In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

Eseguiamo la prima terapia, basata su un inibitore del microRNA in un modello di cancro alla tiroide. Queste terapie in via di sviluppo mostrano promesse per il trattamento di questa malattia. Questo tipo di modello ortotopico, utilizzando una via sistemica di erogazione del trattamento, facilita la convalida di un nuovo farmaci a base di microRNA.

Sebbene usiamo un modello ortotopico per impiantare cellule tumorali tiroidee umane nelle tiroide del topo, questi modelli potrebbero essere tutti sistemici per altri tipi di cancro. A dimostrare la procedura con Julia Ramirez-Moya e Adrian Acuna sarà Raquel Arocha Riesco. È un tecnico del nostro istituto.

Dopo aver stabilito un mezzo incompleto della linea cellulare del cancro alla tiroide umana CAL-62, sospendere un'aliquota 1 per 10 alla 6a cella in 50 microlitri di PBS a 4 gradi celsius e mescolare le cellule con un volume uguale di matrice di membrana basale. Caricare le cellule in una siringa da 1 millilitro, dotata di un ago da mezzo pollice da 27 gage, e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri del campione nel fianco sinistro di un topo nudo C della valvola immunodifesa di 6 settimane. Due settimane dopo l'iniezione, aggiungere la soluzione antagomiR o tampone di trattamento controllato a 160 microlitri di reagente di consegna in vivo a temperatura ambiente in un tubo da 1 punto 5 millilitro.

E vortice immediatamente la soluzione per 10 secondi per garantire la complessità della miscela. Incubare la soluzione di trattamento per 30 minuti a 50 gradi celsius, seguita da una breve centrifugazione in una micro centrifuga. Quindi, diluire il complesso di trattamento sedimentato di sei volte con PBS fresco e miscelazione accurata.

E iniettare l'intero volume di 200 microliter del trattamento direttamente nel tumore. Iniettare 50 microlitri di una soluzione di substrato D-Luciferina da 40 milligrammi per litro 2 volte a settimana, in ogni animale sperimentale. Assicurarsi di confermare una mancanza di risposta al dito del piedi dopo l'anestesia isoflurane.

Posizionare l'animale nella camera di un sistema di imaging a bioluminescenza in vivo e immaginare il segnale di bioluminescenza con il software di imaging in vivo secondo protocolli standard. Quindi analizzare la crescita tumorale. Confrontare entrambi i trattamenti e determinare il significato e le differenze di crescita utilizzando un test T.

Per l'inoculazione ortotopica delle cellule tumorali tiroidee sospendere un'aliquota di cellule CAL-62 in 5 microlitri di PBS e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri di analgesico e 100 microlitri di antibiotico in un topo nudo C della valvola di 7 settimane. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, posizionare l'animale al microscopio sezionante e disinfettare il collo dell'animale con iodopovidone. Successivamente, fare un'incisione di circa 2 centimetri nella pelle e spostare il glande salivare per esporre il collo.

Utilizzare le forcep di dissezione e/o le forbici per sezionare i muscoli della cinghia per esporre la trachea e la ghiandola tiroidea e utilizzare una siringa da 10 microliter, per iniettare il volume di 5 microliter delle cellule tumorali nel lobulo tiroideo destro, situato sul lato della cartilagine cricoide. Una volta che tutte le cellule sono state consegnate, riposizionare il glande salivare e utilizzare suture intrecciate, rivestite e non assorbibili di seta per chiudere l'incisione. Quindi applicare iodopovidone sull'area della ferita e posizionare il mouse su una coperta termica con monitoraggio fino al completo recupero.

due o tre settimane dopo l'iniezione di cellule intratiroidi, preparare la soluzione di trattamento come dimostrato e fornire la soluzione per via endovenosa mediante iniezione retroorbitale del seno venoso dell'animale anestetizzato che porta il tumore alla tiroide. In questo esperimento rappresentativo, la crescita dei tumori iniettati per via intratumorale senza inibitore del microRNA 146B, è stata significativamente soppressa rispetto al controllo negativo. I livelli di espressione intratumorale di alcuni marcatori di proliferazione sono stati osservati anche in bassi livelli, nei tumori trattati con antagomiR, rispetto ai tumori di controllo.

Inoltre, il recupero dei bersagli di micro-RNA può essere studiato attraverso l'analisi dell'RNA estratto dal tumore, o proteina. Rivelando collettivamente che l'inibizione in vivo dei singoli microRNA è efficace e può essere sfruttata terapeuticamente per i trattamenti del cancro alla tiroide. L'analisi istologica dei tumori tiroidei stabiliti nei topi come dimostrato, consente la colorazione per le cellule epiteliali che circondano il tumore, rivelando l'architettura follicolare tiroidea del tessuto tumorale.

In particolare, l'iniezione endovenosa di inibitore del microRNA 146B nei topi, con un tumore stabilito, si traduce in una significativa diminuzione del volume tumorale rispetto agli animali trattati con controllo. Inoltre, l'espressione del nuovo microRNA 146B bersaglio DICER1 nel tumore primario, aumenta dopo il trattamento anti micro-RNA 146B, sottoscrivendo ulteriormente il potenziale dell'inibizione dell'espressione indogena di micro-RNA e quindi il ripristino dei suoi geni bersaglio come terapia nel cancro alla tiroide. Questa tecnica, e i successivi risultati della lipina, aprono la possibilità di esplorare nuove terapie a base di RNA non curanti per il trattamento del cancro alla tiroide.