Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale
13 maggio 2019
L'analisi in vitro micronucleo è un metodo consolidato per valutare la genotossicità e la citotossicità, ma segnare l'analisi utilizzando la microscopia manuale è laborioso e soffre di soggettività e variabilità inter-marcatore. Questo documento descrive il protocollo sviluppato per eseguire una versione completamente automatizzata dell'analisi utilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale.
Il test del micronucleo basato sul flusso di immagini può superare diverse limitazioni di metodi come la microscopia automatizzata e la citometria a flusso convenzionale, tra cui bassa produttività e mancanza di conferma visiva degli eventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti gli eventi necessari per determinare la genotossicità e la citotossicità possono essere automaticamente identificati, identificati e valutati senza la necessità di creare diapositive al microscopio. Per l'esposizione cellulare a clastogeni e/o aneugeni, aggiungere un millimetro della sostanza chimica di interesse a sette-otto volte 10 al quinto delle cellule sperimentali in nove millilitri del mezzo di coltura cellulare appropriato in un pallone T25 e un millilitro di acqua alle colture di controllo.
Incubare i contenitori a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre ore prima di trasferire le cellule in un tubo di polipropilene da 15 millilitri per pallone. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimorsi il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura fresco per tubo per la semina in nuovi contenitori di coltura T25. Aggiungere quindi 150 microlitri della concentrazione di calcio della citocalcasina B in ogni pallone per ottenere una concentrazione finale di tre microgrammi per millilitro.
Restituire i contenitori all'incubatore per un tempo di recupero pari a 1,5-due volte di raddoppio, come raccomandato dalle linee guida dell'Organizzazione per la cooperazione economica e lo sviluppo. Al termine del periodo di recupero, trasferire le colture in singoli tubi di polipropilene da 15 millilitri per la centrifugazione e rimpignare il pellet in cinque millilitri di cloruro di potassio da 75 millimolare. Mescolare delicatamente per inversione tre volte e incubare i campioni a quattro gradi Celsius per sette minuti.
Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di formalina al quattro per cento a ciascun campione e mescolare delicatamente con tre inversioni. Riportare i campioni a quattro gradi Celsius per 10 minuti prima di raccogliere le cellule per centrifugazione. rimosogliere i pellet in 100 microlitri di formalina fresca al quattro per cento per 20 minuti.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule fisse in cinque millilitri di tampone di lavaggio per tubo mediante centrifugazione e rimorsire il pellet in 100 microlitri di tampone di lavaggio per tubo. Successivamente, trasferire i campioni su singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per contare su un emocitometro. Aggiungere cinque microlitri da 100 microgrammi per millilitro Hoechst 33342 per 1,0 x 10 alle sei celle per millilitro e 10 microlitri di 500 microgrammi per millilitro RNasi per 100 microlitri di campione per tubo.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e il cinque per cento di anidride carbonica, centrifugare i campioni in un microcentrifugo e rimuovere tutti i microlitri di supernatante tranne 30 da ogni tubo. Quindi rimorsi accuratamente i campioni, facendo attenzione a non indurre la formazione di bolle. Se le bolle appaiono al momento della sospensione, scorrere delicatamente il tubo per rimuoverle.
Per eseguire i campioni mediante citometria a flusso di imaging multispettrale, accendere prima il laser da 405 nanometri e impostare la potenza del laser su 10 milliwatt. Disabilita tutti gli altri laser, incluso il laser a dispersione laterale, e imposta il campo luminoso sui canali uno e nove. Verificare che il dispositivo di scorrimento dell'ingrandimento sia impostato su 60x, che la modalità ad alta sensibilità sia selezionata e che nella raccolta immagini siano visualizzati solo uno, sette e nove canali.
Fate clic su traccia a dispersione (Scatter Plot) e selezionate tutta la popolazione e l'area M01 sull'asse X. Selezionate le proporzioni M01 sull'asse Y e fate clic su area quadrata per disegnare un'area attorno alle singole celle. Assegnare a questa regione il nome di singole celle e fare clic con il pulsante destro del mouse sul plottaggio per selezionare le aree.
Evidenziare la regione delle singole celle e modificare le coordinate X in 100 e 900 e le coordinate Y in 0,75 e una. Impostare i parametri di acquisizione e specificare il nome del file e la cartella di destinazione. Quindi cambia il numero di eventi in 20.000, seleziona la popolazione positiva al DNA ed esegui il primo campione.
Per aprire un file di dati in IDEE, fare clic su Avvia analisi per avviare l'Apertura guidata file e selezionare il file di immagine non elaborati desiderato. Quindi fare clic su Avanti e cercare una cella binucleata nella raccolta immagini. Per creare una maschera, fare clic per selezionare l'immagine di interesse e aprire la scheda analisi.
Fate clic su Maschere (Masks), Nuovo (New) e Funzione (Function) per selezionare LevelSet. In Maschera (Mask), selezionate Maschera m07 e Maschera di livello medio (Middle Level Mask) e impostate la scala dei dettagli del contorno su tre. Quindi fare clic due volte su OK.
Per individuare le feature di cella binucleate a conteggio, aprite la scheda Analisi (Analysis) e selezionate Feature (Features) e Nuovo (New). Per il tipo di feature, selezionate Conteggio spot (Spot Count). Per Maschera, selezionate la maschera binucleata finale e impostate la connettività su quattro, quindi modificate il nome in BNC conteggio spot (Spot Count BNC) e fate clic su OK e avvicinate (Close) per calcolare i valori della feature.
Per un istogramma di cella binucleato con conteggio spot, fare clic sull'istogramma e selezionare non apoptopico come popolazione padre. Per la feature asse X, selezionate BNC conteggio punti (Spot Count BNC) e fate clic su OK e su area lineare, quindi disegnate una regione tra Bim Two e denominate questa regione 2N. Per creare una maschera micronucleo, selezionate una cella binucleata contenente un micronucleo dalla raccolta immagini e aprite le maschere nella scheda Analisi.
Per crearne una maschera di identificazione spot, fare clic su Nuovo e funzione e selezionare Spot. Verificare che il pulsante di opzione Luminoso sia selezionato e selezionare M07 sotto maschera. Impostate il rapporto di sfondo spot-cella e il raggio minimo su due e impostate il raggio massimo su sei.
Fare clic su OK e SU OK per aggiungere la maschera all'elenco a sinistra e quindi su Nuovo per creare un'altra maschera. Fate clic sulla maschera Spot M07 Channel seven Bright two six two e fate clic sulla freccia in giù per aggiungerla alla definizione della maschera e fate clic su Operatori And e Not. Fare clic sulla freccia in giù per aggiungere la maschera dell'intervallo dilatato alla definizione della maschera.
Per creare una maschera di popolazione polinucleata, fate clic su Analisi (Analysis), Maschere (Masks), Nuovo (New) e Funzione (Function). In Funzione selezionare Intervallo. In Maschera (Mask), selezionate Dilata spartiacque (Watershed Dilate Set M07 Channel07), Centrale (Middle), tre, due (Three, Two) e impostate l'immagine in modo che sia visualizzata sul canale 07.
Impostate i valori di area minima e massima rispettivamente su 135 e 5000 e impostate i valori delle proporzioni minime e massime rispettivamente su 0,4 e uno. Fare clic su OK e nel campo nome modificare il testo in maschera POLY, quindi fare clic su OK e chiudi. Per creare una visualizzazione personalizzata, fare clic sul pulsante Proprietà raccolta immagini, aprire la scheda Compositi e fare clic su Nuovo.
In Nome immettere Canale 01 fino al Canale 07. Fare clic su Aggiungi immagine e in Immagine selezionare Canale 01 e impostare la percentuale su 100. Fare di nuovo clic su Aggiungi immagine e in immagine selezionare Canale 07 e impostare la percentuale su 100.
Fare clic sulla scheda Visualizza, su Nuovo e in Nome immettere maschere BNC e MN. Quindi fare clic su Aggiungi colonna e in Tipo immagine selezionare Canale 01 e in Maschera selezionare Nessuno. Fare clic su Aggiungi colonna e in Tipo immagine selezionare Canale 07 e in Maschera selezionare Nessuno.
Fare clic su Aggiungi colonna, sul pulsante di opzione Composito e quindi su Ok per completare la visualizzazione personalizzata. Fate clic sul menu a discesa Visualizza (View) e fate clic sulla vista maschere BNC e MN . Fare clic sul pulsante Mostra nascondi maschere.
Per enumerare gli eventi chiave, aprire la scheda Report e fare clic su Definisci report statistiche, quindi nella nuova finestra fare clic su Aggiungi colonne. Per aggiungere la statistica del conteggio delle celle binucleate, in Statistiche selezionare Conteggio e in Popolazione selezionata selezionare la popolazione BNC, quindi fare clic su Aggiungi statistiche per aggiungere la statistica all'elenco e salvare il modello. Dopo aver aggiunto tutte le statistiche all'elenco, fare clic su Chiudi, quindi su OK e quindi salvare il modello di analisi dei dati.
Per elaborare in batch i file sperimentali, scegliere File di dati batch dal menu Strumenti e fare clic su Aggiungi batch nella nuova finestra. Fate clic su Aggiungi file (Add Files) per selezionare i file di esperimento da aggiungere al batch e fate clic sul pulsante Apri cartella (Open Folder) nell'opzione Seleziona un modello o un file di analisi dei dati. Passare al modello appena salvato e aprirlo.
Fare clic su OK per chiudere la finestra corrente. Quindi fare clic su Invia batch per avviare l'elaborazione batch di tutti i file. Qui vengono visualizzati quattro pannelli selezionati per identificare le celle binucleate.
Questi grafici e istogrammi bivariati consentono la selezione di cellule binucleate e l'identificazione di quelle cellule che hanno due nuclei con circolarità, aree e intensità simili e che sono ben separati l'uno dall'altro. Queste immagini di Brightfield e Hoechst, così come le maschere binucleate e micronucleus, facilitano l'identificazione e l'enumerazione di cellule binucleate e micronuclei. L'applicazione della caratteristica del conteggio spot utilizza la maschera polinucleata per identificare le cellule mononucleari, trinucleari e quadranucleari.
Il numero di cellule tri e quadranucleari può quindi essere sommato per ottenere il numero finale di cellule polinucleate necessarie per il calcolo della citotossicità. Qui, i valori rappresentativi di genotossicità e citotossicità sono mostrati per la colchicina endogena, la mitomicina clastogena C e un controllo negativo, il mannitolo, per dimostrare la validità del protocollo. L'etichettatura delle cellule con un'adeguata concentrazione di macchie di DNA è fondamentale per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità, consentendo di identificare e segnare facilmente tutti gli eventi chiave.
Queste tecniche sono applicabili anche al test del micronucleo per la biodosimetria da radiazioni, che consente la stima della dose in individui che potrebbero essere stati esposti alle radiazioni.
Panoramica
Il saggio del micronucleo basato sul flusso di immagini offre un approccio completamente automatizzato per valutare la genotossicità e la citotossicità, affrontando i limiti dei metodi tradizionali. Questo protocollo utilizza la citometria a flusso con imaging multispettrale per migliorare il throughput e ridurre la soggettività nel punteggio.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Valutazione della genotossicità
- Valutazione della citotossicità
- Tecniche di imaging automatizzate
Sfondo
- I saggi del micronucleo tradizionali si basano sulla microscopia manuale, che è laboriosa e soggettiva.
- La microscopia automatizzata e la citometria a flusso convenzionale hanno limiti in termini di throughput e conferma visiva.
- L'imaging multispettrale a flusso può automatizzare l'imaging e il punteggio dei micronuclei.
- Questo studio presenta un protocollo dettagliato per implementare questo saggio automatizzato.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo di saggio del micronucleo completamente automatizzato.
- Migliorare l'accuratezza e l'efficienza delle valutazioni di genotossicità e citotossicità.
- Minimizzare la variabilità tra valutatori nel punteggio dei micronuclei.
Metodi utilizzati
- Esposizione cellulare a clastogéni e/o aneugéni seguita da incubazione e recupero.
- Uso di citocalasina B per facilitare il saggio.
- Citometria a flusso con imaging multispettrale per l'imaging automatizzato e il punteggio.
- Creazione di maschere per identificare le cellule binucleate e i micronuclei.
Principali risultati
- Automazione di successo del saggio del micronucleo utilizzando la citometria a flusso con imaging.
- Miglioramento del throughput e riduzione della soggettività nel punteggio.
- Tutti gli eventi richiesti per determinare la genotossicità e la citotossicità sono stati automaticamente immaginati e punteggiati.
- Il protocollo ha dimostrato riproducibilità e affidabilità nei risultati.
Conclusioni
- Il saggio del micronucleo automatizzato è un'alternativa praticabile ai metodi tradizionali.
- Questo approccio migliora l'efficienza dei test di genotossicità e citotossicità.
- Le applicazioni future potrebbero includere lo screening ad alto rendimento nello sviluppo di farmaci.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Automated genotoxicity assessment using multispectral imaging flow cytometry addresses critical bottlenecks in early safety testing by eliminating scorer subjectivity and enabling high-throughput, reproducible data generation. This capability supports predictive de-risking of lead compounds by providing quantitative, image-verified micronucleus frequency data essential for go/no-go decisions in preclinical development. The method enhances translational continuity by delivering standardized, auditable outputs that align with regulatory expectations for mechanistic biomarker validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of clastogenic and aneugenic pathways through automated detection of micronuclei in binucleated cells.
- Operational Value: Reduces inter-scorer variability and labor-intensive manual microscopy, increasing assay reproducibility across discovery teams.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of DNA damage mechanisms by providing statistically significant micronucleus frequency data at varying cytotoxicity levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates image-verified, dose-responsive micronucleus and cytotoxicity readouts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Enables batch processing of 20,000 events per sample with automated feature extraction, improving throughput and data consistency.
- Platform Reuse: Stores all imagery in dose-specific files, facilitating retrospective analysis and cross-study comparison in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers quantitative genotoxicity metrics that align with preclinical safety assessment requirements for lead optimization.
- Operational Value: Provides reproducible, automated scoring of binucleated cells with and without micronuclei, supporting continuity from discovery to IND-enabling studies.
- Risk Mitigation: Enables detection of statistically significant micronucleus increases at sub-lethal cytotoxicity levels, improving early identification of genotoxic liabilities.
Pipeline & Workflow Integration
The automated micronucleus assay integrates into the discovery continuum from early mechanistic interrogation through lead identification to preclinical safety evaluation, providing image-based genotoxicity data that informs compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification of DNA damage mechanisms by enabling automated identification of micronuclei in fixed, stained cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized mask-based identification of binucleated cells and micronuclei, ensuring reproducible event enumeration.
- Analytics: Provides quantitative outputs including micronucleus frequency, cytotoxic index, and polynucleated cell counts, facilitating comparative analysis across test conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating auditable, image-stored data suitable for regulatory submission and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging flow cytometry capability for genotoxicity screening across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genotoxicity assessment through automated, image-verified scoring of micronuclei and cytotoxic endpoints.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated feature extraction and batch processing of imaging flow cytometry data.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by delivering early, quantitative genotoxicity signals.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on statistically significant micronucleus frequency data relative to solvent controls.
Implementation Considerations
- Expertise in multispectral imaging flow cytometry operation, mask creation, and feature analysis using IDEAS software.
- Instrumentation requiring 405 nm laser excitation, high sensitivity mode, and specific channel configuration for Hoechst 33342 DNA staining.
- Cross-team standardization of analysis templates, mask definitions, and region settings to ensure consistent binucleated cell and micronucleus identification.
- Adaptation considerations include optimizing cytochalasin B concentration and recovery time based on cell line doubling characteristics.
- Practical limitations include the requirement for cell enlargement via hypotonic treatment and dependence on high-quality DNA staining for accurate nuclear segmentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Clastogen and/or Aneugen Exposure
1:49
Sample Processing
3:50
Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC)
5:15
Binucleated Cell (BNC) Identification
6:48
Micronucleus (MN) Identification
7:53
Polynucleated Population Identification
8:41
BNC and MN Mask Examination
9:52
Statistics Table Creation
10:31
Experimental File Batch Processing
11:10
Results: Representative Cell Scoring and Cytotoxicity Quantification
12:23
Conclusion
