Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Questo protocollo offre una strategia rapida ed efficiente per utilizzare contemporaneamente due test per schermare diverse centinaia di composti per i loro effetti sulla crescita cellulare. I test possono fornirci informazioni sul fatto che composti specifici siano citotossici, inibiscono la crescita cellulare o migliorano la crescita cellulare. Utilizzando i due test insieme, siamo in grado di aumentare la precisione e identificare composti citotossici.

Nei casi in cui i risultati dei due saggi divergono, questa strategia può permetterci di identificare composti con effetti unici sulla funzione cellulare che possono essere ulteriormente esaminati con altri mezzi. Il vantaggio principale di questa strategia è che è veloce, economico e non laborioso. Una volta padroneggiato, consente ai ricercatori di eseguire facilmente uno schermo primario fino a 200 composti in una settimana, quindi eseguire una curva di risposta alla dose esaustiva su 10-15 composti in un'altra settimana.

A dimostrare la procedura ci saranno io e Rohini Manickam, scienziato dello staff e compagno di maturità del laboratorio. In primo luogo, in un armadietto di sicurezza biologica, le cellule di coltura in un pallone T75 con mezzo NSC in modo che siano almeno confluenti all'80% all'inizio del test. E posizionare il pallone in un incubatore di coltura cellulare fissato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere il pallone dall'incubatore e aspirare fuori dal mezzo NSC. Aggiungere tre millilitri di reagente di dissociazione cellulare e incubare per cinque minuti nell'incubatrice. Dopo l'incubazione, aggiungere sette millilitri di mezzo NSC nel pallone e pipettare vigorosamente per assicurarsi che tutte le cellule si distaccno.

Trasferire la soluzione cellulare dissociata in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante dal tubo e sospendere di nuovo le celle in 10 millilitri di mezzo NSC. Utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro per contare le cellule e aggiungere il mezzo NSC nel tubo per riadattare la concentrazione di cellule a 200.000 cellule per millilitro.

Quindi, utilizzando sei degli otto slot di un pipettor multicanale a otto canali per placcare 100 microlitri della miscela cellulare colonna per colonna in 60 pozzi interni di tre piastre a 96 pozzi che sono state rivestite da matrice extracellulare. Aggiungere 100 microlitri di supporto di base o mezzo NSC a tutti i pozzi senza celle per ridurre al minimo la potenziale evaporazione da pozzi più esterni contenenti cellule. Al microscopio a coltura cellulare, ispezionare visivamente almeno 10 pozzi su ciascuna delle tre 96 piastre del pozzo per confermare che le cellule sono seduti alla densità prevista.

Incubare a 37 gradi Celsius e al cinque per cento di anidride carbonica. Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore da 16 a 24 ore dopo la scissione e aspirare fuori colonna media NSC per colonna con un pipettor multi-pozzo a otto canali, utilizzando solo sei degli otto slot multi-pozzo. Aggiungere 95 microlitri di mezzo NSC fresco a ciascun pozzo delle tre piastre replicate e riposizionare le piastre nell'incubatore.

Con un pipettor multi-pozzo a otto canali, aggiungere 49 microlitri di mezzo NSC in ciascuno dei 60 pozzali interni di una piastra vuota con fondo a U, con fondo a V o a fondo rotondo 96. Srotopare la piastra composta principale preparata. Pipettare un microlitro del composto dalla piastra principale in ciascuno dei 60 pozzetti interni contenenti mezzo NSC e mescolare il composto diluito tre volte con un pipettor da banco.

Successivamente, rimuovere le tre piastre di 96 pozza di NSC dall'incubatore e erogare cinque microlitri del composto diluito in ogni pozzo delle tre piastre che contengono cellule per produrre una diluizione da uno a 1000 per la concentrazione finale del composto di 10 micromolare con una concentrazione DMSO dello 0,1%Incubare celle con composto per 72 ore e procedere con test di citotossicità. Per eseguire il test di risposta alla dose, impostare un pozzo 96. Utilizzare la colonna due per sei repliche di controllo DMSO e testare triplicati fino a tre composti diversi a due diluizioni seriali, a sei dosi, a partire da un'alta dose di 10 micromolari.

Diluire quattro microlitri di DMSO al 100% o di composto di prova in DMSO in 196 microlitri di mezzo NSC in un tubo di microcentrifugo da 0,5 o 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri del DMSO diluito per controllare i pozzi e 50 microlitri dei composti di prova diluiti ai loro pozzi corrispondenti. Pipetta 25 microlitri di NSC medio ai restanti pozzi vuoti nella parte interna della piastra del pozzo 96.

Con un pipettor multicanale, trasferire 25 microlitri del composto dai 10 pozzi micromolari ai cinque pozzi micromolari e mescolare almeno cinque volte. Sostituire le punte della pipetta e ripetere il processo mescolando le file rimanenti per generare triplicati a due diluizioni per un totale di sei dosi per ciascuno dei composti. Trasferire cinque microlitri di ogni diluizione in una nuova piastra con celle di coltura che sono in fase di test.

Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo che le cellule sono state incubate per 72 ore, rimuovere la piastra dall'incubatore e posizionarla all'interno del lettore di piastre. Aprire il software imager per impostare i file di protocollo e di esperimento per lo studio.

Passare alla modalità manuale imager in Task Manager e fare clic su Acquisisci ora. Scegli 96 piastre e il tipo di nave. Selezionare 10 volte per l'ingrandimento e la proteina fluorescente rossa 531 e 593 per l'imaging tdTomato.

Clicca su un pozzo. Quindi fare clic su Messa a fuoco automatica per mettere a fuoco l'immagine ed Esporre automaticamente per il tempo di esposizione corretto. Regolare manualmente la messa a fuoco e l'esposizione, se necessario.

Fare clic sull'icona della fotocamera per acquisire l'immagine. Quindi fare clic su Analisi processo sopra l'immagine per continuare a creare il protocollo. E selezionare la scheda Analisi.

A destra dell'immagine fare clic su Analisi cellulare in Aggiungi passaggio analisi e quindi su Avvia. L'immagine mostra le celle evidenziate per indicare ogni singola cella. Fare clic sulla selezione Opzioni per modificare i parametri per selezionare meglio le celle in base alla soglia di fluorescenza o alle dimensioni della cella.

Se l'imager conta correttamente le celle, fare clic su Aggiungi passaggio nella parte inferiore dello schermo. Fare clic sull'icona nella parte superiore dello schermo per creare un esperimento dal set di immagini. Nella finestra aperta fare clic su Procedura nella scheda Protocollo.

Quindi, nella nuova finestra visualizzata, selezionare Leggi. Fate clic su Piastra completa (Full Plate) per selezionare solo i 60 pozzi che contengono le celle. Fare clic su OK per salvare le modifiche.

Quindi fare clic su OK nella finestra Procedura. Fare clic sull'icona Riproduci per eseguire la piastra. Nel prompt salvare il file e quindi nel prompt Piastra di caricamento fare clic su OK. Al termine dell'imaging, scaricare i dati del conteggio delle celle dal programma software imager in un foglio di calcolo per l'analisi.

Entro due ore dal completamento dell'imaging tdTomato, iniziare il test MTT. Pesare 25 milligrammi di MTT e sospenderlo in cinque millilitri di mezzo NSC per realizzare cinque milligrammi per millilitro soluzione stock MTT. Vortice la soluzione per diversi minuti, fino a quando non ci sono precipitati visibili di MTT.

Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare il mezzo di coltura cellulare. Diluire MTT da uno a 10 in mezzo NSC fresco e aggiungere 100 microlitri dell'MTT diluito ad ogni pozzo di cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore.

Un precipitato violaceo è visibile approssimativamente in proporzione al numero di cellule nel pozzo. Aspirare la soluzione MTT dalle piastre e aggiungere 50 microlitri di 100%DMSO a ciascun pozzo. Posizionare le piastre su uno shaker a temperatura ambiente per 10 minuti a 400 giri/min.

Successivamente, trasferire la piastra a un lettore di lastre. Leggere l'assorbanza di ogni pozzo alla lunghezza d'onda preimpostata di 595 nanometri ed esportare i dati in foglio di calcolo per l'analisi, esattamente come per i dati del conteggio delle celle. L'esame delle immagini della fluorescenza del tdTomato ha rivelato due pozzi discordanti per la tossicità tra l'MTT e il saggio sul conteggio delle cellule.

Per un pozzo, i dati sul conteggio delle cellule non hanno suggerito tossicità. Ma i dati MTT sì. Un altro pozzo aveva sovrastimato il numero di cellule per MTT rispetto al numero di tdTomato, e sembrava avere cellule più grandi, mentre nei pozzi in cui MTT sottovalutò il numero di cellule rispetto a tdTomato, le cellule sembravano essere più piccole.

In sintesi, il saggio tdTomato ha classificato 11 composti come tossici, 11 come inibitori della crescita e uno come miglioramento della crescita, con 34 che non hanno alcun effetto apparente sulla crescita cellulare. Il saggio MTT ha classificato 13 composti come tossici, due come inibitori della crescita e uno come miglioramento della crescita, con 41 che non hanno alcun effetto apparente sulla crescita cellulare. Il grafico delle cellule vitali per il composto WP1066 mostra una curva relativamente piatta senza tossicità per le quattro concentrazioni più basse.

La curva cade rapidamente alla dose di cinque micromolari e scende a tossicità quasi completa a 10 micromolari, il che porta alla dose letale 50 come micromolare 4.4 e 6.0 per il test tdTomato e il saggio MTT. È fondamentale che i composti siano correttamente diluiti nella schermata di risposta alla dose in modo da generare la curva di risposta alla dose corretta. I composti identificati da questa procedura per influenzare la crescita cellulare possono essere ulteriormente caratterizzati da test funzionali per identificare percorsi di segnalazione potenzialmente nuovi che controllano la crescita cellulare.

I composti tossici per le cellule staminali neurali sono stati testati come potenziali agenti terapeutici per i tumori cerebrali, come il glioblastoma e il neuroblastoma. Indossare sempre guanti e un camice da laboratorio quando si maneggiano cellule di mammiferi, DMSO e MTT. Smalti DMSO e MTT secondo le Linee guida sui rifiuti chimici della tua istituzione.