Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare
24 luglio 2019
Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.
Questo protocollo mostra che le radiazioni influenzano le proprietà della matrice extracellulare del tessuto adiposo nel cuscinetto di grasso mammario murino. L'aggiunta di radiazioni in un modello di decellularizzazione non è mai stata fatta prima. Questa tecnica utilizza diversi passaggi di lavaggio che servono ciascuno a uno scopo chimico unico nel processo di decellularizzazione.
La specificità di questa tecnica consente lavaggi chimici più delicati, per preservare meglio le proprietà tissutali. La ricaduta del cancro al seno si verifica dopo la terapia, specialmente nei casi tripli negativi. Valutare come la matrice extracellulare irradiata altera il comportamento delle cellule tumorali porterà a importanti scoperte sui meccanismi di ricorrenza.
Dopo aver irradiato i campioni, utilizzando una sorgente di cesio, trasferire le MFP irradiate e i mezzi RPMI completi in un armadio di biosicurezza. Riempire piatti di sei centimetri o 10 centimetri con mezzi sufficienti per immergere l'MFP. Incubare a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica, per due giorni.
In primo luogo, posizionare l'MFP in piatti di sei centimetri con cinque millilitri di soluzione Trypsin-EDTA. Spruzzare e pulire i piatti con il 70% di etanolo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Utilizzare filtri da 0,7 millilitri per lavare le MFP con acqua deionizzata, versando acqua sul tessuto tre volte.
Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro. Successivamente, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Posizionare i tessuti essiccati in un becher pre-autoclavato, contenente una barra di agitazione di dimensioni appropriate e coprire i tessuti con 60 millilitri di 3%t-ottilfenossipotetossietanolo per grammo di tessuto.
Mescolare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi gettare il contenuto del becher in un colino. Risciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti.
Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Riposizionare i tessuti e le barre di agitazione negli stessi becher e coprirli con 60 millilitri di acido deossicolico al 4% per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino a rete, sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti. Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.
Asciugare brevemente il tessuto risciacquato su una delicata salvietta e pesarlo. Mettere i tessuti essiccati nello stesso becher, insieme all'acqua fresca deionizzata, integrata con 1%penicillina-streptomicina. Coprire saldamente il becher con pellicola di paraffina e lasciare a 4 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo scolare il contenuto del becher in un colino, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Quindi, posizionare l'MFP nello stesso becher con una barra di agitazione di dimensioni appropriate. Coprire il tessuto con 60 millilitri di una soluzione contenente il 4%etanolo e lo 0,1% di acido peracetico per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per due ore. Gettare il contenuto del becher in un colino da 0,7 millimetri. Utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher.
Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di 1X PBS per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta.
Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino di 0,7 millimetri. Utilizzando le forcelle, massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Asciugare brevemente il tessuto lavato su una delicata salvietta e pesarlo.
Gettare il tessuto e il contenuto in un colino e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e coprire i tessuti con 60 millilitri di 100%n-propanolo per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per un'ora.
Quindi, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino di 0,7 millimetri e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo.
Trasferire il tessuto in un tubo etichettato da 15 millilitri e congelare a -80 gradi Celsius durante la notte. In primo luogo, riempire un contenitore poco profondo con azoto liquido. Rimuovere i campioni dal congelatore e pesare ogni MFP lyophilizzato.
Posizionare un campione nella malta, utilizzare un guanto criogenico per tenere la malta nell'azoto liquido. Quindi, utilizzare un pestello, attaccato a un trapano mentre si tiene a mano, per fresare il campione. Fresare a intervalli di un minuto per controllare l'avanzamento e rimuovere la mano guantata dall'azoto liquido.
Ripetere questo processo di fresatura per tutti i campioni, assicurandosi di spruzzare e pulire la malta e il pestello con etanolo tra ogni campione. Conservare i campioni in polvere in tubi da 15 millilitri a -80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. Per iniziare, rimuovere i campioni dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente.
Mentre i campioni vengono scongelati, mescolare la pepsina in acido cloridrico per formare una soluzione di Pepsin-HCL. Quindi, aggiungere la polvere di campione e la soluzione Pepsin-HCL a un tubo da 15 millilitri, aggiungere una piccola barra di agitazione e mescolare per 48 ore. Dopo questo, metti i tubi sul ghiaccio per cinque minuti.
Aggiungere 10X PBS a ciascun campione, in modo che la soluzione finale abbia una concentrazione di 1X PBS. Quindi, aggiungere il 10% di volume/volume, 0,1 idrossido di sodio molare ad ogni soluzione, per raggiungere il pH 7,4, utilizzando carta pH per testare ogni soluzione singolarmente. Utilizzando una soluzione di gel pH 7.4, rimescolare la GFP pellettata e la luciferasi etichettate 4T1 celle a una concentrazione di 500, 000 o 1.000.000 di cellule per millilitro di soluzione di gel.
Aggiungere 16 microlitri di soluzione di cellule gel ad ogni pozzo di uno scivolo da camera da 16 po 'e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di supporti RPMI completi a ciascun pozzo. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Quindi, usa un microscopio a fluorescenza per osservare le cellule a una lunghezza d'onda di eccitazione di 519 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 618 nanometri. In questo studio vengono studiati i normali effetti delle radiazioni tissutali, utilizzando idrogel a matrice extracellulare. La colorazione di ematossilina ed eosina è usata per confermare la decellularizzazione, attraverso la perdita di nuclei e altre tracce di DNA.
Mentre la colorazione Oil Red O viene utilizzata per valutare il contenuto lipidico e confermare la ritenzione di una morfologia della dipasite. Le proprietà reologiche degli idrogel ECM sono valutate a 37 gradi Celsius. Il modulo di stoccaggio è superiore al modulo di perdita per tutte le condizioni, dimostrando una formazione stabile di idrogel.
GFP e luciferasi etichettate 4T1 cellule carcinoma mammarie vengono quindi incapsulate negli idrogel. La proliferazione cellulare viene esaminata mediante microscopia a fluorescenza, mediante misurazioni dell'illuminescenza e colorazione di vitalità, 48 ore dopo l'incapsulamento. Gli idrogel irradiati mostrano una tendenza crescente nella proliferazione delle cellule tumorali.
Il coniugato di phalloidina viene utilizzato per visualizzare l'F-Actin nelle cellule incapsulate. Ricordarsi di raffreddare la malta prima di posizionare il tessuto all'interno del mulino, una malta calda può portare a fresatura incompleta. Prestare attenzione quando si maneggiano n-propanale e pepsina, solo aprire n-propanali e altri agenti decellularizzanti sotto una cappa chimica.
Se possibile, pesare la pepsina sotto una cappa chimica, in quanto vi è il pericolo di inalazione. I cambiamenti di composizione dell'ECM dopo l'irradiazione e la decellularizzazione possono essere valutati utilizzando la spettrometria di massa e la spettroscopia Raman. Inoltre, la struttura in fibra degli idrogel ECM può essere analizzata scansionando la microscopia elettronica.
Questo metodo ha il potenziale per essere ampliato per esaminare gli effetti delle radiazioni non solo sulle cellule tumorali ma anche sulle cellule immunitarie, così come sui tessuti che sperimentano danni da radiazioni, a causa della terapia. Questa tecnica di decellularizzazione consentirà ai ricercatori di valutare le proprietà della matrice extracellulare del tessuto dopo la radiazione, che è un'importante opzione di trattamento nella maggior parte dei tumori.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel dei cuscinetti di grasso mammario murino dopo l'irradiazione ex vivo. La tecnica consente lavaggi chimici più delicati per preservare meglio le proprietà del tessuto, il che è cruciale per studiare gli effetti delle radiazioni sulle proprietà della matrice extracellulare.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Oncologia
Sfondo
- Le radiazioni influenzano le proprietà della matrice extracellulare del tessuto adiposo.
- I modelli di decellularizzazione non avevano precedentemente incorporato le radiazioni.
- La recidiva del cancro al seno è una preoccupazione significativa, specialmente nei casi triplo negativi.
- Comprendere gli effetti della matrice extracellulare irradiata può rivelare i meccanismi di recidiva.
Obiettivo dello studio
- Valutare come le radiazioni influenzano la matrice extracellulare nei cuscinetti di grasso mammario murino.
- Sviluppare un metodo di decellularizzazione che preservi le proprietà del tessuto.
- Investigare l'impatto della matrice extracellulare irradiata sul comportamento delle cellule tumorali.
Metodi utilizzati
- Protocollo di decellularizzazione con specifici passaggi di lavaggio.
- Irradiazione ex vivo dei cuscinetti di grasso mammario murino.
- Formazione di idrogel dal tessuto decellularizzato.
- Valutazione delle proprietà della matrice extracellulare dopo l'irradiazione.
Principali risultati
- Il protocollo decellularizza con successo i cuscinetti di grasso mammario murino.
- Le radiazioni alterano le proprietà della matrice extracellulare.
- Lavaggi chimici più delicati preservano le caratteristiche critiche del tessuto.
- Le intuizioni acquisite possono informare strategie per affrontare la recidiva del cancro al seno.
Conclusioni
- Questo studio introduce un nuovo metodo per studiare il tessuto adiposo irradiato.
- I risultati possono portare a una migliore comprensione dei meccanismi di recidiva tumorale.
- L'approccio può essere applicato a ulteriori ricerche nella biologia del cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding how radiation alters the extracellular matrix in healthy breast tissue provides mechanistic insights into local tumor recurrence, a critical challenge in triple-negative breast cancer therapy. This method enables in vitro modeling of irradiated tissue microenvironments to de-risk target validation and assay development by linking ECM changes to tumor cell proliferation and cytoskeletal reorganization. It supports predictive confidence in preclinical models by capturing stromal contributions to therapy resistance and disease relapse.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how irradiated stromal ECM influences tumor cell behavior to clarify microenvironmental contributions to therapeutic resistance.
- Operational Value: Enables functional validation of stromal targets by assessing tumor cell proliferation and cytoskeleton organization in physiologically relevant hydrogels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible hydrogels with quantifiable rheological and biochemical outputs for compound screening in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Supports assay scalability and reuse through lyophilized ECM powder storage and controlled rehydration for consistent experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant stromal-tumor interactions post-radiation to evaluate mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by preserving native ECM architecture and composition after irradiation and decellularization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable stromal platform that connects radiation-induced ECM changes to tumor cell phenotypes, informing lead identification and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal-mediated resistance mechanisms by enabling controlled comparison of irradiated versus non-irradiated ECM on tumor cell behavior.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with measurable proliferation and cytoskeletal readouts for evaluating modulator effects in a standardized microenvironment.
- Analytics: Provides quantitative outputs including fluorescence intensity, luminescence, and rheological parameters to compare conditions and assess stromal impact on tumor phenotypes.
- Translational Research: Models stromal-tumor crosstalk in irradiated tissue to align with preclinical evaluation of agents targeting microenvironmental drivers of recurrence.
- Enterprise Reuse: Enables platform standardization through lyophilized ECM storage, allowing reproducible hydrogel generation across teams and timepoints for longitudinal stromal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling stromal contributions to tumor recurrence and reducing mechanistic ambiguity in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization, irradiation, and hydrogel formation steps with defined washing and reagent parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stromal targets that modulate tumor cell behavior post-radiation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on efficacy in irradiated stromal contexts that mimic clinical relapse scenarios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, hydrogel handling, and fluorescence-based cell viability and cytoskeleton assays.
- Depends on access to irradiation equipment (e.g., cesium source), rheometers, and microscopy systems for proliferation and F-actin imaging.
- Necessitates cross-team standardization of tissue sourcing, irradiation dosing, and hydrogel preparation to ensure experimental consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other tissue types or stromal sources beyond murine mammary fat pads.
- Limited by the murine origin of the ECM, which may require validation in human-relevant stromal models for translational extrapolation.
