fluorescente. Nota: Diapositive devono essere conservati a 4 ° C se non ripreso immediatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparazione del tessuto oculare per macchiarsi occidentale:
<ol><li>Sezionare 10-16 pupe (passi 2.1-2.9) con le seguenti modifiche: a) raccogliere e sezionare le pupe in due lotti, 10-15 min apart e b) sezionare in PBS completati con inibitori di proteasi e fosfatasi (PBS + pi).</li>
	<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello utilizzando un P20 o P100 aria micropipetta di cilindrata e lubrificati punta (preparato come descritto al punto 3.2.1) in ~ 400 µ l di PBS + pi in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio, risciacquare brevemente. Nota: Questo suggerimento lubrificato può essere utilizzato per passaggi successivi 4.3 e 4.4.</li>
	<li>Ripetere il passaggio sciacquare due volte.</li>
	<li>Trasferire tutti i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBS freddo ghiaccio + pi decantato su un piatto pulito nero per dissezione.</li>
	<li>Rimuovere ogni occhio dai lobi ottica utilizzando un ago di tungsteno robusto (per stabilizzare il complesso di occhio-cervello) e una lama di rasoio fine o microdissection forbici per taglio pulito ogni occhio dal lobo ottico. Nota: Gli occhi sono 'appiccicosi' in questa fase e possono aderire leggermente il piatto per dissezione. Questo è vantaggioso in quanto può aiutare a facilitare la rimozione degli occhi dai lobi ottica (vedi discussione).</li>
	<li>Nel PBS + pi sul piatto per dissezione, usando una lama di un bel paio di pinze ' sweep' tutti gli occhi in una 'pila'.</li>
	<li>Tagliare una punta di P10 con una lama di rasoio pulita per allargare l'apertura punta a ~0.5 mm di raggio e lubrificare il suggerimento-interni di pipettaggio Western tessuto Lysis Buffer (WTLB) su e giù.</li>
	<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello a 5 µ l di PBS + pi in una provetta da microcentrifuga 500 µ l. Utilizzare questa punta lubrificata e una micropipetta di spostamento di aria P10 per completare il trasferimento.</li>
	<li>Posizionare il tubo del microcentrifuge sul ghiaccio. Aggiungere 1 volume (5 µ l) di WTLB al campione e 10 µ l di tampone del campione concentrato della proteina x 2 (o 2,5 µ l di tampone del campione concentrato della proteina x 5). Mescolare con un tap.</li>
	<li>Vortice microcentrifuga tubo brevemente e spin giù campione utilizzando una desktop mini-centrifuga.</li>
	<li>Conservare il campione a-20 ° C fino all'analisi. Analizzare mediante protocolli standard.</li>
</ol>5. preparazione del tessuto dell'occhio per l'estrazione di RNA:
<ol><li>Indossare guanti, benchtop pulito, microscopio, strumenti di dissezione e nero piatto di dissezione prima con etanolo al 70% e, quindi, reagente di decontaminazione di RNAsi. Lasciare per asciugare.</li>
	<li>Sezionare il 30-40 pupe come descritti (passi 2.1-2.9) con le seguenti modifiche: a) raccogliere e sezionare pupe di 6-8 in lotti, 15-20 min apart; b) sezionare in PBS e c privo di nucleasi) isolare ciascun lotto di occhi separatamente, ma si accumulano tutti i tessuto retinico nel tubo del microcentrifuge stessa (punto 5.5). Nota: Avendo due persone contemporaneamente sezionare accelererà efficiente isolamento del tessuto di buon occhio.</li>
	<li>Per ogni batch, isolare i complessi di occhio-cervello (passi 2.1-2.9) e trasferimento in ~ 400 µ l di PBS privo di nucleasi in un piatto di vetro 9-Pozzo di sciacquare brevemente, il ghiaccio, utilizzando una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e la punta lubrificata (preparato come descritto al punto 3.1.2). Nota: Questo suggerimento lubrificato può essere utilizzato per passaggi successivi, 5.4, 5.5 e 5.8.</li>
	<li>Ripetere il passaggio sciacquare due volte.</li>
	<li>Trasferire i complessi di occhio-cervello in una goccia di fresco e 400 µ l di PBS privo di nucleasi ghiacciato su un nero pulito piatto di dissezione.</li>
	<li>Rimuovere ogni occhio dai lobi ottica utilizzando un ago di tungsteno robusto (per stabilizzare l'occhio cervello complesso) e una lama di rasoio fine o microdissection forbici per taglio pulito ogni occhio dal lobo ottico. Nota: Gli occhi sono 'appiccicosi' in questa fase e possono aderire leggermente il piatto per dissezione. Questo è vantaggioso in quanto può aiutare a facilitare la rimozione degli occhi dai lobi ottica (vedi discussione).</li>
	<li>Nel PBS nuclease-free sul piatto per dissezione, usando una lama di un bel paio di pinze ' sweep' tutti gli occhi in una 'pila'.</li>
	<li>Trasferire gli occhi in una provetta sterile da microcentrifuga RNAsi-libera e flash-congelamento in azoto liquido.</li>
	<li>Ripetere la dissezione (passaggi 5.3-5.8) di ciascun lotto di pupe. Trasferire ogni batch degli occhi nel tubo del microcentrifuge stesso che è stato mantenuto in azoto liquido (punto 5.5) per accumulare tutti gli occhi in una provetta.</li>
	<li>Conservare i campioni a-80 ° C fino all'estrazione di RNA.</li>
</ol>

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<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li>
<li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li>
<li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCP-1%2C+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li>
<li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo di dissezione di pupal occhio della drosofila qui descritto consente per l'isolamento dei complessi di occhio-cervello di 6 a 10 entro 10-15 min. Tuttavia, pratica e pazienza sono essenziali al fine di padroneggiare la tecnica di dissezione e migliorare la qualità e la velocità delle dissezioni. Questa volta breve dissezione assicura che ogni occhio è circa lo stesso stadio di sviluppo, riducendo la variabilità nell'espressione di gene o fenotipo delle retine in un set di dati. Mentre protocolli altern...

La retina di Drosophila è composta da circa 750 ommatidi circondati da cellule del pigmento, disposti in un nido d'ape della grata1,2,3,4. Ogni ommatidium contiene otto neuroni del fotoricettore, quattro lente-secrezione delle cellule cono e due cellule del pigmento primarie. Che circonda ogni ommatidium è cellule produttrici di pigmento di grata e gruppi di setole sensoriali. Grazie alla sua natura post-mitotico e stereotipata disposizione esagonale, retina pupal Drosophila fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici compreso cellula adesione5,6, 7,8,9,10 e apoptosi11,12,13,14,15.
Diversi protocolli pubblicati utilizzano aria pressione per estrarre complessi di occhio-cervello da Drosophila pupe16,17,18. Il protocollo descritto qui invece utilizza strumenti di microdissection per attentamente e precisamente isolare complessi di occhio-cervello con l'obiettivo di ottenere tessuto retinico intatto. Questo è fondamentale se le retine sono da utilizzare per morfologica, proteina, o espressione genica analizza quanto stress cellulare o la morte, che potrebbe modificare l'espressione di gene o fenotipo cellulare può provocare danni alla retina. Inoltre, dopo la pratica, da 6 a 10 complessi di occhio-cervello possono essere isolati in 10-15 min, facilitando l'obiettivo di minimizzare la variabilità nell'età e Stadio di sviluppo del tessuto oculare dissecata.
La fissazione, immunostaining e intero-supporto protocollo descritto di seguito è adatto per la preparazione di Drosophila occhi per microscopia fluorescente. Retine possono essere incubate con anticorpi targeting per le proteine di interesse. Ad esempio, gli anticorpi ai componenti di giunzione dei adherens possono essere utilizzati per visualizzare le circonferenze apicale delle cellule, in modo che caratteristiche tra cui il tipo delle cellule, forma e disposizione possono essere valutati19. Prima della fissazione, gli occhi possono essere spaccati invece dal cervello allo scopo di estrarre la proteina per analisi occidentale, o RNA per l'uso in qRT-PCR o RNA-sequenziamento.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Software di elaborazione immagini</td></tr><tr><td>Stecche di bambù, 6"&nbsp;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerolo fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Piatto</td><td></td><td></td> da dissezione nero <td>Capsula di Petri in vetro riempita fino al bordo con SYLG170 o SYLG184 (colorato in nero con polvere di carbone finemente macinata). Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 24-48 ore.</td></tr><tr><td></td><td>Portalama Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>compresse cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA complete</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale (Zeiss LSM 501)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>o microscopio simile</td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietil (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila terreni alimentari, ricchi di sostanze nutritive&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7,5% saccarosio, 15% glucosio, 2,5% agar, 20% lievito di birra, 5% peptone, 0,125% MgSO4.7H2O, 0,125% CaCl22H20</td></tr><tr><td>Drosophila terreni alimentari, ricetta standard</td><td></td><td></td><td>della farina di mais del centro di distribuzione di Bloomington. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> fissativa <td>4% formadeide in PBS, pH 7,4.</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza (microscopio TCS SP5 DM)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>o microscopio simile</td></tr><tr><td>Pinze&nbsp;</td>Le pinze <td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>devono essere affilate frequentemente.</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in vetro a 9 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Conosciuto anche come piastre a 9 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in vetro (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in vetro</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio versione software 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini per la quantificazione dei Western blot.</td></tr><tr><td>Tampone per campioni Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>2X tampone per campioni di proteine concentrate, integrare con beta mercaptoetanolo secondo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Indicatore di corsia che riduce il tampone del campione&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td><td>5X tampone per campioni di proteine concentrate.</td></tr><tr><td>Tubi di microcentriguro&nbsp;</td>Forbici per microdissezione <td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Vassoi per micropozzetti (72 x 10 &; L pozzetti)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td> di montaggio <td>0,5% N-propilgallato e 80% glicerolo in PBS</td></tr><tr><td>N-propilgallato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS privo di nucleasi (PBS in 0,1% DEPC, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Aggiungere un volume appropriato di DEPC al PBS, mescolare bene e incubare per una notte a temperatura ambiente agitando costantemente. Autoclavare per almeno 20 minuti. Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Preparare secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS più inibitori della proteasi e della fosfatasi)</td><td></td><td></td><td>10mM NaF, 1mM beta-glicerolo fosfato e 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7,4. &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0,15% TritonX e 0,5% albumina sierica bovina in PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Porta spilli</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario: capra anti-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>Per Western blotting. Utilizzato in 1:3000</td></tr><tr><td>Anticorpo primario: coniglio anti-clivaggio Dcp-1</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9578S</td><td>Per l'immunofluorescenza. Utilizzato in 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo primario: ratto anti-DEcad</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>DCAD2</td><td>Per l'immunofluorescenza. Utilizzato a 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo primario: ratto anti-DEcad</td><td>DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; Dono di Tadashi Uemura. Usato a 1:100.</td></tr><tr><td>Kit di estrazione dell'RNA: Relia Prep Kit Miniprep per tessuti di RNA&nbsp;</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di decontaminazione Rnasi (RNase Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Strumenti di scienza</td><td>fine 10050</td><td>Rompere un piccolo pezzo di lama di scapel e fissarlo nel supporto della lama.</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario: 488-coniugato&nbsp; asino anti-ratto IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>Per l'immunofluorescenza. Utilizzato in 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario: capra coniugata cy3-conjugata anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>Per immunofluorescenza. Utilizzato in scala 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario: capra coniugata HRP-coniugata IgG (H+L)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>7077</td><td>Per Western blotting. Utilizzato a 1:3000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario: IgG (H+L) di coniglio coniugato con HRP anti-capra Jackson</td> <td>ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>Per Western blotting. Utilizzato a 1:3000</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro (NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione stereo (M60 o M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>o microscopio simile</td></tr><tr><td>Sylgard (nero)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (trasparente)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Colore nero con polvere di carbone finemente macinata</td></tr><tr><td>Tessuto: Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloridrato pH7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Ago di tungsteno, fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Inserire nel supporto del perno</td></tr><tr><td>Ago di tungsteno, robusto</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>Inserire nel supporto del perno</td></tr><tr><td>WTLB (tampone di lisi tissutale occidentale)</td><td></td><td></td><td>150 mM di NaCl, 1,5% di Triton X-100, 1 mM di EDTA, 20% di glicerolo, 10 mM di NaF, 1 mM di beta-glicerolo fosfato e 1 mM di Na3VO4 in 50mM di Tris-HCl (pH 7,5). Integrare con un tavolo da cocktail di proteasi cOmplete per 10 ml di soluzione.</td></tr><tr><td>Pasta di lievito</td>(<td>supermercato locale)</td><td></td><td>Circa 2 cucchiai di lievito secco attivo di Fleischmann (o simile) sciolto in ~20 ml di H2O distillato</td></tr></tbody></table>

dissezione della drosofila pupal retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del rna

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

La Drosophila pupal retina fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici durante lo sviluppo. In questa carta, presentiamo un protocollo affidabile per la dissezione della drosofila delicato pupal retina. Il nostro approccio chirurgico utilizza strumenti di microdissection prontamente disponibili per aprire pupe ed estrarre con precisione complessi di occhio-cervello. Possono essere fissi, sottoposto ad esame immuno-istochimico e retine poi montate su vetrini da microscopio e ripreso se l'obiettivo è quello di rilevare strutture cellulari o subcellulari. In alternativa, retine unfixed possono essere isolate dal tessuto di cervello, lisate in buffer appropriato e utilizzate per l'estrazione proteica gel elettroforesi o mRNA (valutare espressione della proteina o del gene, rispettivamente). Pazienza e pratica significativa potrebbe essere necessario padroneggiare il protocollo di microdissection descritto, ma una volta imparato, il protocollo consente relativamente rapido isolamento delle retine principalmente intatta.

L'occhio di pupa è un tessuto facilmente accessibile che serve come un eccellente modello per studiare i processi di sviluppo che morfogenesi in auto. Qui, noi abbiamo dissecato retine e utilizzato l'immunofluorescenza per rilevare le giunzioni dei adherens apicale (Figura 3A, C) o il caspase Dcp-1 (Figura 3D) che si attiva durante l'apoptosi (Figura 3)25. Questi approcci permettono di osserv...

Questa carta presenta un metodo chirurgico per la dissezione della drosofila retine pupale insieme a protocolli per il trattamento del tessuto per esame immuno-istochimico, analisi occidentale ed estrazione di RNA.

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Questo protocollo è significativo perché questo è un metodo efficiente per l'isolamento del tessuto oculare pupale di Drosophila per molteplici applicazioni a valle. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la rapida dissezione di un gran numero di occhi pupali senza danneggiare il tessuto. La dissezione della retina pupale Drosophila sarà una sfida per i principianti.Praticare la tecnica è il modo migliore per migliorare la velocità delle dissezioni e la qualità dei risultati. Dopo aver posizionato le pupe di Drosophila su un piatto di sezionazione nera, posare un nuovo pezzo di nastro a doppia mano sul piatto sezionato, lontano dalle pupe, e utilizzare un paio di forcep per posizionare con cura il lato dorsale delle pupe sul nastro. Posizionare il piatto al microscopio stereo e utilizzare le forcep per rimuovere l'opercolo di ogni pupa.Usa le forbici a microdisezione per tagliare ogni custodia pupale, consentendone l'apertura per rivelare la testa, il torace e il segmento addominale anteriore e fissare i bordi della custodia pupale al nastro bi lateralmente. Perforare l'addome di ogni pupa con forcep affilate e rimuovere la pupa dal suo caso pupale. Posizionare la

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

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Biologia dello sviluppo

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

Un approccio standard per la preparazione degli...

Preparazione di adulti Drosophila Occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

Questo video descrive come sezionare e isolare il complesso occhio-cervello dalle pupe di Drosophila. Il protocollo presentato dimostra che la procedura produce tessuto di alta qualità, compatibile, ad esempio, con l'immunocolorazione e con altri esperimenti di espressione genica.

Dissezione del complesso occhio-cervello da pupe di mosca: un metodo per isolare il tessuto retinico

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire ai ricercatori di eseguire la dissezione, l'immunocolorazione e il montaggio di dischi oculari pupali da Drosophila melanogaster di qualsiasi età.

Dissezione e Montaggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; pupa Dischi Eye

La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).

Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Qui, presentiamo un protocollo per tappa e sezionare lo sviluppo di tessuto olfattivo da specie di Drosophila . Il tessuto dissecato più tardi può essere utilizzato per le analisi molecolari, quali quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) o RNA sequenziamento (RNAseq), così come in vivo analisi quali immunoistochimica o in situ ibridazione.

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

Impara la dissezione della retina pupale di Drosophila melanogaster per immunoistochimica, analisi occidentale ed estrazione di RNA. Questo metodo efficiente preserva l'integrità tissutale per applicazioni downstream multiple.

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

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