Name: Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Impara l'imaging ex-vivo dei linfonodi con microscopia confocale per visualizzare T e B cellule nel topo. Questo metodo preserva la struttura tissutale e la vitalità cellulare per studi immunologici avanzati.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).

Il protocollo è stato approvato dal Comitato permanente sugli animali della Harvard Medical School e Brigham and Women's Hospital, protocollo 2016N000230.
1. Topi usati per l'esperimento
<ol><li>Utilizzare 8-settimana vecchi topi maschi e femmine sullo sfondo B6 per somministrare il mix di anticorpi.</li>
	<li>Utilizzare i mouse CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT per determinare se l'imaging LN intero ex vivo può essere applicato anche ai topi reporter senza somministrare la miscela di anticorpi, nonché per studiare la presenza di cellule mononucleari, inclusa la presentazione di antigene cellule e fagociti, e la loro distribuzione nella LN. NOTA: i topi cX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT presentano proteine fluorescenti verdi (GFP) e proteine fluorescenti rosse (RFP) inserite rispettivamente sotto il controllo dei promotori CX3CR1 e CCR2. I topi reporter possono essere utilizzati con o senza l'iniezione della miscela di anticorpi. Si prega di vedere il riferimento4 per l'iniezione di mix di anticorpi in un topo reporter. Procedere all'intervento chirurgico se non verrà iniettato alcun anticorpo.</li>
</ol>2. Preparazione e iniezione del mix di anticorpi
NOTA: eseguire questa procedura sui mouse descritti nel passaggio 1.1.
<ol><li>Diluire 1:10 di viola brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 di blu brillante (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) e 1:20 di phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) in PBS con il volume finale appropriato per iniettare nella coscia (per iniettare nella coscia interna (per iniettare nella coscia) (per immagine inguinale) o nella zampa pad (all'immagine popliteal) linfa. NOTA: Utilizzare come isotipi: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, controllo isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, - Controllo isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL). Se si modifica l'anticorpo di colorazione, utilizzare l'isotipo corretto.</li>
	<li>Per immaginare LN inguinale, iniettare 100 l del mix di anticorpi sottocutaneamente nella coscia interna (Figura 1A). In alternativa, iniettare 50 - L sottocutaneamente di miscela di anticorpi nel pad zampa per immagine popliteal LN (Figura 2A). Utilizzare delicate siringhe di insulina da 1 mL (Insulin U-100) con l'ago della taglia 0,30 mm x 13 mm (30 misuratore : 1/2 pollice). NOTA: Assicurarsi che l'iniezione per la colorazione LN inguinale sia sottocutanea e non intramuscolare (im.), poiché la miscela di anticorpi non verrà correttamente drenata se viene eseguita la somministrazione.</li>
	<li>Non anestesizzare gli animali prima dell'iniezione di miscela di anticorpi.</li>
	<li>Attendere un minimo di 3 h (dLN inguinale) e 12 h (dLN popliteal) dopo l'iniezione per rimuovere gli organi.</li>
	<li>Se l'etichettatura delle cellule LN non è completamente osservata utilizzando grandi coloranti fluorescenti polimerici come viola brillante o blu brillante, utilizzare fluorofori più piccoli, tra cui l'isotociociocianato di fluoresceina (FITC), PE e allophycocyanin (APC) come alternativa.</li>
</ol>3. Procedura chirurgica per rimuovere il linfonodo drenante inguinale
<ol><li>Topi eutanasi che utilizzano asfissia di CO2 seguita da lussazione cervicale.</li>
	<li>Immobilizza i topi sullo stadio acrilico con del nastro adesivo e applica l'olio minerale con un tampone di cotone sulla pelle addominale per evitare la deposizione di pelliccia intorno all'incisione (Figura 1B). La rimozione della pelliccia non è necessaria.</li>
	<li>Eseguire un'incisione mediana utilizzando forbici curve di microchirurgia (11,5 cm) e pinze curve di microchirurgia (12,5 cm) nell'addome dal pube al processo xifoideo (Figura 1C).</li>
	<li>Dissociare la muscolatura addominale dalla pelle (Figura 1D).</li>
	<li>Fare incisioni orizzontali della pelle nella parte superiore e inferiore della linea di incisione verticale per creare lembi della pelle sul lato di interesse (secondo il lato dell'iniezione di mix anticorpo) e sbattere la pelle per visualizzare il linfonodo (Figura 1E).</li>
	<li>Nastro la pelle-flap sulla piastra acrilica (Figura 1F).</li>
	<li>Rimuovere il linfonodo drenante inguinale utilizzando pinze curve di microchirurgia (Figura 1F). Il nodo linfo-falgioco apparirà come una sfera traslucida, di solito bilobulare, sotto la pelle.</li>
</ol>4. Procedura chirurgica per rimuovere il linfonodo di drenaggio popliteale
<ol><li>Topi eutanasi che utilizzano asfissia di CO2 seguita da lussazione cervicale.</li>
	<li>Immobilizzai i topi in una posizione prona sullo stadio acrilico con nastro adesivo e applica l'olio minerale con un tampone di cotone nel polpaccio e nel ginocchio (Figura 2A-D).</li>
	<li>Eseguire un'incisione mediana nel vitello dal tallonlo al ginocchio (Figura 2E,F).</li>
	<li>Dissociare la muscolatura del vitello dalla pelle (Figura 2F,G).</li>
	<li>Esporre la fossa popliteale (Figura 2G). Il linfonodo popliteale apparirà come una sfera traslucida nella fossa popliteale.</li>
	<li>Rimuovere il linfonodo popliteale utilizzando le pappe curve di microchirurgia (Figura 2G).</li>
	<li>In alternativa, capovolgere il mouse sulla posizione supina e avvicinarsi alla fossa popliteal tra bicipiti femoris e semitendinosus per la rimozione di LN popliteale eseguendo un'incisione mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio seguita da dissociazione del polpaccio muscolatura dalla pelle. NOTA: La fossa popliteale è una depressione poco profonda situata nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio. Aperto con attenzione per vedere il linfonodo popliteale.</li>
</ol>5. Preparazione del linfonodo
<ol><li>Posizionare l'intero organo in un piatto di coltura con fondo di vetro (35 mm x 10 mm) e rimuovere il grasso che circonda l'organo utilizzando prate curve di microchirurgia (Figura 1G-I e Figura 2H).</li>
	<li>Centralizzare l'organo al centro del piatto (Figura 1J e Figura 2H).</li>
	<li>Coprire l'organo con un frammento di delicati tergicristalli compito e tenerlo inzuppato con temperatura ambiente salino 0.9% o Fosfato Buffer Solution (Figura 1K-M e Figura 2H). NOTA: Non è necessario lavare i linfonodi dopo la rimozione o eseguire l'estrazione del linfonodo nel cofano.</li>
</ol>6. Microscopia confocale ex vivo (Imaging)
<ol><li>Posizionare il piatto Petri nello slot al microscopio confocale invertito (Figura1N e Figura 2H).</li>
	<li>Image LN al microscopio confocale (Figura 1O e Figura 2H).</li>
	<li>In primo luogo, ottenere la giusta messa a fuoco utilizzando la luce convenzionale del microscopio confocale con obiettivo 4x o 10x. Quindi passare dalla funzione di luce alla modalità laser. NOTA: Se il microscopio confocale non contiene un obiettivo 4x, la messa a fuoco può essere perfettamente ottenuta utilizzando l'obiettivo 10x.</li>
	<li>Regolare la potenza del laser, l'offset e il guadagno utilizzando un campione macchiato di isotipo, non macchiato o non fluorescente (Tabella 1) per rimuovere l'autofluorescenza e la colorazione non specifica da anticorpi fluorescenti come quelli utilizzati nelle immagini mostrate in questo (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 e PE anti-F4/80).</li>
	<li>Regolare le posizioni di xY, utilizzando rispettivamente la micrometrica e il carro, sull'area di interesse nel linfonodo. </li>
	<li>Acquisire immagini sotto 4x, 10x e 20x obiettivi concentrandosi sulla struttura LN e distribuzione cellulare. Usa la definizione di 1024 x 1024 pixel. NOTA: Acquisire un minimo di cinque immagini in diversi campi per obiettivo per animale.</li>
	<li>Analizza le immagini utilizzando un software di immagine per separare i canali, aggiungere scala e colori di interesse e ricostruire la vista 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
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<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
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<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l'immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l'uso dell'imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico3</su...

I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro1. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell'antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose2. Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie presenti nel sistema linfatico avrà importanti implicazioni per lo sviluppo del vaccino e l'immunoterapia del cancro.
L'avvento di potenti microscopi - tra cui nuovi microscopi confocali e super-risoluzione - ha permesso uno straordinario progresso nella comprensione di come si comportano le diverse popolazioni di cellule immunitarie nel loro ambiente nativo3. È ora possibile immaginare diversi sottotipi di cellule simultanee utilizzando una combinazione di sonde con topi geneticamente modificati che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di specifici obiettivi4,5. Infatti, tecniche ad alta dimensione, tra cui citometria di massa e analisi del flusso multi-parametrico sono state cruciali per espandere le nostre conoscenze su diverse compartimentazioni e funzionalità delle cellule immunitarie nella salute e nella malattia6, 7. Tuttavia, per preparare campioni per queste tecniche, i tessuti hanno bisogno di digestione e le cellule sono separate dal loro ambiente naturale per essere analizzate nelle sospensioni cellulari. Per superare queste limitazioni e consentire una migliore traduzione in biologia, l'obiettivo del protocollo qui proposto è quello di applicare una metodologia semplice per immagini ex vivo interi linfonodi utilizzando microscopi confocali stock con il vantaggio di una migliore velocità, tessuto conservazione della struttura e vitalità cellulare rispetto alla colorazione dell'immunofluorescenza convenzionale. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di dimostrare che i topi carenti per le cellule T, un sottotipo di linfocito T coinvolto nella difesa precoce dell'ospite contro i patogeni4, hanno follicoli compromessi e zone di cellule T rispetto ai topi di tipo selvatico. Questi risultati ci hanno permesso di seguire uno studio in cui abbiamo dimostrato che le cellule T di z svolgono un ruolo critico nell'omeostasi degli organi linfoidi e nella risposta immunitaria umorale4. Inoltre, questo protocollo fornisce un percorso fisiologico per le sonde e gli anticorpi per raggiungere il linfonodo, in quanto vengono somministrati sottocutaneamente e dissipati attraverso la circolazione linfatica dei tessuti, basandosi su precedenti rapporti che hanno utilizzato nell'etichettatura situ con anticorpi per visualizzare strutture associate a linfatiche8,9, dinamica del centro germinale10,11,12, e bersagli facilmente accessibili al flusso sanguigno13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Rat IgG2a, &kappa; Controllo isotipico</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 IgG2b di topo, controllo dell'isotipo K</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview piatto di coltura</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm con fondo in vetro</td></tr><tr><td>Siringhe per insulina</td><td>BD Plastipak-Insulin</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science Brand</td><td>7557</td><td>dimensioni 21 x 20 cm / 100 fogli per scatola</td></tr><tr><td>Pinze curve per microchirurgia</td><td>Strumenti chirurgici WEP</td><td>su misura</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Forbici curve per microchirurgia</td><td>Strumenti chirurgici WEP</td><td>su misura</td><td>11,5 cm</td></tr><tr><td>Ago</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>calibro & volte; &frac12; pollici</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R testa confocale</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>caricato con le 4 linee laser principali (405, 488, 543 e 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a, &kappa; Controllo isotipico</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td> <td>caricato con le 4 linee laser principali (405, 488, 543 e 647 nm)</td></tr></tbody></table>

visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale ex-vivo

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

I linfonodi (LN) sono organi sparsi all'interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l'immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell'interazione utilizzando l'imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l'iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.

Questo manoscritto mostra le tecniche per rimuovere i linfonodi inguinali e poplitali senza danneggiarne la struttura a seguito dell'iniezione di anticorpi fluorescenti per macchiare specifiche popolazioni cellulari in questi organi (Figura 1 e Figura 2 ).
La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule LN con BV421 anti-CD4 e BB515 anti-CD19 e analisi dell'imaging confocale ha definito la localizzazione delle cellule T (...

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Questo protocollo riproducibile e facile da eseguire utilizza una strategia di imaging dei linfonodi ex vivo per tracciare il drenaggio degli anticorpi fluorescenti etichettati fluorescenti somministrati in vivo agli organi linfoidi secondari locali. La dimostrazione di questa tecnica consente una visualizzazione specifica della procedura, che può facilitare un'esecuzione riuscita del protocollo. Questa è una tecnica molto semplice e diretta che può essere eseguita da chiunque.L'unico aspetto impegnativo è la gestione del mouse, che richiede un po 'di allenamento. Questa tecnica ha il vantaggio di una migliore conservazione dello sforzo tissutale a velocità e della vitalità cellulare rispetto ai metodi di colorazione fluorescente convenzionali. Ad allenare la procedura sarebbe Bruna Tatematsu, una tecnico del laboratorio.Diluire gli anticorpi di interesse, coniugati con i fluorofori appropriati, in 100 microlitri di PBS per l'imaging di linfonodi inguinali o 50 microlitri di PBS per l'imaging dei linfonodi poplitei. Per l'imaging dei linfonodi inguinali, caricare 100 microlitri del cocktail di anticorpi in una siringa per insulina millilitro, dotata di un ago da 30 gauge per mezzo pollice e iniettare sottocutaneamente gli anticorpi nella coscia interna del topo sperimentale. Per l'imaging dei linfonodi poplitei, iniettare 50 microlitri del cocktail di anticorpi per via sottocutanea in una zampa dell'animale sperimentale.Quindi riportare l'animale nella sua scatola di casa. Per la raccolta del linfonodo drenante inguinale, dopo aver atteso almeno tre ore dall'iniezione, immobilizzare il mouse sullo stadio acrilico con nastro adesivo e applicare olio minerale sulla pelle addominale. Utilizzare forbici di microchirurgia standard e forcette curve di microchirurgia per fare un'incisione della pelle mediana nell'addome dal pube al processo xifoide e dissociare la muscolatura addominale dalla pelle.Effettuare incisioni cutanee orizzontali nella parte superiore e inferiore della linea di incisione verticale, per creare lembi della pelle sul lato dell'iniezione e ritrarre la pelle per visualizzare il linfonodo. Fissare il lembo cutaneo alla piastra acrilica e utilizzare le forcep per rimuovere il linfonodo traslucido, di solito bilobulare sferico drenante inguinale. Per la raccolta dei linfonodi drenante poplitea, almeno 12 ore dopo l'iniezione, immobilizzare il topo in posizione prona su uno stadio acrilico.Applicare olio minerale sul polpaccio e sul ginocchio sul lato iniettato dell'animale. Successivamente, fare un'incisione della linea mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio e dissociare la muscolatura del polpaccio dalla pelle. Esponi la fossa poplitea.Il linfonodo popliteo apparirà come una sfera traslucida all'interno della fossa. Quindi, rimuovere il linfonodo con le forcep curve di microchirurgia. Per preparare il linfonodo per l'imaging, posizionare gli organi interi in un piatto di coltura di 35 per 10 millimetri con un fondo di vetro e utilizzare le forcelle per rimuovere qualsiasi grasso che circonda il tessuto.Centrare l'organo al centro del piatto e coprire il tessuto con un pezzo di tergicristallo delicato intriso di salina. Per l'imaging ex vivo, posizionare il piatto nello slot del microscopio confocale invertito e utilizzare la luce convenzionale del microscopio confocale e l'obiettivo 4-10X per ottenere la messa a fuoco corretta. Passare dalla funzione di luce alla modalità laser e utilizzare un campione macchiato di isotopi, non macchiato o non fluorescente per regolare la potenza, l'offset e il guadagno laser per rimuovere la fluorescenza automatica e qualsiasi colorazione non specificata.Acquisire immagini sotto gli obiettivi 4, 10 e 20X concentrandosi sulla struttura dei linfonodi e sulla distribuzione cellulare e utilizzando una definizione di 1024 per 1024 pixel. Quindi, utilizzare un programma software di analisi dell'imaging appropriato per separare i canali, aggiungere la scala e i colori di interesse e ricostruire la vista 3D. La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule linfonodo con anticorpi anti-CD4 e anti-CD19 e analisi di imaging confocale consente la localizzazione delle cellule T e B all'interno dei linfonodi inguinali.Nei linfonodi poplitei, come nel tessuto inguinale, i follicoli cellulari B sono circondati da popolazioni di cellule T, un segno distintivo della struttura dei linfonodi. Come osservato in queste immagini, i fagociti non interiorizzano gli anticorpi iniettati, indicando che la colorazione delle cellule B e T è specifica. Inoltre, la ri-ricostruzione dell'etichettatura indica che la colorazione delle celle T e B non si sovrappone, confermando ulteriormente la specificità della colorazione.Le cellule monocellulari si osservano in tutto il linfonodo inguinale, incluso il seno subcapsulare. Con la maggior parte delle cellule mononucleari che esprimono CX3XR1, seguite da cellule doppie positive CCR2 e CXCR31CCR2. Lo stesso modello di distribuzione cellulare e fenotipi cellulari si osserva nel linfonodo popliteo.Entrambi i linfonodi mostrano anche regioni scure senza espressione del recettore delle cellule mononucleari occupate dai linfociti. Inoltre, le cellule mononucleari sono scarse all'interno dell'area interna dei linfonodi, rimanendo concentrate nelle aree esterne del tessuto, indicando che queste cellule occupano principalmente il seno subcapsulare del linfonodo. La miscela di anticorpi deve essere iniettata con precisione nel tessuto sottocutaneo affinché il sistema linfatico scarichi correttamente gli anticorpi sul linfonodo.Questo metodo può essere applicato alla biodistribuzione di farmaci etichettati fluorescenti e agli studi di targeting cellulare di nanoparticelle etichettate fluorescenti.

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