Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

La possibilità di generare diversi sottotipi di motoneuroni è particolarmente rilevante per modellare le moderne malattie dei motoneuroni come la sclerosi laterale amiotrofica. Questo metodo consente l'acquisizione di popolazioni cellulari altamente rigide per i motoneuroni con un'identità spinale o cranale in un breve lasso di tempo e senza la fase di purificazione. La generazione di motoneuroni umani da cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC in condizioni di coltura semplificate può facilitare lo screening farmacologico per le malattie dei motoneuroni.

L'espressione induttibile del fattore di trascrizione di programmazione può essere utilizzata per generare altri tipi di cellule come neuronali, muscolo scheletrico e cellule gliali da un repository iPSC. Per la generazione di linee NIL e NIP iPSC, sciacquare la coltura iPSC umana con PBS privo di calcio e magnesio prima di trattare le cellule con reagente di dissociazione cellulare per cinque-10 minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule hanno iniziato a staccarsi dal contenitore di coltura, utilizzare una pipetta P1000 per dissociare delicatamente manualmente le cellule da tre a quattro volte.

Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e portare il volume finale fino a 10 millilitri con PBS fresco senza calcio e magnesio per il conteggio. Raccogliere una per 10 alla sesta cella mediante centrifugazione e rimescolare il pellet in 100 microlitri del tampone R dal kit di elettroporazione. Aggiungere 4,5 microgrammi di DNA plasmatico vettoriale trasponibile e 0,5 microgrammi del DNA plasmatico transposasi piggyBac per la trasfezione.

Trasfetto con il sistema di elettroporazione cellulare secondo le istruzioni del produttore con i parametri indicati. Quindi, seminare le cellule in mezzo iPSC umano integrato con 10 inibitori ROCK micromolari Y-27632 in un piatto rivestito a matrice di sei millimetri. Due giorni dopo la trasfezione, aggiungere 5 microgrammi per millilitro di blastidina al terreno di coltura mantenendo le cellule nell'antibiotico per almeno sette-10 giorni per controselezionare le cellule che non hanno integrato i transgeni.

Alla fine dell'incubazione, mantenere le cellule macchiate stabilmente come una popolazione mista composta da cellule con un numero diverso di transgeni e diversi siti di integrazione o isolare singoli cloni. Preparare un piatto aggiuntivo per consentire l'espressione efficace dei transgeni su un microgrammo per millilitro di induzione di doxiciclina da valutare da RT-PCR con primer transgeni specifici per la neurogenina-2 come descritto in precedenza. In questa fase, anche le scorte delle nuove linee NIL e NIP iPSC dovrebbero essere congelate nel mezzo di congelamento per gli iPSC umani.

Per la differenziazione dei motoneuroni, dissociare le colture cellulari trasfette stabilmente con reagente di dissociazione come dimostrato per consentire la raccolta delle cellule in un tubo da 15 millilitri contenente cinque volumi di mezzo DMEM/F12. Dopo la centrifugazione, rimescolare le cellule nel mezzo iPSC umano integrato con inibitore ROCK micromolare per il conteggio. Semina le cellule su piatti rivestiti a matrice a una densità quadrata di 6,25 per 10 le quattro cellule per centimetro.

Per i prossimi due giorni, sostituire i supernaganti con un nuovo mezzo di differenziazione integrato con doxiciclina. Il secondo giorno, cambiare il mezzo medio-neurobasale B27 integrato con inibitore della gamma secretasi, inibitore del recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare e doxiciclina. Il quinto giorno, dissociare le cellule come dimostrato e rimospendare le cellule staccate in quattro millilitri di mezzo DMEM / F12 per il conteggio.

La pipettazione è importante per una completa dissociazione delle cellule. Congelare un'aliquota dei progenitori del motoneurone nel mezzo di congelamento cellulare secondo le istruzioni del produttore e raccogliere il resto delle cellule mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in mezzo neuronale integrato con 10 inibitori rock micromolari.

Seminare le cellule su supporti in microslide rivestiti di poliornitina rivestita di laminina con coperchio polimerico scivola a una densità quadrata di una volta 10 alla quinta colonna per centimetro. Il sesto giorno, sostituire con cura il mezzo con un mezzo neuronale fresco senza inibitore per la coltura fino all'analisi a valle senza staccare le cellule dalla superficie di supporto. Un'espressione uniforme del fattore di trascrizione legante l'ottamero marcatore pluripotente quattro o OTC4 può essere osservata nelle colture cellulari differenzianti il giorno zero in assenza di positività tuJ1 di classe tre beta-tubulina specifica del marcatore pan neuronale.

Il terzo giorno, è evidente una forte diminuzione del numero di cellule positive dell'OCT4. Ciò è rispecchiato dall'espressione di TUJ1 in un sottoinsieme di iPSC differenzianti. Al quinto giorno, non si osserva alcuna espressione di OCT4 nella popolazione che mostra un'espressione coerente del TUJ1 e una morfologia neuronale acquisita.

L'analisi immunosottenimento sette giorni dopo la ripiattazione delle cellule progenitrici del motoneurone rivela un'espressione uniforme di TUJ1 e del marcatore del motoneurone maturo colina acetiltransferasi. I neuroni derivati dal NIL iPSC visualizzano con successo correnti di sodio dipendenti dalla tensione e correnti di potassio dipendenti dalla tensione. L'80% dei motoneuroni derivati dall'IPSC NIL fissati nella modalità di bloccaggio corrente sono in grado di innescare treni a spillo quando vengono iniettati con un impulso di corrente di più 60 picoamps o più.

La corrente minima richiesta per provocare la cottura ripetitiva in oltre il 50% delle cellule registrate è più 40 picoamp con una soglia di picco di circa meno 38 millivolt e una frequenza media di cottura a più 40 picoambi di circa otto hertz, suggerendo che i motoneuroni spinali derivati dall'IPSC NIL mostrano proprietà funzionali tipiche dei neuroni maturi. I motoneuroni spinali e cranici possono essere derivati da iPSC controllati o iPSC che trasportano mutazioni patologiche e che queste cellule possono essere utilizzate come modelli di tesi o per lo screening farmacologico. Il nostro metodo può essere utilizzato per aiutare a capire perché diverse unità di motoneuroni sono influenzate in modo differenziato dalla SSL.