Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

Il tè è una delle bevande più popolari in tutto il mondo. I pesticidi sono talvolta usati per proteggere le piante da tè dai parassiti. Alcuni pesticidi sistemici possono essere fatti per questo dagli enzimi nell'albero del tè.

E poi integrato attraverso reazioni di ossidazione, idrolisi o riduzione. Le colture di sospensione delle cellule vegetali possono essere utilizzate come, facilmente per studiare il comportamento del metabolismo delle piante dei pesticidi. Questo metodo ha diversi vantaggi.

In primo luogo, può essere utilizzato in condizioni di microrganismi liberi, evitando così l'interferenza della degradazione dei pesticidi causata dai microbi. In secondo luogo, può fornirci materiale costante in qualsiasi momento. Infine, può anche essere usato facilmente per confrontare le teorie del comportamento dei pesticidi in un singolo esperimento.

In questo studio, stabiliamo colture di sospensione delle cellule del tè da colori variabili delle foglie di tè. Lo stato ottimale delle colture delle sospensioni cellulari è stato quindi utilizzato per confrontare il comportamento di dissipazione di sei pesticidi. Questo esperimento sarà condotto da Jiao Weiting e Ge Guoqin.

Questa è la nostra plantlet sterile da tè che funziona come fonte di espianto. Tagliare lungo l'ala centrale di una foglia sterile usando le forbici. E poi, suddividere ogni metà in piccoli pezzi di circa 0,3 per 0,3 centimetri in una piastra di Petri.

Posizionare gli espianto sterili su un supporto visivo MS contenente 2, 4D e KT. Sei espianto possono essere collocati in un pallone da 300 millilitri. Coltura la foglia espianta a una temperatura costante di 25 gradi Celsius al buio. Dopo 28 giorni, selezionare la prima generazione di callo indotto e quindi trasferirlo in pallone fresco.

Acquisire il callus libero e variabile dopo tre o quattro sottoculture. Tagliare quelli grandi, calli variabili e sciolti dal mezzo solido in piccoli pezzi utilizzando una lama chirurgica sterile in condizioni sterili. Siamo circa tre grammi dei piccoli pezzi di un callo.

Inserire il callo in B5 contenente 2, 4D e KT. Coltura della sospensione a celle liquide a temperatura costante nell'incubatrice di scuotimento al buio. Dopo sette o dieci giorni di coltura, rimuovere il pallone della coltura e lasciarli riposare per alcuni minuti. Prendi il supernatante poiché il sedimento qui costringerà la cultura a un mezzo fresco.

Rimuovere i calli di grandi dimensioni precipitati. Ottenere l'ultima coltura di sospensione cellulare ben curata dopo quattro o tre cicli di sottocoltura di 28 giorni ciascuno. Mantenere un campione di cellule viventi a cento gradi Celsius per dieci minuti come cella di controllo prima della colorazione di vitalità.

Centrifugare tutte le impostazioni di sospensione cellulare per otto minuti a 6.000 G.Rimuovere il supernatante prima di sospendere le cellule in 5 millilitri di tampone PBS e scuoterlo per un minuto a mano. Aggiungere 2,5 millilitri della soluzione TTC e agitare di nuovo a mano. Incubare la miscela per un'ora in un'incubatrice in piedi a 13 gradi Celsius.

Aggiungere un'aliquota di quattrocento microlitri per sterilizzare la soluzione stock di tutti i neonicotinoidi Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid e Imideproxase. Tutto alla prima fase organica. Dimetoato e ometoato rispettivamente nelle colture di sospensione cellulare.

Campioni di coltura di sospensioni cellulari con insetticidi a temperatura costante e velocità dell'incubatrice tremante. Prelevare i campioni in giorni diversi. Per testare il campione contenente un neonicotinoide, rimuovere un'aliquota di 1 millilitro della coltura cellulare omogenea.

Mettilo in un tubo di centrifuga di plastica da 1,5 millilitri e centrifugalo a 4.000 G per due minuti. Passare il supernatante attraverso una membrana filtrante da 0,22 micrometri prima dell'analisi da parte di HPLC-UV e UPLC QTOF. Per testare il campione, continuare nella prima fase organica.

Rimuovere un'aliquota di 500 microlitri della coltura cellulare e posizionarsi in un tubo di centrifuga da 35 millilitri o in un tubo di centrifuga in plastica da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,1 grammi di cloruro di sodio e cinque millilitri estrarre il solvente nel tubo di centrifuga da 35 millilitri dei campioni da 500 microlitri. Vortice la miscela per un minuto.

E poi lasciare riposare per 10 minuti. Prendere 2,5 millilitri di supernatante in un tubo di vetro da 10 millilitri ed evaporare a quasi secchezza usando un evaporatore di azoto a 14 gradi Celsius. Sciogliere il residuo con un millilitro acetone.

Vortice per un minuto, passalo attraverso una membrana filtrante di 0,22 micrometri prima dell'analisi da parte di GC-FPD. Metti cinque piante in vasi di plastica da quattro litri per quindici giorni. Aggiungere zero microgrammi per millilitro o 100 microgrammi per millilitro di Thiamethoxam o dimetoaxe in vasi di plastica, rispettivamente.

Preparare il campione di pianta intatto secondo il metodo precedente, ad eccezione del pre-ammollo e quindi analizzare per spettrometria di massa Orbitrap. Utilizzare un HPLCUV per rilevare il contenuto e i prodotti metabolici del Thiamethoxam e dell'Acetimoprid a lunghezze d'onda di 254 nanometri, e di Imidacloprid e Imideproxase a 270 nanometri. Rilevare il contenuto di dimetoato e ometoato mediante GC-FPD utilizzando una colonna tubolare.

Rilevare i metaboliti degli insetticidi nella coltura cellulare utilizzando l'UPRC QTOF con una colonna Carbon-18. Rilevare i metaboliti degli insetticidi nell'estratto vegetale di prova utilizzando la spettrometria di massa UPLC Orbitrap. Il callo di una plantlet sterile ha una minore doratura di contaminazione ma una maggiore induttività quella del callo dalle foglie di tè raccolte.

Il callo derivato da foglie sterili era sempre giallastro brillante, mentre il callo derivato dalle foglie raccolte era bianco con macchie marroni. Quando la concentrazione di KT era di 0,1 milligrammi per litro, il callo era di colore giallastro e sciolto nella consistenza. Il tasso di crescita del callo era il più alto, fino al 61,5% quando la concentrazione di 2, 4-D era di un milligrammo per litro con la concentrazione di KT era di 0,5 milligrammi per litro.

I dati di crescita del callo erano i migliori e il tasso di crescita del callo era il più alto raggiunto il 46,9%Pertanto, la migliore combinazione di homent vegetale era di un milligrammo per litro di 2, 4-D e 0,1 milligrammi per litro di KT per la crescita del tea callus. Il callo copriva completamente le foglie con la quarta sottocultura, e quando il ciclo di sottocultura era di 28 giorni. Il callo era cresciuto vigorosamente con colore giallastro e consistenza sciolta e senza doratura.

Dopo aver confrontato i dati lordi del callo e il colore della sospensione cellulare, il mezzo liquido B5 era più adatto per la coltura di sospensioni cellulari. Il valore OD delle impostazioni cultura della sospensione cellulare è stato utilizzato per rappresentare la quantità di crescita cellulare. Durante i 75 giorni di coltivazione, il rapporto di 15 grammi per 40 millilitro aveva un valore di OD significativamente superiore a quello degli altri due rapporti.

La vitalità cellulare all'interno della coltura delle sospensioni delle celle da tè è stata testata dalla colorazione TTC. Il composto TTC incolore può essere convertito in formadina rossa dai deidrogenasi nei mitocondri delle cellule viventi, ma il colore non può essere cambiato nelle cellule morte. E questo è l'intero processo di creazione di una coltura di sospensione delle cellule del tè.

Questo è il primo studio comparativo del metabolismo di diversi pesticidi nel tè utilizzando una tecnica di coltura delle sospensioni cellulari. Sono stati identificati diversi metaboliti dei pesticidi e alcuni di essi sono stati ulteriormente studiati nelle piante da tè tenute. Questo nuovo metodo potrebbe servire come modello per gli studi metabolici sui pesticidi nel tè o in altre piante.