Uso dell'immunofluorescenza en faccia per osservare direttamente le cellule endoteliali vascolari

Questo protocollo aiuta le persone ad analizzare la morfologia delle cellule endoteliali e l'espressione delle molecole nelle regioni, sotto diverse sollecitazioni di taglio dei fluidi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una valutazione diretta delle cellule endoteliali vascolari sotto diverse sollecitazioni di taglio del fluido. Quando si esegue questa procedura, i passaggi chiave sono utilizzare paraformaldeide preparata al momento e eseguire una buona perfusione.

Iniziare questa procedura con l'anestesia di un mouse C57BL/6 di 12 settimane, come descritto nel protocollo di testo. Confermare la corretta anestetizzazione pizzicando delicatamente la coda. Rastremi le zampe del mouse su una pila di tovaglioli di carta, con nastro adesivo.

Tenere la pelle del topo con le forcep e tagliare la pelle con un paio di forbici dall'addome alla parte superiore del torace. Aprire la cavità addominale, sotto la gabbia toracica, con un paio di forbici affilate. Sollevare lo sterno con le forcep e tagliare il diaframma.

Quindi tagliare la gabbia toracica per esporre la cavità toracica. Tagliare la vena cava appena sopra il fegato con le forbici. La pressione perfonde l'albero arterioso per cinque minuti, con soluzione salina normale pre-refrigerata contenente 40 unità per millilitro eparina, attraverso il ventricolo sinistro, fino a quando i polmoni e il fegato diventano pallidi.

Quindi perfondere con paraformaldeide pre-refrigerata al 4% in PBS per quattro minuti. Rimuovere tutti i muscoli, gli organi e il grasso, fino a quando l'aorta non è esposta. Posizionare il mouse al microscopio di sezionamento.

Utilizzare forcelle delicate e un paio di delicate forbici per esporre chiaramente l'aorta sotto un microscopio sezionante e rimuovere il tessuto connettivo lungo l'aorta, nel modo più pulito possibile. Sezionare l'aorta toracica dal cuore al tronco celiaco con un paio di delicate forbici. Posizionare l'aorta in un piatto di coltura cellulare di sei centimetri, con PBS.

Tagliare l'aorta longitudinalmente, prima lungo la curva minore, quindi utilizzare i microscissori per aprire i tre rami dell'arco aortico, incluso l'innominato, la carotide comune sinistra e l'arteria succlavia sinistra lungo la curva maggiore fino a quando il segmento rettilineo non viene soddisfatto. Permeabilizzare l'aorta con 1%poossietilene ottilfenile etere, in PBS per 10 minuti. Quindi bloccare l'aorta con siero di capra normale al 10% in soluzione salina tamponata con tris contenente il 2,5% di polisorbato 20 per un'ora a temperatura ambiente, in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzi.

Successivamente incubare l'aorta nel tampone di blocco contenente cinque grammi per millilitro coniglio anti-VCAM1 e cinque grammi per millilitro ratto anti-VE-Cadherin, durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver risciacquato il campione tre volte con la soluzione di lavaggio, applicare gli anticorpi secondari coniugati a fluorescenza per un'ora a temperatura ambiente, mantenendosi in un luogo buio. Risciacquare altre tre volte nella soluzione di lavaggio.

Controsostenere l'aorta con DAPI per 10 minuti, mantenendosi in un luogo buio. Quindi sciacquare l'aorta macchiata tre volte in soluzione di lavaggio. Posizionare l'aorta su un coperchio scivolare con la superficie lumenale verso il basso e spostarla lentamente in una soluzione di montaggio antifade che è stata precedentemente lasciata cadere sullo scivolo di copertura.

Allungare delicatamente l'aorta per mantenere piatto il campione. Invertire lo scivolo di copertura e metterlo sullo scivolo di vetro. Fare attenzione a evitare bolle d'aria tra il campione e il vetro.

Esaminare l'aorta con un microscopio confocale a scansione laser. Analizza le intensità di colore di diversi canali dalla regione desiderata nelle immagini en face, con il software Image-Pro Plus. Sono mostrate immagini di colorazione dell'immunofluorescenza delle cellule endoteliali vascolari dell'aorta del topo.

L'immunofluorescenza della proteina di adesione delle cellule vascolari e l'espressione con ve-cadherina come marcatore endoteliale sono mostrate sotto diversi modelli di flusso provenienti da diverse regioni dell'aorta del topo. Dapi è stato anche controsostenibile per mostrare i nuclei cellulari per una migliore visualizzazione. Quando si guardano attraverso le pile Z al microscopio, le cellule muscolari endoteliali e lisce possono essere facilmente distinte per la loro morfologia dei nuclei cellulari.

I nuclei cellulari endoteliali sono di forma ovale e più grandi dei nuclei cellulari lisci a forma di mandrino. L'espressione del VCAM-1 era più abbondante nelle regioni sotto flusso disturbato, a curvatura minore dell'arco di aorta, rispetto alle regioni sotto flusso costante, a una maggiore curvatura dell'arco di aorta e all'aorta toracica. Qui le aree di curvatura minore di un aorta del topo sono indicate come aree di flusso d, e la maggiore curvatura e toracica.

Con la giusta modifica, questa tecnica può essere applicata anche all'analisi della permeabilità vascolare e alla posizione delle macromolecole nell'intima cellulare endoteliale.