Name: Quotidiano fototerapia con luce rossa per sviluppo di Biofilm di regolare dei albicans del Candida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Scopri come la fototerapia con luce rossa a 635 nm interferisce con la crescita dei biofilm di Candida albicans. Questo protocollo di 48 ore offre un approccio innovativo per migliorare le terapie antifungine.

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Ringraziamo il Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal e Dr. Iriana Zanin per lo sviluppo di questo studio. Riconosciamo anche il Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) per donare il ceppo analizzato in questo studio.

1. preparazione di terreni di coltura
<ol><li>Preparare il sabouraud agar destrosio (SDA). Sospendere 65g di SDA completato con cloramfenicolo (50 mg/L) in 1000 mL di acqua distillata. Far bollire per sciogliere completamente il mezzo. Sterilizzare in autoclave a 15 PSI (121° C) per 30 min. raffreddare a 45-50 ° C. Mescolare bene e versare 20 mL di SDA in piastre di Petri sterili (dimensioni: 100 x 15 mm).</li>
	<li>Preparare il lievito azoto base (YNB) supplementato con 100 millimetri di glucosio mescolando 6,7 g di YNB e 18 g di destrosio a 1.000 mL di acqua ultrapura. Mescolare con un agitatore e sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di vuoto filtro da 0,22 µm.</li>
	<li>Preparare RPMI mescolando 10,4 g di RPMI 1640 e 34,32 g di 3-(N-morfolino) acido propansulfonico (MOPS) a 1.000 mL di acqua ultrapura. Mescolare in un agitatore senza calore e regolare il pH a 7 aggiungendo 1 N NaOH (aggiungere 2 g di NaOH a 50 mL di acqua distillata). Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di vuoto filtro da 0,22 µm.</li>
</ol>2. pre-inoculo e inoculo
<ol><li>Togliere il microrganismo SN425 albicans del c. dal − 80 ° C congelatore e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente. 10 µ l di colture stock su piastre di Petri contenente SDA completato con cloramfenicolo (50 mg/L) del seme. Incubare le capsule di Petri aerobicamente a 37 ° C per 48 h.</li>
	<li>Dopo 48 h di incubazione, è necessario aggiungere 10 colonie di albicans del c. a 10 mL di azoto di lievito base (YNB) medie completati con 100 millimetri di glucosio e incubare aerobicamente a 37 ° C per 16 h per il pre-inoculo.</li>
	<li>Dopo incubazione per 16 ore, preparare gli Inoculanti diluendo le colture starter in mezzo fresco YNB completato con 100 millimetri di glucosio in un 01:10 proporzione (1 mL della coltura starter diluita in 9 mL di YNB). Misurare la densità ottica iniziale (OD) a 540 nm.</li>
	<li>Incubare gli Inoculanti aerobicamente a 37 ° C per 8 h fino a quando i ceppi di raggiungono la fase di crescita del Mid-log e misurano il finale assorbanza a 540 nm. Sottrarre il finale OD da OD iniziale per controllare se sul diametro esterno dell'Inoculanti sono la fase di crescita del Mid-log (8h, basato sulle curve di crescita nella Figura 1).</li>
	<li>Per raggiungere un inoculo con 107 cellule mL-1, centrifugare l'inoculo per 5 min a 5.500 x g, scartare il surnatante e concentrare l'inoculo a metà del volume dei tubi.</li>
</ol>3. di biofilm e fototerapia
<ol><li>Aggiungere 1 mL di inoculo dei pozzetti di una piastra di polistirolo 24 pozzetti. Incubare aerobicamente a 37 ° C per 90 min consentire l'adesione delle cellule per il fondo dei pozzetti.</li>
	<li>Utilizzare un rosso non coerente luce (vedere Tabella materiali) come fonte di luce con lunghezza d'onda di 635 ± 10 nm e una potenza di uscita fissa di 1.460 mW cm− 2.</li>
	<li>Utilizzare un misuratore di potenza per misurare la densità di potenza della luce. L'esposizione radiante applicato è 87,6 J cm-2, equivalente a circa 1 min di esposizione. Utilizzare la formula di densità di energia (J/cm2) = densità di potenza (W/cm2) x tempo di irraggiamento (s). Applicare una distanza di 5 mm tra la sorgente luminosa e il biofilm per evitare il riscaldamento del campione.</li>
	<li>Trattare il biofilm di controllo positivo con clorexidina 0,12% per 1 min e controllo negativo biofilm con 0.89% NaCl per 1 min.</li>
	<li>Dopo i trattamenti, lavare tutti i biofilm due volte con soluzione di NaCl 0,89%.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 tamponata con 3-(N-morfolino) acido propansulfonico (MOPS) a pH 7 per il biofilm e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Al mattino, si applicano gli stessi trattamenti come passaggi 3.2 a 3.6, lavare il biofilm due volte con 0.89% NaCl, aggiungere nuove RPMI tamponata con MOPS (1 mL, pH 7) ai pozzetti e incubare aerobicamente a 37 ° C.</li>
	<li>Lo stesso giorno, dopo 6 h, esporre il biofilm a luce rossa. Trattare il biofilm di controllo positivo con clorexidina 0,12% per 1 min e controllo negativo biofilm con 0.89% NaCl per 1 min. Dopo i trattamenti, lavare il biofilm due volte con soluzione di NaCl 0,89%.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.2-3.8 fino al raggiungimento di 48 h di sviluppo di biofilm. Nota: In sostanza, un trattamento avverrà la mattina e l'altro accadrà nel pomeriggio dello stesso giorno (6h apart).</li>
</ol>4. elaborazione
<ol><li>Aggiungere 1 mL di sterile 0,89% NaCl al pozzo per rimuovere il biofilm di graffiare dal bene usando un puntale. Aggiungere il biofilm rimosso in una provetta sterile.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di sterile 0,89% NaCl al pozzo. Graffiarlo nuovamente e aggiungere la sospensione al tubo stesso per un volume totale di 2 mL.</li>
	<li>Unità formanti colonie (CFU)<ol>
<li>Vortice vigorosamente la sospensione di biofilm per 1 min. Dalla sospensione biofilm, utilizzare un'aliquota di 0,1 mL per la diluizione seriale.</li>
		<li>Diluire la sospensione di biofilm da 10-1 fino a 10-4 in 0.89% NaCl soluzione.</li>
		<li>50 μL di ogni diluizione a piastre SDA di semi e incubare le piastre a 37 ° C per 48 h.</li>
		<li>Contare le colonie e applicare la formula CFU/mL = numero di colonie x 10n / q (n = diluizione; q = volume di teste di serie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peso a secco<ol>
<li>Pesare ed etichettare provette microcentrifuga.</li>
		<li>Dalla sospensione biofilm, utilizzare 0,1 mL per la determinazione del peso a secco (biomassa).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto ad un'aliquota di 0,1 mL del biofilm e conservare a-20 ° C per 18 h. Dopo 18 h, centrifugare a 10.000 x g per 10 min.</li>
		<li>Eliminare il supernatante, posizionare i tubi su un essiccatore ad asciugare i campioni per una settimana e pesare nuovamente la microcentrifuga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polisaccaridi solubili in acqua (WSPs) e polisaccaridi solubili in alcali (ASPs)
	<ol>
<li>Dalla sospensione biofilm, vigorosamente vortice il resto del volume (1,8 mL) per 1 min e centrifugare a 5.500 × g per 10 min a 4 ° C. Conservare il supernatante in un nuovo tubo e lavare il precipitato due volte con le cellule, che contengono i costituenti insolubili della matrice extracellulare con acqua ultrapura sterile (5.500 × g, 10 min a 4 ° C).</li>
		<li>Risospendere il contenuto insolubile a 1,8 mL di acqua distillata sterile.</li>
		<li>Polisaccaridi solubili in acqua (WSPs) Nota: Eseguire questo esperimento in una cappa aspirante.<ol>
<li>Dal surnatante stored, riserva 1 mL per la quantificazione dei polisaccaridi solubili in acqua (WSPs).</li>
			<li>Omogeneizzare il surnatante stored per 1 min. Trasferire in provette sterili, quindi aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 95%. Conservare i capillari per 18 ore a-20 ° C per WSPs precipitazioni.</li>
			<li>Dopo 18 h, centrifugare le provette a 9.500 x g per 20 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante.</li>
			<li>Lavare tre volte con etanolo 75% i campioni e asciugare il pellet. Risospendere il pellet con 1 mL di acqua distillata sterile e quantificare il WSP utilizzando il metodo fenolo-solforico acido.</li>
			<li>Utilizzare il glucosio 0,1% (0,01 g di glucosio a 10 mL di acqua ultrapura) per la curva standard (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 e 25 µ l di glucosio per provetta).</li>
			<li>Aggiungere 200 µ l di fenolo al 5% (2,7 mL di fenolo al 90% a 47,3 mL di acqua ultrapura) in una provetta di vetro composto da 200 µ l di campione o curva standard scegliere (in triplice copia per campione) e mescolare con cautela.</li>
			<li>Aggiungere 1 mL di acido solforico al tubo e mescolare. Attendere 20 minuti per la reazione e misurare i campioni utilizzando uno spettrofotometro (490 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Polisaccaridi solubili in alcali (ASPs) Nota: Eseguire questo esperimento in una cappa aspirante.<ol>
<li>Da quello che ri-sospensione insolubile, separare 1 mL per la determinazione dell'ASPs. Centrifugare le aliquote di ogni sospensione di biofilm (13.000 x gper 10 min a 4 ° C).</li>
			<li>Rimuovere con cautela il surnatante di ogni tubo. Quindi posizionare i campioni su un concentratore a vuoto per asciugare il pellet.</li>
			<li>Pesare i pellet e aggiungere 300 µ l di NaOH N 1 (2 g di NaOH a 50 mL di acqua ultrapura) per 1 mg di peso a secco. Li Incubare per 2 ore a 37 ° C e poi Centrifugare a 13.000 × g per 10 min.</li>
			<li>Raccogliere con cautela i surnatanti con una pipetta e trasferimento per microcentrifuga, mantenendo il pellet.</li>
			<li>Ancora una volta, aggiungere un volume equivalente di 1 N NaOH ai tubi che comprende il pellet e ripetere la stessa procedura come sopra per l'estrazione di ASP.</li>
			<li>Dopo incubazione per 2 h, centrifugare i campioni (13.000 x g per 10 min), accuratamente raccogliere i surnatanti e aggiungere i surnatanti raccolti in precedenza.</li>
			<li>Per la terza estrazione, ripetere la stessa procedura come sopra, ma questa volta, non Incubare i campioni per 2 h prima di centrifugazione.</li>
			<li>In seguito, aggiungere tre volumi di etanolo al 95% per ogni campione. Quindi, d'archivio i campioni a − 20 ° C per 18 h per precipitazione di ASP.</li>
			<li>Centrifugare le provette (9.500 × g per 20 min a 4 ° C) ed eliminare i sovranatante.</li>
			<li>Lavare ogni pallina tre volte con etanolo al 75% e asciugare all'aria (stesse procedure fatto per WSP). Risospendere il pellet in uguale volume totale dell'estrazione prima con 1 N NaOH.</li>
			<li>Leggere i campioni per la quantificazione di ASP utilizzando il fenolo-solforico (stesso per quanto riguarda analisi WSP).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species%3A+current+epidemiology%2C+pathogenicity%2C+biofilm+formation%2C+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li>
<li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms%3A+effects+on+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li>
<li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today+Technologies%22%5BJournal%5D)">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li>
<li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li>
<li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+super+glue%3A+the+biofilm+matrix+and+its+composition%2C+assembly%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828(2016).</li>
<li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection%3A+efficacy%2C+safety%2C+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li>
<li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941(2015).</li>
<li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372(2017).</li>
<li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).</li>
<li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li>
<li>Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li>
<li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth%2C+adhesion+and+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias++Do++Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li>
<li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression%3A+a+genome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li>
<li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I passaggi più critici per la coltura di successo del biofilm di albicans del c. sono: 1) per fare il pre-inoculo e l'inoculo in mezzo YNB completato con 100 millimetri di glucosio; 2) ad aspettare 90 min per la fase di adesione e lavare accuratamente due volte i pozzetti con 0.89% NaCl per rimuovere le cellule non rispettato; e 3) per aggiungere il terreno RPMI alle cellule aderite per avviare la formazione di biofilm, poiché RPMI stimolerà la crescita di ife. Aneuploidi possono verificarsi quando la coltura di...

L'aumentata incidenza di diabete, terapia immunosopressiva applicazioni, l'infezione da HIV, epidemia di AIDS, procedure cliniche invasive e consumo di antibiotici ad ampio spettro, negli ultimi anni hanno aumentato l'incidenza di Candida albicans correlate a malattie1,2. Infezioni da c. albicans sono comunemente legati allo sviluppo di biofilm e può causare manifestazioni cliniche, quali la candidosi, o manifestazioni sistemiche, quali candidemia1,2. Uno dei fattori di virulenza più degno di nota della crescita di biofilm è l'istituzione di matrice polisaccaride extracellulare. Formazione di biofilm coopera per aumentare la resistenza ai farmaci antimicotici esistenti, stress ambientale e host meccanismi immuni3.
La crescita di biofilm di c. albicans inizia con l'aderenza iniziale delle cellule planctoniche su un substrato, seguita dalla propagazione di cellule di lievito attraverso la superficie del substrato e la crescita ifale. L'ultima fase di crescita di biofilm è la fase di maturazione, in cui sviluppo lievitiforme è soppresso, lo sviluppo ifale si espande e la matrice extracellulare racchiude il biofilm4. C. albicans esopolisaccaridi (EPS) nella matrice interagiscono per formare i mannano-glucano complesso5,6. L'interazione di esopolisaccaridi è fondamentale per la difesa dei biofilm contro farmaci7. Quindi, la riduzione di EPS da c. albicans extracellulare potrebbe sostenere lo sviluppo di nuovi protocolli di antibiofilm per controllo di candidosi orale.
Luce regola la crescita, sviluppo e comportamento di diversi organismi8 ed è stato applicato come un antimicrobico in chemioterapia fotodinamica antimicrobica (patto). Patto si applica una luce visibile di una specifica lunghezza d'onda e un fotosensibilizzatore luce-assorbente9. Tuttavia, i fotosensibilizzanti hanno difficoltà a penetrare il biofilm, causando più bassa efficacia10. Il fallimento degli agenti terapeutici per infiltrarsi completamente biofilm è un motivo che i biofilm resistono occasionalmente tradizionale terapia antimicrobica3,5. Per disattivare le cellule microbiche recintate, antimicrobici devono permeare attraverso la matrice extracellulare; Tuttavia, l'EPS caratterizza un ostacolo diffusionale per tali molecole spingendo il loro livello di trasporto in biofilm o di influenzare la risposta dell'antimicrobico con matrix stessa11.
Considerando gli svantaggi del patto, l'uso della luce di per sé emerge come un'importante miglioria. Dati preliminari hanno rivelato che il trattamento con luce blu due volte al giorno ha inibito significativamente la produzione di EPS insolubile nel biofilm di Streptococcus mutans . Tramite la diminuzione di insolubile in EPS, luce blu diminuita crescita di biofilm. Tuttavia, i risultati della fototerapia con luce rossa nel biofilm albicans del c. sono scarsi. Quindi, l'obiettivo di questa ricerca era di valutare in quali fototerapia modo utilizzando luce rossa influenza la crescita e la disposizione dei albicans del c. biofilm. Per il trattamento due volte al giorno, abbiamo adattato protocolli precedenti12 9,per fornire un modello semplice e riproducibile biofilm che offre risposte per quanto riguarda la redditività, del nostro laboratorio polisaccaridi extracellulari e di peso a secco importi dopo il trattamento di luce rossa. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per testare altre terapie.

<table><tbody><tr><td>Cloresidina 20%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio (D-glucosio) Anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A&nbsp;</td><td>Gruppo medico LumaCare, Newport Beach, CA, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagenti&nbsp;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo 5%</td><td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 tamponato con 3-(N-morfinolino)</td><td>Sigma</td><td>R7755</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud destrosio agar integrato con cloramfenicolo</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Lievito a base di azoto&nbsp;</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>acido 3-(N-morfolino)propansolfonico MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Piastra in polistirene a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

quotidiano fototerapia con luce rossa per sviluppo di biofilm di regolare dei albicans del candida

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Qui, presentiamo un protocollo per valutare gli esiti della diaria di luce rossa trattamento sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Per aumentare la crescita planctonica di albicans del c. SN425, gli Inoculanti è cresciuto il lievito azoto Base media. Per la formazione di biofilm, RPMI 1640 media, che hanno alte concentrazioni di aminoacidi, sono state applicate per aiutare la crescita di biofilm. Biofilm di 48 h sono stati curati due volte al giorno per un periodo di 1 min con un dispositivo di luce non coerente (luce rossa; lunghezza d'onda = 635 nm; densità di energia = 87,6 J·cm-2). Come controllo positivo (PC), 0,12% clorexidina (CHX) è stato applicato e come controllo negativo (NC), 0,89% NaCl è stato applicato il biofilm. Unità formanti colonia (UFC), a secco-peso, solubili e insolubili esopolisaccaridi sono stati quantificati dopo i trattamenti. In breve, il protocollo presentato qui è semplice, riproducibile e fornisce risposte per quanto riguarda la redditività, gli importi di polisaccaride extracellulare e di peso a secco dopo trattamento luce rossa.

Figura 2 Visualizza i risultati del registro10 CFU/mL di albicans del c. dopo trattamenti diaria con luce rossa per 1 min. luce rossa ha ridotto significativamente il Log10 UFC/mL rispetto al CN (p = 0,004). Figura 3 presenta i risultati della biomassa (mg) di c. albicans biofilms dopo trattamenti giornalieri. Tutti i gruppi hanno mostrati riduzione della biomassa rispetto al CN curati (p =...

Qui, presentiamo un protocollo per valutare il risultato dell'applicazione di luce rossa sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Un dispositivo di luce rossa non coerente con la lunghezza d'onda di 635 nm e densità di energia di 87,6 J·cm-2 è stato applicato durante la crescita di Candida albicans biofilm per 48 h.

Quotidiano fototerapia con luce rossa per sviluppo di Biofilm di regolare dei albicans del Candida

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida è la causa più comune di infezione fungina diffusa negli ospiti immunocompro compromessi. L'incapacità degli agenti terapeutici di infiltrarsi completamente nel biofilm a causa della matrice è uno dei motivi per cui i biofilm resistono alle terapie tradizionali. Il nostro protocollo valuta come la fototerapia, utilizzando la luce rossa, interferisca con la crescita e la disposizione dei biofilm candida albicans.I metodi applicati sono ben consolidati, poiché il ceppo utilizzato in questo studio aveva la sua matrice extracellulare caratterizzata e il dispositivo luminoso è stato applicato con successo ad altre sospensioni e biofilm di microrganismi planctonici. Il più grande vantaggio di questo dispositivo è la riduzione dei tempi di trattamento, che lo rende più visibile per le applicazioni cliniche. Quando si coltivano Candida albicans essere consapevoli che gli anticorpi possono essere acquisiti.Pertanto, è importante non utilizzare colonie che hanno più di sette giorni, non iniziare le piastre a quattro gradi Celsius e non ristriare le cellule dalle piastre esistenti. Allo stesso modo, un ceppo deve essere usato prima di 18 ore di crescita notturna. Quando si utilizza uno spettrofotometro per la prima volta è importante ottenere prima la fattoria delle colonie nel conteggio delle unità, per correlare ai valori di densità ottica.Pertanto, gli esperimenti inizieranno a utilizzare la fase centrale di crescita nella concentrazione iniziale delle cellule da 10 a sette cellule per millilitri. Questa concentrazione cellulare ha dimostrato di fornire i biofilm di materia più dipendenti e stabili. Per iniziare, sospendere 65 grammi di SDA, integrati con 50 milligrammi per litro di cloramfenicolo, in 1.000 millilitri di acqua distillata in un becher.Posizionare il becher su un riscaldatore per far bollire, al fine di sciogliere completamente il mezzo. Quindi trasferire il supporto in una bottiglia di vetro. Posizionare il tappo sulla bottiglia, ma non avvitarlo completamente per assicurarsi che la bottiglia sia in grado di sfogarsi.Mettere la bottiglia in autoclave per sterilizzare la soluzione a 15 PSI e 121 gradi Celsius per 30 minuti. Raffreddare la soluzione a circa 45 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta sterile usa e getta, per mescolare bene, e pipettare 20 millilitri di SDA in piastre di Petri sterili.Per preparare il mezzo YNB, integrato con glucosio millimolare 100 millimolare, mescolare 6,7 grammi di YNB e 18 grammi di destrosio a 1.000 millilitri di acqua ultra pura in un bicchiere. Posizionare una barra di agitazione nel becher e mettere il becher su una piastra di agitazione per mescolare. Filtrare il mezzo attraverso un sistema di filtranti sottovuoto da 0,22 micrometri per sterilizzare.Preparare il mezzo RPMI mescolando 10,4 grammi di RPMI-1640 e 34 grammi di MOPS, a 1.000 millilitri di acqua ultra pura. Mescolare in un agitatore senza calore e regolare il PH a sette aggiungendo un normale idrossido di sodio. Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di filtranti sottovuoto da 0,22 micrometri.In primo luogo, scongelare il microrganismo Candida albicans SN 425 a temperatura ambiente. Semi 10 microlitri della coltura di arresto su piastre petri precedentemente preparate contenenti SDA, integrate con cloramfenicolo. Incubare i piatti di Petri aerobicamente a 37 gradi Celsius per 48 ore.Per il pre-inoculo utilizzare un lubrificante sterilizzato per raccogliere 10 colonie di albicani Candida dalle piastre di Petri e metterli in un tubo di centrifuga contenente 10 millilitri di mezzo YNB, integrato con glucosio. Incubare il tubo aerobicamente a 37 gradi Celsius per 16 ore. Quindi, preparare gli inoculi aggiungendo questa coltura iniziale nel mezzo YNB fresco, integrato con glucosio, in una proporzione da uno a 10 per la diluizione.Utilizzare lo spettrofotometro per misurare l'OD iniziale a 540 nanometri. Incubare gli inoculi aerobicamente a 37 gradi Celsius per otto ore e misurare l'OD finale a 540 nanometri. Sottrarre l'OD finale dall'OD iniziale per verificare se l'OD degli inoculi è in fase di crescita a metà log.Per ottenere un inoculo con 10 alle sette cellule per millilitro, centrifugare l'inoculo per cinque minuti a 5.500 volte G.Versare il supernatante in un bicchiere contenente ipoclorito di sodio e aggiungere YNB fresco per concentrare l'inoculo a metà del volume precedente. Aggiungere un millilitro dell'inoculo ad ogni pozzo di una piastra di polistirolo da 24 pozzetti. Incubare aerobicamente a 37 gradi Celsius per 90 minuti per consentire l'adesione cellulare al fondo dei pozzi.Trattare i biofilm per un minuto con un millilitro dello 0,12% di clorexidina per i biofilm a controllo positivo. Per il controllo negativo, trattare i biofilm per un minuto con un millilitro sterile, 0,89% cloruro di sodio. Successivamente, lavare i pozzi due volte, un minuto ciascuno, con un millilitro di cloruro di sodio sterile allo 0,89% per rimuovere le cellule non aderenti.Quindi accendi una luce rossa non coerente e usa un misuratore di potenza per misurare la densità di potenza della luce. Determinare il tempo di esposizione in base al fabbisogno di densità energetica di 87,6 joule per centimetro quadrato. Posizionare la piastra sotto la luce rossa.Mantenere la distanza tra la sorgente luminosa e il biofilm a cinque millilitri per evitare di riscaldare il campione. Dopo l'esposizione per un minuto, aggiungere un millilitro del mezzo RPMI sterilizzato ad ogni pozzo e incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Al mattino, ripetere lo stesso lavaggio, trattamento leggero, trattamenti di controllo positivi e negativi e incubazione per sei ore con mezzo RPMI.Ancora una volta, lavare i biofilm due volte, esporli a luce rossa ed eseguire trattamenti di controllo positivi e negativi. Aspirare la soluzione nei pozzali e aggiungere il mezzo RPMI. Ripetere l'incubazione, il lavaggio, il trattamento leggero e i trattamenti di controllo positivi e negativi, fino a raggiungere 48 ore di sviluppo di biofilm.Per iniziare la lavorazione, scartare il mezzo e aggiungere un millilitro di sterile, 0,89% cloruro di sodio al pozzo, e utilizzare una punta di pipetta per graffiare il biofilm dal pozzo. Trasferire il biofilm rimosso su un tubo sterile. Aggiungere un altro millilitro di sterile, 0,89% cloruro di sodio al pozzo.Graffiare di nuovo e aggiungere la sospensione allo stesso tubo, per un volume totale di 2 millilitri. Vortice vigoroso della sospensione del biofilm per un minuto. Per l'analisi CFU, trasferire un'aliquota di 0,1 millilitri dalla sospensione del biofilm a un tubo di micro centrifuga contenente 900 microlitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,89% per ogni diluizione.Diluire la soluzione di biofilm da 10 a quella negativa, a 10 a quattro negativi, in soluzione salina. Seme 50 microlitri di ogni diluizione alle piastre SDA e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 48 ore. Contare le colonie e applicare la formula.Per l'analisi del peso a secco, pesare ed etichettare prima i tubi di microfuga. Aggiungere 0,1 millilitri della sospensione del biofilm e un millilitro di etanolo assoluto nei tubi e conservarli a -20 gradi Celsius per 18 ore. Quindi, centrifugarlo 10.000 volte G per 10 minuti.Scartare il supernatante e posizionare i tubi in un essiccatore per asciugare i campioni per una settimana. Pesare di nuovo i tubi di micro centrifuga e fare la sottrazione per ottenere il peso della biomassa. In questo esperimento, dopo trattamenti giornalieri con luce rossa per un minuto ai biofilm Candida albicans, il CFU è stato ridotto, rispetto al controllo negativo trattato con cloruro di sodio.I risultati della biomassa dei biofilm Candida albicans dopo trattamenti quotidiani, mostrano che il gruppo trattato a luci rosse ha presentato una riduzione della biomassa simile a quella osservata nel gruppo di controllo positivo, trattato con clorexidina. I due gruppi hanno inoltre mostrato una somiglianza statistica tra loro. Mentre entrambi hanno mostrato una riduzione della biomassa, rispetto al controllo negativo trattato con cloruro di sodio.Quantità inferiori di Candida albicans solubili e insolubili EPS, sono state osservate in controllo positivo, rispetto al controllo negativo. Anche se non statisticamente significativa, l'applicazione giornaliera del semaforo rosso ha diminuito numericamente le quantità di EPS solubili ed EPS insolubili. Il controllo negativo e il gruppo trattato a luci rosse hanno mostrato somiglianza statistica.Misurare la densità di potenza della luce, utilizzando un misuratore di potenza prima di iniziare il trattamento per determinare i periodi esatti di applicazione. I passaggi assicurano che la densità energetica sarà sempre di 87,6 joule per centimetro al quadrato. Utilizzare la formula citata in precedenza.La misurazione viene effettuata utilizzando lo stesso dalla luce alla bottiglia delle piastre, cinque millimetri. Un'associazione tra fototerapia e farmaci antifungini può essere studiata per verificare se il pretrattamento con luce rossa, seguito dall'applicazione di farmaci, migliora la penetrazione del farmaco nel biofilm. Per il trattamento due volte al giorno abbiamo adattato i protocolli del nostro laboratorio, fornendo un modello di biofilm facile e riproducibile, che fornisce risposte su vitalità, peso secco e quantità extracellulari di polisaccaride dopo il trattamento a luci rosse.Il protocollo è generico e può essere utilizzato per testare altre terapie, oltre alla luce rossa, inclusi farmaci, altre luci o la combinazione di luce e farmaci. Lavorare con microrganismi richiede attrezzature speciali, come occhiali di sicurezza, camice da laboratorio a bottone e guanti nitro.

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La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l'efficacia dell'aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.

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Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis

Questo protocollo descrive l'applicazione della terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) in un modello murino di candidosi orale. L'aPDT è stata eseguita utilizzando una miscela solubile in acqua di curcuminoidi e luce LED blu.

Terapia fotodinamica antimicrobica mediata da curcuminoidi su un modello murino di candidosi orale

Il significato delle piccole colonie nella resistenza ai farmaci di Candida spp. non è stato completamente esplorato. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) offre una strategia promettente contro le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Questo studio dimostra che l'aPDT mediata dal bengala rosa disattiva efficacemente la Candida glabrata e induce piccole colonie, presentando una procedura unica.

Induzione di piccole colonie in Candida glabrato tramite terapia fotodinamica mediata dal Rose Bengala

Un dispositivo LED a luce blu da 405 nm dimostra efficacia antimicrobica contro un'ampia gamma di patogeni della ferita quando valutato su un modello cutaneo sintetico a base di collagene. Questo approccio semplificato in vitro offre un'alternativa riproducibile ed eticamente valida per la valutazione nelle fasi iniziali delle terapie antimicrobiche basate sulla luce.

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Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.

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