Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi
31 marzo 2019
Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare thiazole orange per la rilevazione di DNA negli esperimenti di elettroforesi del gel. L'uso dell'arancio di tiazolo permette l'eliminazione del bromuro di etidio, e rilevazione di fluorescenza può essere realizzato con UV o luce blu.
Questo protocollo è un'alternativa facile ed economica all'uso del bromuro di etidio per il rilevamento del DNA durante l'elettroforesi. Rimuovendo il bromuro di etidio, la luce UV o la luce blu possono essere utilizzate per il rilevamento. La luce blu non è dannosa per il DNA, il che migliora le possibilità di successo per gli esperimenti a valle.
È davvero facile provarlo. Devi solo sostituire il bromuro di etidio nei tuoi gel con l'arancia tiazolo. Per iniziare, preparare mini-gel all'1% mescolando circa 0,7 grammi di agarosio in 70 millilitri di tamponi tris-acetato-EDTA o tris-borato.
Quindi, sciogliere l'arancione tiazolo in DMSO per creare una soluzione stock 10.000X. Sebbene non particolarmente sensibile alla luce, conservare l'arancione tiazolo al buio quando non è in uso. Per la conservazione a lungo termine, fare aliquote della miscela tiazolo arancione-DMSO e congelarle.
Quindi, aggiungere l'arancia tiazolo a una concentrazione finale di 1,3 microgrammi per millilitro e microonde la miscela di tampone di agarosio e arancia tiazolo per sciogliere l'agarosio per circa 60 secondi. Versare la miscela di agarosio in un apparecchio di fusione del gel contenente un pettine appropriato e lasciare che la soluzione di agarosio si solidifichiamo in un gel. Per caricare il gel, posizionare prima il gel nell'apparato di elettroforesi, se non già presente.
Quindi aggiungere il buffer di corsa TAE o TBE per coprire la superficie del gel. Successivamente, utilizzando un colorante di carico, caricare 10 microlitri di un campione di DNA. Includere una scala di dimensionamento del DNA come riferimento.
Fissare il coperchio e gli elettrodi ed eseguire il mini-gel a 100 volt fino a quando la tintura di carico viaggia di circa quattro-sette centimetri per un mini-gel. Se l'arancia tiazolo non è stata applicata prima della fusione del gel, macchiare il gel immergendolo nel tampone contenente arancia tiazolo con agitazione delicata per circa 20 minuti o fino a quando le bande non sono completamente rilevate. Per visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore UV, rimuovere il gel dall'apparato di elettroforesi e posizionarlo sul transilluminatore UV.
Per visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore a luce blu o una torcia elettrica, posizionare il gel sul transilluminatore a luce blu o dirigere la torcia a LED blu sul gel dall'alto o dal basso. Utilizzare un filtro ad emissione ambra per filtrare la luce blu, consentendo la visualizzazione della fluorescenza dai complessi arancioni tiazole del DNA e per proteggere i coloranti. Per un'ulteriore digestione o legatura, tagliare le bande di DNA desiderate dal gel e procedere all'estrazione del DNA utilizzando un kit o un protocollo prontamente disponibile.
Selezionare le impostazioni di eccitazione ed emissione appropriate nell'apparato gel-imaging. In assenza di un sistema di imaging con filtri appropriati, posizionare un filtro ambra tra la fotocamera e la sorgente di eccitazione gel blu-luce. I limiti di rilevamento sono simili tra bromuro di etidio, arancione tiazolo e un comune colorante di DNA commerciale rilevabile dalla luce blu, con il limite di rilevamento per tutti e tre i coloranti da uno a due nanogrammi per corsia in un mini-gel.
Il gel di agarosio tinto arancione tiazolo di un digest di restrizione è rilevabile quando è eccitato con un UV o un transilluminatore a luce blu o con una torcia a luce blu. Mentre l'arancione tiazolo sembra essere meno pericoloso del bromuro di etidio, i dispositivi di protezione individuale standard come guanti e occhiali dovrebbero ancora essere indossati.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un'alternativa semplice ed economica al bromuro di etidio per la rilevazione del DNA nell'elettroforesi su gel. Utilizzando l'arancio di tiazolo, i ricercatori possono impiegare luce UV o blu per la rilevazione della fluorescenza, migliorando la sicurezza del DNA durante gli esperimenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica clinica
- Biologia molecolare
- Tecniche di elettroforesi
Sfondo
- Il bromuro di etidio è un colorante per il DNA comunemente usato, ma comporta rischi per l'integrità del DNA.
- La tiadolo arancione offre un'alternativa più sicura per la visualizzazione del DNA.
- La rivelazione della fluorescenza può essere ottenuta utilizzando luce blu non dannosa.
- Questo metodo è economico e facile da attuare.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo per il rilevamento del DNA senza l'uso di bromuro di etidio.
- Dimostrare l'efficacia dell'orange di tiazolo nell'elettroforesi su gel.
- Evidenziare i vantaggi dell'uso della luce blu per la visualizzazione del DNA.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di mini-gel al 1% utilizzando agarosio e tamponi appropriati.
- Sostituzione del bromuro di etidio con tiazolo arancione nei gel.
- Rilevamento della fluorescenza mediante luce UV o blu.
- Valutazione dell'integrità del DNA dopo l'elettroforesi.
Risultati principali
- Il colorante thiazole orange colora efficacemente il DNA nell'elettroforesi su gel.
- Il rilevamento può essere effettuato in sicurezza utilizzando luce blu.
- Il protocollo è semplice e riproducibile.
- Gli esperimenti successivi mostrano tassi di successo migliorati grazie alla riduzione del danno al DNA.
Conclusioni
- Il tiolo arancione è un'alternativa valida al bromuro di etidio.
- L'utilizzo della luce blu minimizza i danni al DNA durante il rilevamento.
- Questo metodo migliora l'affidabilità di esperimenti successivi di biologia molecolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'elettroforesi su gel del DNA rimane un flusso di lavoro fondamentale nella validazione degli obiettivi e nello sviluppo di saggi, in cui l'integrità del campione influisce direttamente sull'affidabilità delle analisi successive. La sostituzione del bromuro di etidio con l'orange di tiazolo riduce il rischio genotossico mantenendo la sensibilità di rilevamento, favorendo processi di screening di composti e identificazione di composti promettenti più sicuri. Ciò consente ai team di ricerca e sviluppo dell'industria biotecnologica e farmaceutica di preservare la qualità del DNA per clonaggio, sequenziamento o saggi funzionali, senza compromettere produttività ed efficienza economica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi mediante l'analisi di frammenti di DNA senza introdurre artefatti indotti dalla colorazione che potrebbero alterare la conferma del bersaglio.
- Valore operativo: Compatibile con l'infrastruttura esistente per l'imaging a luce UV o blu, senza necessità di riprogettare il protocollo per laboratori che utilizzano attualmente bromuro di etidio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un dimensionamento quantitativo del DNA con limiti di rilevamento di 1-2 ng/lane, supportando un'analisi precisa dei frammenti per valutare l'efficienza della clonazione o convalidare i prodotti della PCR.
- Valore operativo: Elimina la gestione di rifiuti pericolosi e i requisiti speciali di smaltimento associati al bromuro di etidio, semplificando il rispetto delle norme di sicurezza in laboratorio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Preserva l'integrità del DNA per applicazioni successive come la ligazione, la trasformazione o la trasfezione, migliorando i tassi di successo nella generazione di costrutti per modelli preclinici.
- Valore operativo: Consente la visualizzazione con luce blu, riducendo i danni al campione indotti da UV e aumentando la riproducibilità tra esperimenti replicati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel flusso di lavoro della biologia della scoperta, in cui l'analisi del DNA orienta la validazione del bersaglio, l'identificazione del capostazione e lo sviluppo del costrutto preclinico, in particolare durante la valutazione di modifiche genetiche o di risultati di screening.
- Biologia della scoperta: Consente una separazione e una determinazione precisa delle dimensioni dei frammenti di DNA, permettendo una valutazione affidabile delle modifiche geniche, dell'integrità dei plasmidi o degli ampliconi PCR durante la conferma della sequenza bersaglio.
- Screening: Fornisce una visualizzazione riproducibile e quantitativa delle bande, essenziale per valutare la diversità della libreria o confermare i risultati positivi in saggi basati sugli acidi nucleici.
- Analisi: Genera dati di intensità fluorescente confrontabili tra i campioni, consentendo un confronto costante del rendimento o della purezza del DNA in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la funzionalità del DNA per l'uso in trasfezioni cellulari di mammifero o nella produzione di vettori virali, fondamentale per portare avanti candidati verso test preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una sostituzione diretta del reagente che può essere standardizzata tra gruppi di lavoro e sedi diverse, senza dover ricalibrare l'apparecchiatura o il software per elettroforesi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica minimizzando il danno al DNA indotto dal colorante, migliorando la fiducia nei dati di biologia molecolare utilizzati per la valutazione delle proteine bersaglio.
- Valore operativo: Utilizza il colorante economico e non pericoloso torio arancio, con un semplice stoccaggio (soluzione madre in DMSO aliquote e congelata), riducendo i costi del reagente e gli oneri legati alla sicurezza.
- Valore strategico: Migliora l'affidabilità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto preservando l'integrità del campione per analisi successive come sequenziamento, clonaggio o saggi funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento proporzionato ai rischi assicurando che la qualità dei dati basati sul DNA soddisfi i criteri per l'ottimizzazione del composto leader e la selezione del candidato preclinico.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze di biologia molecolare nella preparazione del gel di agarosio e nell'elettroforesi.
- Apparato standard per elettroforesi dotato di transilluminatore a UV o luce blu e filtro di emissione ambra per la rilevazione.
- Scongelamento e mescolamento costante di aliquote congelate di tiazolo arancio-DMSO per garantire una colorazione uniforme.
- Validazione dell'efficienza di colorazione in diversi sistemi modello (ad esempio, plasmidico, DNA genomico) quando si passa a nuovi tipi di campione.
- Limitazione: richiede l'ottimizzazione del tempo di colorazione (20 min) se si utilizza la colorazione post-elettroforesi, aggiungendo un passaggio rispetto ai metodi con gel preformati.
