Name: Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Scopri come solubilizzare proteine di seta di ragno ricombinante in acqua senza solventi organici. Questo metodo semplice preserva le proprietà del materiale e consente applicazioni innovative in biotecnologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori vorrebbero ringraziare con gratitudine i finanziamenti dell'iniziativa Utah Science and Technology Research (USTAR).

1. preparazione della miscela di seta di ragno ricombinante da scorte proteiche liofilizzate
<ol><li>Determinare la formulazione e il volume necessari per le formazioni di materiale previste. Le formulazioni tipiche vanno dal 3% (w/v) fino al 15% (p/v). Utilizzando questa selezione, calcolare l'rSSp, le concentrazioni e i rapporti appropriati.<ol>
<li>Utilizzare le seguenti formulazioni per preparare ogni materiale descritto nel presente protocollo: idrogel/spugne/lyogel, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; film/rivestimenti, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adesivi, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibre, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2. Nota: anche se la maggior parte delle formulazioni sono meglio montate per forme e materiali specifici, c'è una vasta gamma di formulazioni che spesso possono sovrapporsi. Inoltre, i materiali rSSp finali possono essere adattati anche durante la formazione e l'elaborazione per produrre le proprietà desiderate. In generale, ogni proteina richiederà l'analisi di parametri appropriati o utili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare un flaconcino di coltura in vetro borosilicato autoclavabile da 8 mL con un tappo a vite rivestito in gomma.</li>
	<li>Rimuovere il tappo e posizionare il flaconcino vuoto su una bilancia analitica. Tarare la massa del flaconcino vuoto in modo che la bilancia legga la massa zero.</li>
	<li>Aggiungere la polvere di rSSp liofilizzata desiderata al flaconcino vuoto per ogni materiale specifico.<ol>
<li>Utilizzare queste masse specifiche di ogni tipo di proteina per ogni materiale, quando si prepara un 2 mL di soluzione: idrogel/spugne/lyogel, 60 mg di MaSp1 e 60 mg di MaSp2; film/rivestimenti, 80 mg di MaSp1 e 20 mg di MaSp2; adesivi, 120 mg di MaSp1 e 120 mg di MaSp2; fibre, 200 mg di MaSp1 e 50 mg di MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere la quantità desiderata di acqua ultrapura, almeno 2 mL, al flaconcino che contiene già le polveri rSSp ponderate. Nota: per tutte le procedure di solvazione è consigliato un volume minimo di 2 mL.</li>
	<li>Sigillare il tappo del flaconcino e agitare vivacemente il contenuto per creare una miscela di rSSp dispersa e omogenea che è ora pronta per la procedura di solvazione. Ulteriori approcci di omogeneizzazione come la sonicazione o la miscelazione della girante possono essere impiegati con, o in aggiunta, la miscelazione Vortex.</li>
</ol>2. solvazione della seta del ragno ricombinante
Attenzione: durante la procedura di solvazione vengono generate alte manches e pressioni. Per questo processo sono necessari adeguati dispositivi di protezione individuale, in particolare occhiali, maniche lunghe e guanti resistenti al calore.
<ol><li>Eseguire un controllo finale del flaconcino, o recipiente, tappo per assicurarsi che sia stato saldamente e saldamente serrati. Quindi trasferire la miscela rSSp sospesa in un forno a microonde convenzionale. Nota: le unità a microonde all'interno della gamma di potenza di 700 a 1.500 watt, in possesso di capacità camera interna più piccole, e piattaforme rotanti sono raccomandati per fornire migliori condizioni di solvazione.</li>
	<li>Iniziare il funzionamento del forno a microonde con 5 s scoppia a piena potenza. Dopo ogni scoppio aprire brevemente la porta e mescolare accuratamente/turbinare il flaconcino per evitare di sedimentare e mantenere la miscela sospesa.</li>
	<li>Ripetere questo processo a microonde fino a quando la miscela e/o la soluzione non ha ottenuto una temperatura di almeno 130 ° c, se misurata con un termometro a infrarossi direttamente contro la soluzione contenente porzioni del flaconcino. Ripetere questo processo fino a quando tutti i particolati solidi sono stati completamente disciolti e non sono più visibili. Nota: si suggerisce di consentire al flaconcino e alla soluzione di raffreddare occasionalmente, soprattutto se la formulazione ha un'alta concentrazione di rSSp presente. Temperature superiori a 200 ° c aumentano il rischio di rottura della guarnizione del flaconcino. Particolare attenzione deve essere prestata anche per evitare che la miscela/soluzione surriscaldata tocchi la guarnizione, il che comporterà anche un guasto di contenimento del flaconcino.</li>
	<li>Dopo aver risolto con successo la miscela di rSSp in una soluzione, consentire la temperatura della soluzione e il tappo del flaconcino per raffreddare al di sotto di 100 ° c (punto di ebollizione) prima dell'apertura.</li>
</ol>3. idrogel
<ol><li>Preparare un idrogel dalla soluzione dopo averlo rimosso dal forno a microonde e permettendo di raffreddare e impostare. Lanciare l'idrogel in geometrie specifiche prima di consentirlo di raffreddare completamente. Nota: diversi RSSP richiederanno diverse quantità di volte per passare a un idrogel. Ad esempio, le sequenze MaSp2-like tendono a formare idrogel più rapidamente rispetto alle sequenze simili a MaSp1. Le concentrazioni proteiche, la salinità e il pH influenzano direttamente anche il tasso di transizione verso un idrogel.</li>
</ol>4. spugne
<ol><li>Preparare una spugne RSSP consentendo prima la soluzione solvatato primaria di formare un idrogel.</li>
	<li>Mettere l'idrogel in un bagno d'acqua, mettere questo bagno nel congelatore a-20 ° c, e attendere fino a quando il bagno è congelato completamente.</li>
	<li>Completare il processo di formazione della spugna rimuovendo l'idrogel congelato e il bagno d'acqua dal congelatore e scongelando a 25 ° c. La spugna risultante può ora essere rimossa dall'acqua scongelato.</li>
</ol>5. il lyogel
<ol><li>Preparare un lyogel RSSP congelando direttamente un idrogel formato, con o senza bagnomaria, e trasferendo il campione di idrogel congelato a un liofilizzatore (Liofilizzato).</li>
	<li>Rimuovere il materiale gel liofilizzato finale dalla nave che si è verificata la sublimazione dell'umidità.</li>
</ol>6. pellicole e rivestimenti
<ol><li>Utilizzare uno dei tre metodi seguenti: fusione di soluzioni, spruzzatura di soluzioni o rivestimento DIP per produrre pellicole o rivestimenti di rSSp.<ol>
<li>Gettare la soluzione di seta solubilizzata in/su forme PDMS della forma desiderata.</li>
		<li>Versare e diffondere 200 μL della soluzione di pellicola e lasciar asciugare prima di staccarli dal substrato PDMS per il test o il trattamento.</li>
		<li>Dopo aver permesso a questi di asciugare, rimuovere le pellicole formate per prove meccaniche o post-trattare le pellicole per migliorare le proprietà meccaniche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare un rivestimento, o un film che non può essere rimosso dal substrato, utilizzare sia spray o dip coating per produrre uno strato di pellicola sottile. Nota: per spruzzare cappotto, questo protocollo ha trovato successo con un maestro aerografo modello spruzzatore di vernice.<ol>
<li>Formare un rivestimento DIP semplicemente immergendo il substrato di scelta nel rSSp solubilizzato e ripetere dopo l'essiccazione per ottenere lo spessore desiderato.</li>
		<li>Eseguire uno spray iniziale prima di applicare un DIP coat per aumentare la consistenza e l'efficacia del rivestimento finale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. adesivi
Nota: la formazione di adesivi è ottenuta attraverso uno dei seguenti metodi.
<ol><li>Aggiungere direttamente il rSSp solubilizzato su un substrato e quindi applicare un secondo substrato sopra la parte superiore della soluzione. Serrare saldamente i pezzi e asciugare i campioni in un forno con una temperatura minima di 25 ° c per almeno 16 ore.</li>
	<li>In alternativa, spruzzare le due superfici del substrato con un rivestimento spray e quindi serrare insieme i substrati.</li>
	<li>Applicando il rSSp attraverso il metodo DIP di rivestimento dei substrati e attaccando i substrati può anche essere utilizzato per preparare e adesivo.</li>
</ol>8. fibre filate a umido
<ol><li>Caricare la soluzione di droga solubilizzata in una siringa concentrica con punta Luer-Lok attraverso un ago di scorrimento da 19 G. Espellere le bolle d'aria e lasciare che la droga si sieda all'estremità Luer-Lok della siringa.</li>
	<li>Inserire almeno 25 mm di tubo PEEK, diametro interno 0,01 pollici, nel tubo di PEEK di un pezzo stretto raccordi per 1/16 pollici OD e 10/32 cono. Collegare questo raccordo a un tubo PEEK all'adattatore femmina Luer-Lok.<ol>
<li>Sostituire l'ago da 19 gauge con questo set up sulla siringa caricata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Riempire un alto, bagno di vetro chiaro con 99% isopropanolo puro da utilizzare per il bagno di coagulazione.<ol>
<li>Riempire i bagni elasticizzati, che si trova sotto i godets stretch. Questi avranno 80:20 isopropanolo: acqua distillata nel primo bagno elastico, e 20:80 isopropanolo: acqua distillata nel secondo bagno stretch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare il sistema di allungamento Godet in modo che il primo Godet dopo il bagno di coagulazione e il primo Godet nel primo bagno stretch ruotano alla stessa velocità.<ol>
<li>Avviare il primo tratto regolando le velocità del godet finale in bagno stretch 1, il Godet medio superiore, e il primo Godet in bagno stretch 2 alla stessa velocità. Questa velocità sarà 2x veloce come la velocità di rimozione della fibra iniziale.</li>
		<li>Avviare il secondo tratto regolando le velocità del godet finale in bagno stretch 2, l'ultimo Godet superiore, e l'avvolgitore alla stessa velocità. Questa velocità sarà 2x veloce come la velocità utilizzata per il primo tratto o 4x la velocità di rimozione delle fibre iniziali.</li>
		<li>Posizionare i guanti di nitrile all'esterno dei cilindri intermedi per evitare che la fibra scivoli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniziare a estinare lentamente la soluzione nel bagno di coagulazione. In un sistema automatizzato impostare il tasso di estrusione per abbinare una velocità di rimozione di 10 mm/s.<ol>
<li>Consentire l'estrusione della fibra per diventare uniforme prima di tirare le fibre fuori dal bagno utilizzando con un gancio metallico sottile o pinze. Verificare la rimozione della fibra dal bagno creato un loop tra la punta del tubo PEEK e il percorso della fibra lasciando il bagno il bagno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guida la fibra recuperata attraverso la serie di cilindri in modo che la fibra sia sommersa nei bagni elasticizzati ma asciugando nell'aria tra i bagni elasticizzati e prima di andare su una bobina. Questa essiccazione è ottenuta dai godets intermedi posizionati più alti. Nota: il tasso di asportazione delle fibre e/o la velocità di estrusione dovranno essere regolati in base alla concentrazione proteica, agli additivi e al tipo di proteina per consentire un ampio tempo di coagulazione senza mettere in comune le fibre sul fondo del bagno di coagulazione.</li>
	<li>Collegare la fibra completamente allungata alla bobina sul meccanismo di avvolgimento utilizzando il nastro.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Dopo che le proteine di seta del ragno ricombinante vengono purificate, devono essere preparate in una soluzione che può essere utilizzata per la formazione del materiale. Mescolando proteina di seta di ragno liofilizzata con acqua ed esponendo questa miscela all'irraggiamento a microonde, per generare calore e pressione, è possibile preparare una soluzione rSSp. Una vasta gamma di forme di materiale può essere prodotta da questo metodo semplice ed efficiente di solubilizzazione rSSp. Ogni materiale deve essere preparato...

I sete ragno hanno raccolto l'interesse degli scienziati materiali per la loro impressionante combinazione di forza, elasticità e biocompatibilità. Ricreare le fibre è stata tradizionalmente la spinta della ricerca. Questo sforzo è stato ostacolato dall'insolubilità di proteina di seta del ragno ricombinante (rSSp) in acqua, nonché dall'incapacità delle tecniche di solvazione tradizionali (agenti chaotropici e detergenti) di raggiungere la solvazione acquosa. Inoltre, le tecniche sviluppate per le versioni solvatanti di RSSP non funzionano su tutte le varianti RSSP e richiedono anche una manipolazione e un tempo sostanziali che spesso si traduce in perdita di proteine1,2. Questo ha portato in gran parte il campo utilizzando 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanolo (HFIP) come un solvente da cui formare fibre, e altre forme limitate di materiale. Il vantaggio è che tutti i rSSp conosciuti sono solubili in HFIP, fornendo uniformità dei dati tra ogni gruppo di ricerca. Lo svantaggio è che HFIP è un solvente tossico che è costoso e poco pratico per scalare a causa di problemi di salute e considerazioni ambientali.
È stato sviluppato un nuovo approccio alla solvazione rSSp che ha colato il divario tecnologico tra il duro solvente organico HFIP e altre tecniche che hanno funzionato selettivamente per la solvazione rSSp. La combinazione di manches e pressioni specifiche è stata applicata alle sospensioni di rSSp e acqua. I risultati sono stati quasi 100% di solvazione e recupero del rSSp, nonché alte concentrazioni proteiche; una varietà di forme di materiali sono stati determinati per essere possibile da queste formulazioni che non erano tutti ottenibili utilizzando HFIP o altri solventi organici3,4,5,6. L'obiettivo di questo approccio è quello di solubilizzare efficacemente e facilmente le proteine del ragno ricombinante depurato e essiccato in una soluzione acquosa che può essere utilizzata per la produzione di una varietà di forme di materiale.
Fibre, pellicole, Rivestimenti, adesivi, idrogel, lyogel, microsfere e materiali in spugna sono tutti facilmente realizzabili dalla stessa soluzione acquosa di rSSp con questo metodo. L'evoluzione continua di questo metodo, non solo con ulteriori rSSp ma con altre proteine, potrebbe portare a nuove forme di materiale e vie alternative di purificazione e solubilizzazione delle proteine.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 3 ml con punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309657</td> È <td>possibile utilizzare siringhe di altre dimensioni, ma per mantenere le punte, si consiglia di utilizzare puntali luer-lok</td></tr><tr><td>Fiala di coltura da 4 ml, trasparente con tappo rivestito in gomma</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>Il volume minimo della droga è 1 ml, il massimo è 2 ml</td></tr><tr><td>Fiala di coltura da 8 ml, trasparente con tappo rivestito in gomma</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>Il volume minimo della droga è 2 ml, max è 4mL</td></tr><tr><td>99% Alcol Isopropilico, Reagente ACS/USP Grado</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>Liofilizzatore Luer</td></tr><tr><td>Adattatore Luer Femmina Luer x 10-32 Femmina, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120V, 60Hz AC; 1000 watt; 1,1 cu. ft. capacità; con piatto</td></tr> <tr><td>girevole in vetroTubo in PEEK monopezzo a tenuta stagna 10-32, per tubi in PEEK da 1/16"</td><td>OD IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>1/16" OD x 0,010" ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>Spruzzatore: Aerografo Master Aerografo</td><td>Master</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Molti ragni producono sette tipi di sete. Sei dei sete sono fibre in forma quando prodotte dai ragni. Queste fibre non sono solubili in acqua. Al fine di riprodurre le notevoli proprietà meccaniche delle sete di ragno, devono essere prodotte in padroni eterolodi come i ragni sono sia territoriali che cannibali. Anche gli analoghi sintetici della seta di ragno tendono ad essere insolubili in soluzioni acquose. Così, una grande percentuale di ricerca in sete di ragno ricombinante si basano su solventi organici che sono dannosi per la produzione su larga scala di materiali. Il metodo del nostro gruppo costringe la solvazione di questi sete di ragno ricombinanti in acqua. Sorprendentemente, quando queste proteine sono preparate utilizzando questo metodo di calore e pressione, una vasta gamma di forme di materiale può essere preparata dalla stessa soluzione di proteine di seta ragno ricombinante (rSSp) tra cui: film, fibre, spugna, hydrogel, lyogel, e adesivi. Questo articolo illustra la produzione di RSSP e forme di materiale solvatato in un modo che è più facilmente comprensibile che da solo materiali e metodi scritti.

Dal metodo descritto di solubilizzazione di rSSp, una varietà di forme di materiale può essere ottenuta come si vede nella Figura 1. Il metodo di solubilizzazione è quello di applicare calore e pressione, generata da un forno a microonde convenzionale, ad una sospensione di rSSp e acqua. Quando si raggiungono temperature e pressioni critiche, la proteina si solubilizza. Da questa soluzione di rSSp solubilizzata, le condizioni richieste sono presentate per set...

Qui, presentiamo un protocollo per produrre soluzioni di proteina di seta ragno ricombinante solubile in acqua e le forme di materiale che possono essere formate da queste soluzioni.

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Questo metodo di solubilizzazione delle sete di ragno ricombinante produce forme di materiale che non sono possibili utilizzando solventi organici duri tradizionali. Inoltre, il processo è grano, risultando in una semplice soluzione proteica in acqua. Utilizzando questo metodo, i materiali formati o prodotti mantengono le caratteristiche desiderabili delle proteine della seta di ragno.Questa tecnica di solubilizzazione per sete di ragno ricombinante consente la solubilizzazione delle sete di ragno ricombinante in un processo in un'unica fase. Questo è desiderabile perché queste proteine notoriamente difficili da produrre non vengono perse attraverso un'ampia lavorazione. Inoltre, poiché le soluzioni sono solo proteine in acqua, altri composti biologicamente attivi possono essere aggiunti se ciò è auspicabile per l'applicazione.In particolare, la relazione di funzione della struttura proteica, questo sistema è memetico a come un ragno produce una fibra in quanto utilizza acqua e proteine ad alta concentrazione. Utilizzando questo metodo di solubilizzazione e una successiva formazione del materiale, dovrebbe essere possibile comprendere i materiali che si formano e le strutture che ne sono responsabili. Si pensa che possa essere, abbiamo usato questa tecnica per solubilizzare peptidi sintetici che altrimenti richiederebbero un ambiente alcalino o acido per solvarsi.Questo può essere vantaggioso nelle applicazioni a valle per quei peptidi. Inoltre, un certo numero di proteine conosciute quando espresse sinteticamente tendono a finire nella frazione insolubile. La risolubilizzazione, e poi il ripienderamento di queste proteine è spesso un processo laborioso che si traduce in grandi perdite.Utilizzando questa tecnica, potrebbe essere possibile aumentare l'efficienza dei processi di recupero per le proteine insolubili. Posizionare una fiala sigillata in un forno a microonde è un po 'scoraggiante dando il rischio di surriscaldamento e quindi di pressurizzazione del flaconcino. Comprendere l'approccio a fasi per l'applicazione di calore e pressione è fondamentale.In secondo luogo, per la seta di ragno ricombinante in particolare, avere sale presente non permetterà alla tecnica di funzionare o funzionare in modo così efficace a seconda di quanto sale è presente. La rimozione del sale è la chiave. Sii paziente e attento, monitora attentamente i tempi e le temperature del microonde all'interno del flaconcino.È fondamentale perché ci sono un certo numero di parti mobili al funzionamento che sono spesso difficili da trasportare attraverso i materiali scritti tradizionali e le sezioni del metodo. Dato che ci sono molte proteine che hanno problemi di solubilità che impediscono uno studio adeguato, questo metodo ha il potenziale per essere applicato attraverso una varietà di spazi proteici per migliorare, o addirittura consentire tecniche analitiche e caratterizzazione. Per iniziare, selezionare una fiala di coltura in vetro borosilicabile autoclavebile da otto millilitri pulita e nuova con un tappo a vite foderato in gomma e posizionare il flaconcino vuoto su un equilibrio analitico.Strappare la massa della fiala vuota in modo che il saldo legga la massa zero. Aggiungere la polvere di proteina di seta di ragno ricombinante lyophilizzata desiderata alla fiala vuota per il materiale specifico. Quindi, aggiungere la quantità desiderata di acqua ultra pura, almeno due millilitri, al flaconcino.Sigillare il cappuccio della fiala e vortice vivacemente il contenuto per creare una miscela di proteine di seta di ragno ricombinante disperse e omogenee. Eseguire un controllo finale del cappuccio del flaconcino per assicurarsi che sia stato serrato saldamente e saldamente. Quindi, trasferire la miscela di proteine di seta di ragno ricombinante sospesa in un forno a microonde convenzionale con una gamma di potenza da 700 a 1500 watt.Inizia il funzionamento del microonde con raffiche di cinque secondi impostate a piena potenza accendendo e spegnendo manualmente. Dopo ogni scoppio, aprire brevemente la porta e mescolare accuratamente la fiala per evitare la sedimentazione e mantenere la miscela sospesa. Occasionalmente lasciare raffreddare il flaconcino e la soluzione e impedire alla soluzione surriscaldata di toccare la guarnizione.Utilizzare un termometro a infrarossi per misurare la temperatura della soluzione contenente la porzione del flaconcino. Ripetere il processo a microonde fino a quando la temperatura raggiunge almeno 130 gradi Celsius e tutte le particelle solide sono state completamente sciolte. Quindi, lasciare raffreddare la temperatura della soluzione e del cappuccio del flaconcino al di sotto dei 100 gradi Celsius.Prima che questa soluzione venga completamente raffreddata, gettarla dalla fiala in geometrie specifiche per formare un idrogel. Dopo aver formato l'idrogel, posizionarlo in un bagno d'acqua e trasferirlo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Attendere che il bagno sia completamente congelato.Completare il processo di formazione della spugna rimuovendo l'idrogel congelato e il bagno d'acqua dal congelatore e scongelando a 25 gradi Celsius. Quindi, rimuovere la spugna risultante dall'acqua scongelata. Per preparare un lyogel, trasferire un campione di idrogel congelato in un lyophilizer.Dopo 24 ore, rimuovere il materiale gel licofilizzato finale dal vaso. Per produrre pellicole di proteina della seta ragno ricombinante, lanciare 200 microlitri della proteina della seta di ragno ricombinante solubilizzata a caldo dal flaconcino a una forma PDMS della forma desiderata. Dopo che è stato asciugato, staccarlo dal substrato PDMS per il test o il trattamento.Per preparare un rivestimento che non può essere rimosso dal substrato, utilizzare uno spruzzatore di aerografo per applicare la proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante per eseguire un rivestimento spray iniziale sul substrato di scelta. Dopo che è stato asciugato, immergere il substrato rivestito nella proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante per formare un rivestimento di immersione. Ripetere il rivestimento del tuffo per ottenere lo spessore desiderato.Per formare adesivi, utilizzare una pipetta per aggiungere la proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante su un substrato, quindi applicare un secondo substrato sopra la parte superiore della soluzione. Fissare saldamente i pezzi insieme, quindi asciugare i campioni in un forno con una temperatura minima di 25 gradi Celsius per almeno 16 ore. Per generare fibre filate bagnate, utilizzare un ago di planata calibro 19 e caricare la soluzione di droga solubilizzata in una siringa concentrica con una punta di blocco Luer.Espellere le bolle d'aria e lasciare che la droga si sieda all'estremità della serratura Luer della siringa. Inserire almeno 25 millimetri di tubi PEEK nei raccordi aderente con un solo pezzo del tubo PEEK per un diametro esterno superiore a 16 pollici e 10 su 32 pettini. Sostituire l'ago calibro 19 con questa configurazione sull'adattatore femmina di blocco Luer della siringa.Quindi, posizionare guanti di nitrile all'esterno delle divinità intermedie, per evitare che la fibra venga generata dallo scivolamento e per evitare di danneggiare i motori. Ottieni un alto bagno di vetro trasparente con isopropanolo puro al 99% da utilizzare come bagno di coagulazione. Riempire il primo bagno elasticizzato con un rapporto da 80 a 20 di isopropanolo e acqua distillata.Nel secondo bagno elasticizzato, riempire un rapporto da 20 a 80 di isopropanolo e acqua distillata. Impostare il sistema di estensione godet sul computer. Per regolare la velocità principale della rimozione della fibra, regolare la barra scorrevole per la tripletta godet Una velocità a un valore compreso tra 10 e 14 millimetri al secondo, a seconda di quanto bene e rapidamente la fibra si sta formando.Inizia un primo tratto spostando la barra scorrevole del rapporto di stiramento b tripla godet a due Per la godet finale nel bagno elasticizzato uno, La godet superiore centrale e la prima godet nel bagno di tratto due. Inizia il secondo tratto spostando la barra scorrevole del rapporto di allungamento della tripla C godet a due per la godet finale nel bagno elasticizzato due, l'ultima godet superiore e il winder. Questa configurazione assicura che la prima godet dopo il bagno di coagulazione e la prima godet nel primo bagno elasticizzato ruotano alla stessa velocità.Quindi, caricare la soluzione di seta nella siringa di uno strumento di linea di spin personalizzato. Nel sistema automatizzato, impostare la velocità di estrusione a 10 millimetri al secondo, al fine di estrudere la soluzione di seta nel bagno di coagulazione del vetro riempito con isopropanolo. Lasciare che l'estrusione della fibra diventi uniforme, prima di estrarre le fibre dal bagno con un sottile gancio metallico.Verificare che la rimozione della fibra dal bagno crei un anello tra la punta del tubo PEEK e il percorso della fibra che esce dal bagno. Guida la fibra recuperata attraverso la serie di godet, in modo che la fibra sia immersa nei bagni elastici, ma asciugandosi nell'aria tra i bagni elastici e prima di andare su una bobina. In questo protocollo attraverso una solubilizzazione della proteina della seta di ragno ricombinante, è possibile ottenere una varietà di forme di materiale.Qui vengono presentate sette forme materiali. Idrogel, liogel, spugna, adesivi, rivestimenti, pellicole e fibre. Le fibre richiedono la lavorazione più estesa estrudendosi in un bagno di coagulazione e quindi allungando serialmente la fibra grezza nei bagni elasticizzati post-bin.Dato che le soluzioni proteiche e idriche vengono riscaldate a una temperatura e una pressione relativamente elevate, la nostra esperienza è stata che le soluzioni sono sterili nel momento in cui la proteina viene solvata. Ciò consente a qualsiasi forma materiale qui presentata di essere portata alla coltura cellulare, purché siano gestite in modo appropriato, per studiare la risposta cellulare ai materiali. Certamente questa tecnica ha portato alla scoperta di nuove forme di materiale, tra cui adesivi e materiale spugna.Forme materiali che non sono necessariamente orientate verso la formazione di fibre, anche se la formazione di fibre è una delle aree che ha anche visto miglioramenti attraverso lo sviluppo di questa tecnica. Generare calore e pressione all'interno di una fiala sigillata ha un pericolo intrinseco. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale quando si eseguono queste procedure.

material-formation-recombinant-spider-silks-through-aqueous-solvation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l'addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l'isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l'assemblaggio delle fibre.

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

Nonostante le notevoli proprietà meccaniche e biochimiche di seta di ragno, questo materiale non può essere raccolto in grandi quantità con mezzi convenzionali. Qui descriviamo una strategia efficace per far girare fibre artificiali in seta di ragno, che è un processo importante per i ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e il loro uso come biomateriali di nuova generazione.

Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio

Fibre di seta di ragno mostrano straordinarie proprietà meccaniche.

Filtro aria dispositivi tra cui maglie non tessuti di elettrofilate ricombinanti Spider Proteine ​​della Seta

La miscelazione è un approccio efficace per generare biomateriali con una vasta gamma di proprietà e caratteristiche combinate. Per predire le interazioni molecolari tra diverse proteine ​​della seta naturale, nuove piattaforme lega proteine ​​della seta-seta con sintonizzabile resilienza meccanica, risposta elettrica, trasparenza ottica, lavorabilità chimica, biodegradabilità, stabilità termica o possono essere progettati.

Progettazione di materiali in lega di proteine ​​della seta-seta per le applicazioni biomediche

Un protocollo per la filatura di microfluidica e caratterizzazione di microstruttura di monofilamento rigenerata seta fibroin è presentato.

A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

Questo protocollo dimostra la capacità di utilizzare la stampa a getto d'inchiostro reattiva per stampare micro-agitatori biocompatibili e rispettosi dell'ambiente per l'uso in applicazioni biomediche e ambientali.

Stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

Un tapping mode microscopio a forza atomica (AFM), metodo per la visualizzazione di DNA plasmidico, proteine ​​citoplasmatiche, e DNA-proteina complessi è descritta. Il metodo include approcci alternativi per la preparazione di campioni per l'imaging AFM seguenti manipolazione biochimica. Specifiche regioni di DNA che contiene le proteine ​​che interagiscono sono osservati in quasi fisiologico condizioni di buffer.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Acquose due sistemi monofase sono stati usati per simultaneamente popolazioni modello multiple di cellule. Questo metodo semplice e veloce per patterning cellulare sfrutta la fase di separazione di soluzioni acquose di destrano e polietilene glicole e la tensione interfacciale che esiste tra le due soluzioni polimeriche.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Segnaliamo su tecniche per micropattern nanoporosi film sottili di oro tramite la stampa stencil e fotolitografia, così come i metodi di cellule di coltura, su modelli di microfabbricati. Inoltre, si descrivono metodi di analisi di immagine per caratterizzare morfologia del materiale e le cellule in coltura mediante scansione elettronica e tecniche di microscopia a fluorescenza.

Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

Vengono discussi i protocolli per lo studio della formazione di biofilm in un dispositivo microfluidico che imita i mezzi porosi. Il dispositivo microfluidico è costituito da una serie di micro-pilastri e viene studiata la formazione di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens in questo dispositivo.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Scopri come solubilizzare proteine di seta di ragno ricombinante in acqua senza solventi organici. Questo metodo semplice preserva le proprietà del materiale e consente applicazioni innovative in biotecnologia.

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

Esplora altri video