Name: Collezione Gamete e Fecondazione in vitro di Astyanax mexicanus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Impara la fecondazione in vitro in Astyanax mexicanus per ottenere embrioni sincronizzati per studi genetici e di biologia dello sviluppo. Questo metodo consente di spostare i cicli riproduttivi in orari diurni facilitando la raccolta.

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Gli autori ringraziano Philippe Noguera e Kimberly Bland per il loro sostegno alla produzione video. Gli autori desiderano anche riconoscere l'intero team Aquatics dell'Istituto Stowers per l'allevamento degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti istituzionali a DPB e NR. NR è stato sostenuto dalla Edward Mallinckrodt Foundation e dalla JDRF. RP è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Istituto Stowers per la ricerca medica.
1. Manipolazione del ciclo di luce
<ol><li>Impostare vasche di pesce all'interno di un sistema di acquacoltura opaco, completamente chiuso (protezione della luce), acquacoltura fluttuosa contenente più file di serbatoi (Figura 1). NOTA: Il sistema di flusso come illustrato nella Figura 1 utilizza l'acqua del sistema per lavare i rifiuti attraverso il tubo del supporto posteriore di ogni serbatoio e scorre in un pozzetto che si svuota in uno scarico sanitario. In questo esperimento, è stato utilizzato un tasso di cambio dell'acqua di un gallone (US) all'ora attraverso un emettitore a goccia.</li>
	<li>Mantenere la temperatura di ogni serbatoio con un elemento di riscaldamento indipendente che viene utilizzato per modificare manualmente la temperatura durante il processo di innesco.</li>
	<li>Impostare singole righe in modo da abilitare fotoperiodi separati in ciascuna di esse. Installare porte su ogni fila che possono essere chiuse per evitare che la luce entri o escenda. NOTA: Il controllore automatico può consentire la manipolazione di tutti i fotoperiodi con il minor disturbo al pesce.</li>
	<li>Equipaggiare il rack con una luce di lavoro rossa e tende oscuranti per l'accesso durante le ore buie.</li>
</ol>2. Regolazione del fotoperiodo e dell'innesco dei pesci per la raccolta dei gameti
<ol><li>Rimuovere il pesce desiderato (Figura 2a) dai rack di sistema generali e posizionarlo in rack di allevamento per consentire la regolazione del fotoperiodo 14 giorni prima dell'innesco. NOTA: Questo permette al pesce di acclimatarsi in un nuovo ambiente.</li>
	<li>Tenere il pesce a 22,8 gradi centigradi durante questo periodo utilizzando il sistema di riscaldamento acquatico installato. Il fotoperiodo normale è dalle 6:00 alle 20:00 luce e dalle 20:00 alle 6:00. Per il rack del ciclo di luce, spostare il fotoperiodo alle 10:00 di luce e dalle 12 alle 22.00 scuro regolando il timer che alimenta la luce all'interno del rack. NOTA: Maschi e femmine sono alloggiati nello stesso serbatoio per consentire comportamenti naturali di innesco. Mentre la deposizione delle uova può avvenire nel serbatoio, i pesci possono ancora essere utilizzati per la fecondazione in vitro poiché i gameti vengono rilasciati nelle fasi11.</li>
	<li>Una volta che i pesci sono acclimatati, iniziare ad innesco gli animali per la deposizione delle uova5 come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.5. NOTA: questa procedura richiede sei giorni in totale. Nel corso di questo tempo, modificare la temperatura per innescare la produzione di olio utilizzando un sistema di riscaldamento acquatico installato. Utilizzando i riscaldatori acquatici 50W (vedi Tabella deimateriali), impostare il riscaldatore direttamente alla temperatura (la scala sul riscaldatore è in Fahrenheit) indicata nel protocollo ad ogni passo. A seconda delle dimensioni del serbatoio e della velocità di flusso dell'acqua, il tempo di regolazione della temperatura può variare. In questo esperimento, la temperatura è stata regolata a mezzogiorno e l'equivocazione della temperatura ha assunto i successivi 18 h.<ol>
<li>Il primo giorno, alzare la temperatura da 22,8 gradi centigradi a 24,4 gradi centigradi.</li>
		<li>Il secondo giorno, alzare la temperatura da 24,4 gradi centigradi a 26,1 gradi centigradi.</li>
		<li>Il giorno 3 e 4, mantenere la temperatura a 26,1 gradi centigradi. I pesci saranno pronti per la deposizione delle uova durante il giorno e la fecondazione in vitro potrà essere eseguita. NOTA: A seconda dei singoli pesci, le femmine possono deporre le uova il giorno 3 e/o il giorno 4. Si consiglia di cercare di ottenere ovuli il giorno 3 e/o il giorno 4 a seconda del successo della collezione di ovuli.</li>
		<li>Il giorno 5, abbassare la temperatura da 26,1 gradi centigradi a 24,4 gradi centigradi.</li>
		<li>Il giorno 6, abbassare la temperatura da 24,4 gradi centigradi a 22,8 gradi centigradi. NOTA: fornire un intervallo di 7 giorni prima di ripetere questo ciclo di temperatura. Si raccomanda di continuare a mantenere il pesce in questo fotoperiodo poiché questo ridurrà il tempo complessivo necessario al pesce per adattarsi a questo ciclo di luce spostata.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Collezione femminile di gameti
<ol><li>Iniziare inserendo una salvietta di tessuto inumidito in un coperchio del piatto Petri e chiudendo il piatto per creare una camera umida e impedire che l'ovulo si secchi durante il processo di raccolta.</li>
	<li>Quindi scegliere una femmina per la raccolta. I pesci gravidi con grandi addominali sporgenti saranno probabilmente la scelta migliore per questa procedura (Figura 2a). NOTA: Per distinguere tra maschi e femmine dell'adulto A. mexicanus,è stato utilizzato il metodo del batuffolo di cotone12.</li>
	<li>Immobilizza una femmina usando acqua refrigerata e mettila in posizione supina in un portaanimali spugna inumidita. Fatelo mettendo il pesce in acqua di sistema a 4 gradi centigradi per almeno 30 s o fino a quando il pesce non viene immobilizzato (cioè, perdita di movimento della branchia, vedere Ross e Ross13 per i dettagli). NOTA: Lavorare rapidamente e cercare di evitare il riscaldamento del pesce fino al completamento della procedura. Questo può includere periodicamente immergere le punte guantate delle dita in acqua fredda o offrire anestesia supplementare. Possono essere utilizzati anche altri metodi di anestesia (ad esempio, MS-22213). Secondo le linee guida IACUC dello Stowers Institute for Medical Research, la raccolta manuale di ovuli è considerata una procedura non invasiva, che non richiede un'anestesia completa (ad esempio, attraverso MS-222).</li>
	<li>Una volta posizionato, macchiare il lato ventrale del pesce con una pulizia del tessuto delicato come contatto con l'acqua causerà l'attivazione dell'ovulo.</li>
	<li>Tenere la femmina tra il pollice e l'indice. Stringere delicatamente contro i lati laterali della cavità coelomica nella direzione dell'apertura urogenitale mentre rotola leggermente le dita. Raccogliere l'ovulo espresso utilizzando una spatola usa e getta.</li>
	<li>Trasferire questi ovuli al piatto di Petri umido. NOTA: Diverse frizioni di ovuli possono essere combinate nello stesso piatto se non sono necessari dati di parentela specifici. L'ova può essere conservato a 24 gradi centigradi e può essere utilizzato per la fecondazione in vitro entro 30-60 min dopo la raccolta.</li>
	<li>Dopo la raccolta, restituire delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero riempito con acqua di sistema. NOTA: Riporre il pesce nel serbatoio buio per la futura raccolta di ovuli quando necessario.</li>
</ol>4. Collezione di gameti maschili
<ol><li>Scegli un maschio per la raccolta. NOTA: Non ci sono segni esteriormente visibili di qualità gameti maschile. Tuttavia, i pesci dovrebbero apparire sani nell'aspetto prima dell'uso in questa procedura. Per distinguere tra maschi e femmine di Adult o. mexicanus,è stato utilizzato il metodo del batuffolo di cotone12.</li>
	<li>Immobilizza un maschio usando acqua refrigerata e posizionalo in posizione supina in un portaanimali spugna inumidito. Immobilizzare mettendo il pesce in acqua di sistema a 4 gradi centigradi per almeno 30 secondi o fino a quando il pesce non è immobilizzato (cioè, perdita di movimento della branchia, vedere Ross e Ross13 per i dettagli). NOTA: Lavorare rapidamente e cercare di evitare il riscaldamento del pesce fino al completamento della procedura. Questo può includere periodicamente immergere le punte guantate delle dita in acqua fredda o offrire anestesia supplementare. Altri metodi di anestesia (ad esempio, MS-22213) possono essere utilizzati anche qui. Secondo le linee guida IACUC dello Stowers Institute for Medical Research, la raccolta manuale di spermatozoi è considerata una procedura non invasiva, che non richiede un'anestesia completa (ad esempio, attraverso MS-222).</li>
	<li>Blot il lato ventrale del pesce con una pulizia del tessuto delicato come contatto con l'acqua attiverà il milt.</li>
	<li>Posizionare delicatamente l'estremità di un tubo capillare all'apertura urogenitale.</li>
	<li>Espellere il milt applicando una leggera pressione sui lati del pesce con il pollice e l'indice. Iniziare a disfare dislocante alle branchie, muovendosi verso l'apertura urogenitale.</li>
	<li>Raccogliere il milt alla fine di un tubo capillare. L'aspirazione delicata può essere necessaria mediante l'uso di un tubo aspiratore. Evitare eventuali feci che possono essere espulse con il milt.</li>
	<li>Distribuisci il milt in un tubo di centrifuga vuoto da 1,5 mL e diluicono con il doppio del volume dello sperma Extender E400 (vedi Tabella deimateriali). Tieniti sul ghiaccio. NOTA: Milt da più maschi possono essere raggruppati insieme se non sono necessari dati di parentela specifici. Questo passaggio può essere utilizzato per estendere l'orario di lavoro del milt per diverse ore, ma non è necessario per la fecondazione immediata.</li>
	<li>Dopo la raccolta, restituire delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero riempito con acqua di sistema. NOTA: Riporre i pesci nel serbatoio buio dell'armadio per la futura raccolta di spermatoceri quando necessario.</li>
</ol>5. Fecondazione in vitro
<ol><li>Utilizzando una nuova pipetta per ogni supporto, mescolare lo sperma pipeting e / o agitare il lato del tubo prima di fertilizzare come sperma in milt può stabilirsi nella soluzione E400 nel tempo.</li>
	<li>Distribuisci la soluzione milt o estesa in un'ova appena raccolta.</li>
	<li>Aggiungere rapidamente 1 mL di acqua di sistema alla frizione per attivare lo sperma e le uova per la fecondazione. Evitare di mescolare o agitare il contenuto del piatto e lasciare che si verifichino 2 min per la fecondazione. NOTA: La miscelazione e l'agitazione riducono notevolmente i tassi di fecondazione e dovrebbero quindi essere evitati14.</li>
	<li>Aggiungere E2 Embryo Media per riempire il piatto 2/3rd pieno. NOTA: a seconda della procedura successiva, gli embrioni possono essere utilizzati immediatamente (ad esempio, per l'iniezione di costrutti genetici come descritto prima dei15) o gli embrioni possono essere incubati in E2 Embryo Media a 23 gradi centigradi fino a raggiungere i 5 dpf. A questo punto trasferire gli embrioni al sistema di alloggiamento di ricircolo principale utilizzando l'acqua del sistema.</li>
</ol>

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<li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre la fecondazione in vitro è un metodo standardizzato per molti organismi modello diversi come il pesce zebra, i protocolli esistenti per A. mexicanus non tengono conto del fatto che questa specie depone naturalmente durante le ore notturne6. Dato che i pesci grotta e i pesci di superficie differiscono drasticamente nei loro ritmi circadiani, il ciclo di maturazione dell'ova differisce anche tra i morfotipi della grotta e della superficie. Mentre le temperature di messa in scena e i ...

Negli ultimi anni, Astyanax mexicanus è diventato un organismo modello in diversi campi come la biologia dello sviluppo, la biologia evolutiva, la biologia comportamentale e la fisiologia1,2,3,4 . L'unicità di questo sistema deriva da questa specie che ha diversi morfotipi che si sono adattati ad ambienti molto diversi. Il morfotipo di abitazione superficiale vive in fiumi dove c'è un'alta biodiversità e un sacco di fonti di cibo per il pesce. Al contrario, i morfotipi delle caverne di A. mexicanus,i pesci grotta, vivono in grotte dove la biodiversità, le fonti di cibo e l'ossigeno sono drasticamente diminuite1. I pesci cavernicolo differiscono dai pesci di superficie in una varietà di fenotipi come l'assenza di occhi e pigmentazione, insulino-resistenza e la capacità di immagazzinare grasso2,3,4. Tuttavia, i pesci di superficie e i pesci cavernile appartengono ancora alla stessa specie e sono, quindi, interfertili.
Per entrambi i morfotipi è stata definita una serie di condizioni per consentire la manutenzione e l'allevamento di routine in condizioni di laboratorio5,6. Tuttavia, le modifiche genetiche, i giusti studi sullo sviluppo embrionale e la creazione di ibridi sono ancora impegnativi per diversi motivi. A. mexicanus depongono principalmente le uova durante le ore notturne, il che è scomodo per i successivi esperimenti sulle prime fasi embrionali come l'iniezione di costrutti genetici o il monitoraggio dei primi processi di sviluppo embrionale. Inoltre, la generazione di ibridi di superficie e grotta è difficile con la deposizione naturale delle uova, poiché i morfotipi della grotta hanno un ritmo circadiano alterato7 che in ultima analisi influisce sulla produzione di ovuli vitali. Sono state descritte procedure di successo, ma invasive, in fecondazione in vitro per altre specie di Astyanax, dove la produzione di gameti e il comportamento riproduttivo sono stati innescati con iniezioni ormonali8,9. Sono state descritte procedure di fecondazione in vitro meno invasive (ad esempio, l'ottenimento di gameti dalla deposizione manuale delle uova senza l'iniezione di preparati ormonali) ma non considerano le differenze nel ciclo di deposizione delle uova tra morfotipi di grotta e superficie di A. mexicanus 6.
Altri organismi modello di pesce, come il pesce zebra, possono essere facilmente geneticamente modificati e studiati a livello embrionale perché gli ostacoli sopra indicati sono stati risolti con successo. L'implementazione di tecniche di allevamento standardizzate, fecondazione in vitro e crioconservazione dello sperma hanno tutti spinto il pesce zebra in avanti e solidificato l'uso del modello nelle scienze biologiche10. Pertanto, estendere queste tecniche ad A. mexicanus lo rafforzerà ulteriormente come sistema modello.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la fecondazione in vitro che contribuirà a rendere A. mexicanus più accessibile. Presenteremo un setup di allevamento che consente di spostare i cicli di luce del pesce dal giorno alla notte in modo che gli ovuli vitali possano essere ottenuti durante le ore diurne senza iniezione di preparati ormonali. Forniamo quindi una descrizione dettagliata di come ottenere gli ovuli e i milt utilizzati per la fecondazione in vitro. Questo metodo consentirà la produzione di embrioni durante il normale orario di lavoro e renderà più fattibili ulteriori applicazioni a valle rispetto all'utilizzo di embrioni provenienti dalla deposizione naturale delle uova.

Provetta da <table><tbody><tr><td>centrifuga da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#22364111</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm</td><td>VWR International</td><td>#25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspiratore</td><td>Drummond&nbsp;</td><td>#2-000-000</td><td></td></tr><tr><td>Calibrato 1-5 & micro; L Tubi capillari</td><td>Drummond</td><td>#2-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Spatole sfoderabili</td><td>VWR International</td><td>#80081-188</td><td></td></tr><tr><td>HMA-50S Riscaldatori acquatici da 50 W</td><td>Finnex</td><td>HMA-50S</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetta</td><td>Eppendorf</td> <td># 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Puntali per pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>#2079E</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore Sanyo MIR-554</td>Estensore di sperma Panasonic <td>Health Care</td><td>MIR-554-PA</td><td></td></tr><tr><td>E400</td><td></td><td></td><td>130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-glucosio, 30 mM HEPES Regolare a pH 7,9 con&nbsp; 5M KOH e sterilizzare con filtro. La soluzione può essere conservata a 4 ? C per un massimo di 6 mesi.</td></tr><tr><td>Spugna Animal Holder</td><td></td><td></td><td>Realizzato con schiuma di scarto</td></tr><tr><td>Sistema Acqua</td><td></td><td></td><td>Deionizzata integrata con Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] per raggiungere una conduttanza specifica di 800 & micro; S/cm.&nbsp; I parametri di qualità dell'acqua sono mantenuti entro limiti di sicurezza (limite superiore dell'intervallo dell'azoto ammoniacale totale, 1 mg/L; limite superiore dell'intervallo dei nitriti, 0,5 mg/L; limite superiore dell'intervallo dei nitrati, 60 mg/L; temperatura, 22 &deg; C; pH, 7,65; ossigeno disciolto 100 %)</td></tr><tr><td>Salviette per tessuti</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>#21905-026</td><td></td></tr><tr><td>ZIRC E2 Embryo Media</td><td></td><td></td><td>15 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 150 &; M KH2PO4, 50 &; M Na2HPO4, 1,0 mM CaCl2, 0,7 mM NaHCO3. Regolare il pH da 7,2 a 7,4 utilizzando acido cloridrico 2 N. Filtro sterilizzare. Conservato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane.</td></tr></tbody></table>

collezione gamete e fecondazione in vitro di astyanax mexicanus

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Il messicano Astyanax sta emergendo come organismo modello per una varietà di campi di ricerca nella scienza biologica. Parte del recente successo di questa specie di pesci teleost è che possiede popolazioni interfertili di grotte e di riveri. Ciò consente la mappatura genetica dei tratti eritorabili che sono stati fissati durante l'adattamento ai diversi ambienti di queste popolazioni. Mentre questa specie può essere mantenuta e allevata in laboratorio, è difficile sia ottenere embrioni durante il giorno che creare embrioni ibridi tra i ceppi. La fecondazione in vitro (IVF) è stata utilizzata con una varietà di organismi modello diversi per allevare con successo e ripetutamente animali in laboratorio. In questo protocollo, mostriamo come, acclimatando A. mexicanus a diversi cicli di luce accoppiati con variazioni della temperatura dell'acqua, possiamo spostare i cicli riproduttivi a un momento scelto della giornata. Successivamente, mostriamo come identificare i pesci parentali adatti, raccogliere gameti sani da maschi e femmine e produrre prole vitale utilizzando la fecondazione in vitro. Ciò consente procedure correlate come l'iniezione di costrutti genetici o l'analisi dello sviluppo durante le normali ore di lavoro. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per creare ibridi tra la grotta e le popolazioni che vivono in superficie, e quindi consentire lo studio della base genetica degli adattamenti fenotipici in ambienti diversi.

Il protocollo qui presentato si basa principalmente su un protocollo6pubblicato in precedenza. Tuttavia, dal momento che A. mexicanus depone durante le ore notturne, abbiamo progettato un rack di alloggiamento per l'allevamento dei pesci che può cambiare il fotoperiodo indipendentemente dall'orario di lavoro (Figura 1). Il ciclo della luce del pesce viene modificato all'interno di un sistema di acquacoltura completamente chius...

La fecondazione in vitro è una tecnica comunemente utilizzata con una varietà di organismi modello per mantenere le popolazioni di laboratorio e produrre embrioni sincronizzati per applicazioni a valle. Qui, presentiamo un protocollo che implementa questa tecnica per diverse popolazioni del pesce tetra messicano, Astyanax mexicanus.

Collezione Gamete e Fecondazione in vitro di Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Astyanax mexicanus, noto anche come pesce grotta messicano cieco, sta emergendo come organismo modello per una varietà di campi di ricerca in scienze biologiche, in particolare nella comprensione dell'evoluzione dei tratti genetici adattivi. Questa specie è costituita da un morfo superficiale che abita il fiume e da un morfo che abita le caverne che ci consente di analizzare come due popolazioni della stessa specie si sono differenziate nel tempo. Tuttavia, affinché questa ricerca possa svolgersi, dobbiamo essere in grado di ottenere embrioni sani e outcross ibridi abbinati al tempo.Mentre questa specie è facilmente mantenuta e allevata in laboratorio, i pesci depongono le uova principalmente durante le ore notturne rendendo difficile ottenere embrioni appena deposti durante il giorno. In questo protocollo mostriamo come acclimatando Astyanax mexicanus a cicli di luce alterati e variazioni di temperatura siamo in grado di spostare i cicli riproduttivi in un momento più conveniente della giornata. Successivamente, mostriamo come identificare pesci genitori adatti e raccogliere gameti da maschi e femmine anestetizzati.Infine, dimostriamo come produrre prole vitale usando la fecondazi

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Biology

Biologia

Il pesce zebra è un potente sistema modello per la biologia dello sviluppo e la ricerca sulle malattie umane grazie alla loro somiglianza genetica con i vertebrati superiori. Questo protocollo descrive una metodologia per creare embrioni aploidi di zebrafish che possono essere utilizzati per strategie di screening in avanti per identificare mutazioni recessive in geni essenziali per l'embriogenesi precoce.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.

Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Protocolli per la crioconservazione di maturazione e lo sperma di anguilla europea sono state migliorate negli ultimi anni. Questo articolo viene descritto il protocollo migliore disponibile con gonadotropina corionica umana (hCG) per indurre la maturazione e metanolo come crioprotettore.

Gestione e trattamento di maschio anguilla europea (Anguilla anguilla) per maturazione ormonale e crioconservazione degli spermatozoi

In questo protocollo, vengono descritti metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci, per la formica Vollenhovia emeryi. Questi protocolli sono importanti per esperimenti volti a comprendere le basi genetiche dei sistemi di determinazione del sesso in imenotteri.

Induzione e la valutazione di Inbreeding croci utilizzando la formica, Vollenhovia Emeryi

In questo protocollo, dimostriamo come allevare gli adulti Astyanax mexicanus , sollevare le larve ed eseguire immunohistochemistry intero-monta il pesce post-larvale per confrontare i fenotipi della superficie e Grotta morfotipi.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Questo protocollo permette la visualizzazione dell'espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l'obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

Questo articolo delinea le condizioni di laboratorio di base e i protocolli per un regime di temperatura incrementale per stimolare la deposizione massima nel tetra Astyanax mexicanus messicano, che è un modello emergente per gli studi di sviluppo ed evolutivi.

Variazioni incrementali di temperatura per l'allevamento massimo e la deposizione delle uova in Astyanax mexicanus

Impara la fecondazione in vitro in Astyanax mexicanus per ottenere embrioni sincronizzati per studi genetici e di biologia dello sviluppo. Questo metodo consente di spostare i cicli riproduttivi in orari diurni facilitando la raccolta.

Collezione Gamete e Fecondazione in vitro di Astyanax mexicanus

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