Name: Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Scopri un'alternativa sicura ed economica al bromuro di etidio per la visualizzazione del DNA in elettroforesi su gel usando il thiazole orange. Questo metodo consente il rilevamento con luce blu, preservando l'integrità del DNA per esperimenti successivi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio al TDG da Christopher Newport University.

1. preparare il gel
Nota: Per protocolli di elettroforesi del gel di carattere generale, vedere anche P.Y. Lee, et al. 14.
<ol><li>Mescolare agarosio (~ 1% w/v, percentuale può essere variata per separazioni di particolari dimensioni) nel buffer (circa 70 mL per un mini-gel (8 x 7 cm)). I buffer sono comunemente TAE (pH tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato 20 mM, 1 mM EDTA, circa 8,6) o TBE (pH di tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato di 90 mM, 2 mM EDTA, circa 8,3)).</li>
	<li>Aggiungere thiazole orange a una concentrazione finale di 1,3 μg/mL.<ol>
<li>Sciogliere thiazole orange in DMSO per ottenere una soluzione stock di 10.000 x (13 mg/mL). Mentre non particolarmente fotosensibile, conservare a nel buio quando non in uso. Questa soluzione è stabile a temperatura ambiente per ~ mesi; archiviazione a lungo termine può essere ottenuta da congelare aliquote (DMSO congelare in un frigorifero standard). Essere sicuri di tutto sciogliere e risospendere una soluzione congelata prima dell'uso. Nota: Il gel anche può essere macchiato con TO dopo elettroforesi (Vedi punto 2.6). Mentre per ha un profilo di sicurezza migliore sopra il bromuro di etidio, sicurezza del laboratorio di biologia molecolare standard precauzioni dovrebbero essere mantenute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forno a microonde la miscela di agarosio, buffer e thiazole orange per sciogliere agarosio (circa 60 s). Questo passaggio si riferisce comunemente come "fusione". Ricciolo (5 s) per facilitare la dissoluzione se necessario. Nota: A può anche essere aggiunto dopo microwaving se si preferisce.</li>
	<li>Consentire la soluzione di agarosio raffreddare brevemente prima di versare nell'apparecchio di colata di gel contenente un pettine adatto.</li>
	<li>Consentire la soluzione di agarosio solidificare in un gel.</li>
</ol>2. caricamento e l'esecuzione del gel
<ol><li>Posizionare il gel nell'apparato elettroforesi se non è già presente.</li>
	<li>Aggiungere tampone in esecuzione (TAE o TBE come sopra) per coprire la superficie del gel.</li>
	<li>Caricare i campioni di DNA (comunemente 10 μL) usando una tintura di caricamento. Includere una scaletta di dimensionamento del DNA per riferimento.</li>
	<li>Fissare il coperchio e gli elettrodi (il gel deve essere eseguito verso l'anodo rosso (positivo)).</li>
	<li>Applicare tensione (in genere ~ 100V per un mini-gel, anche se la dimensione del gel può richiedere una tensione modificata per evitare di danneggiare il gel) fino a quando il caricamento della tintura ha percorso una distanza adeguata (circa 4-7 cm per un mini-gel, anche se la distanza può variare a seconda applicazione precisa). Nota: Come il bromuro di etidio e molti altri coloranti di legame al DNA, arancio di tiazolo è caricato positivamente. Di conseguenza, questi coloranti migrerà nella direzione opposta di electrophoresing del DNA. Per i campioni che sono molto malandati il gel per la separazione avanzata, alla fine il colorante si separerà dai più piccoli frammenti di DNA, con conseguente colorazione debole. In questi casi, il gel deve essere macchiato come descritto al punto 2.6. Questa situazione non è univoco per TO, qualsiasi carica positiva colorante che reversibilmente interagisce con il DNA verrà presentano questo comportamento (compreso il bromuro di etidio, a e altri).</li>
	<li>Se a non è stato aggiunto prima del gel colata (punto 1.2), macchia immergendo il gel in tampone contenente thiazole orange.<ol>
<li>Preparare abbastanza buffer (TAE o TBE) contenente 1,3 thiazole μg/mL arancio completamente coprire il gel e immergere il gel con agitazione delicata fino a quando le bande sono completamente rilevato (circa 20 min).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Visualizzazione del gel di agarosio arancione thiazole (transilluminatore UV)
<ol><li>Rimuovere il gel dalla apparato elettroforesi e posto su un transilluminatore UV. Attenzione: La luce UV è dannoso per la pelle e gli occhi. Assicuratevi di indossare appropriati degli occhi (occhiali) e protezione per il viso (visiera). Le mani dovrebbero avere guanti e maniche lunghe dovrebbero essere indossati.</li>
	<li>Se lo si desidera, cut-out desiderato fasce del DNA dal gel (per ulteriore digestione o legatura, per esempio). Esporre il gel ai raggi UV per più breve una lunghezza di tempo possibile durante l'asportazione. Luce (a prescindere dalla tintura DNA) UV danneggia il DNA.</li>
	<li>Estrarre il DNA dal gel slice usando un prontamente disponibili in kit o protocollo15.</li>
</ol>4. Visualizzazione del gel di agarosio arancione thiazole (luce blu transilluminatore o torcia)
<ol><li>Rimuovere il gel dalla apparato elettroforesi e posto su un transilluminatore a luce blu (lunghezza d'onda massima emissione nm ~ 470). In alternativa, un LED blu (~ 470 nm) torcia elettrica può essere diretto presso il gel (sia da sopra o sotto). Nota: Mentre la sensibilità è inferiore utilizzando un transilluminatore a luce blu con bromuro di etidio, DNA colorato con bromuro di etidio può essere rilevato utilizzando questo protocollo di luce blu.</li>
	<li>Utilizzare un filtro di emissione ambra (~ 560 nm longpass, occhiali di protezione o Piazza) per filtrare la luce blu, che consente la visualizzazione di fluorescenza da complessi di DNA: thiazole orange. Nota: Senza il filtro di emissione ambra, è molto difficile da rilevare le fasce del DNA a causa della intensità della sorgente di eccitazione di luce blu. Attenzione: Anche se luce blu manca la capacità di acutamente danneggiano i tessuti (UV a contrasto), prolungati esposizione alla luce blu intensa potrebbe danneggiare gli occhi e occhiali di emissione ambra o filtro deve essere utilizzato.</li>
	<li>Se si desidera tagliare desiderati fasce del DNA dal gel per ulteriori applicazioni. Nota: Poiché la luce blu non danneggia il DNA, non è necessario tagliare rapidamente le fasce (ad esempio quando usando l'eccitazione UV nel passo 3.2).</li>
	<li>Estrarre il DNA dal gel slice usando un prontamente disponibili in kit o protocollo15.</li>
</ol>5. acquisizione immagine
<ol><li>Selezionare le impostazioni appropriate di eccitazione e di emissione in gel-imaging apparato. L'eccitazione e emissione dell'arancio di tiazolo (λex, max = 510 nm (488 nm e 470 nm mostrano anche forte eccitazione, oltre alla forte eccitazione alle lunghezze d'onda UV); λem = 527 nm) sono quasi identici alla politica commerciale comune blu-luce – rilevabile coloranti, così strumenti possono avere predisposto le impostazioni di filtro che possono essere utilizzate. Nota: Alcune impostazioni di filtro per le tinture commerciale blu-luce – rilevabili effettivamente utilizzare raggi dannosi UV per l'eccitazione, quindi usare cautela se imaging prima di tagliare le fasce. Se possibile, utilizzare una sorgente di luce blu eccitazione quando bande di DNA saranno escisse dopo formazione immagine.</li>
	<li>In assenza di un sistema di imaging con filtri appropriati, è necessario inserire un filtro ambrato tra la fotocamera e la sorgente di eccitazione gel/blu-luce.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
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<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il bromuro di etidio è stata a lungo uno strumento standard nel laboratorio di biologia molecolare, nonostante la tossicità conosciuta. Si soffre anche che richiedono luce UV, che danneggia il DNA, come essa viene rilevata. Thiazole orange offre una conveniente alternativa al bromuro di etidio, nonché coloranti commerciale utile ma costosi.
I vantaggi dell'arancio di tiazolo sono così due volte. In primo luogo, arancio di tiazolo può essere utilizzato semplicemente come una sostituzione per il...

Lo scopo di questo metodo è per identificare il DNA in gel dell'agarosi usando thiazole orange (a) per la rilevazione della fluorescenza. A causa del suo profilo di sicurezza favorevole e basso costo, arancio di tiazolo può vedere particolare beneficio nei laboratori di insegnamento universitario e laboratori di ricerca, esecuzione di biologia molecolare, specialmente legature e clonazione.
Il bromuro di etidio rimane il colorante più comune per il rilevamento del DNA in gel dell'agarosi. Questo è principalmente perché si può ottenere molto a buon mercato e solo richiede eccitazione con luce UV per il rilevamento. Entrambi etidio bromuro e thiazole orange sono economici, con rilevamento basso limiti (1-2 ng/lane)1. Ci sono due principali svantaggi al bromuro di etidio, tuttavia, che migliora l'arancio di tiazolo.
In primo luogo, il bromuro di etidio è un agente mutageno2 con gestione speciale, spedizione e requisiti di smaltimento, mentre thiazole orange è meno mutagena (3 – 4 x meno mutagena nel test di Ames)3,4 e possono generalmente essere smaltiti con comuni rifiuti chimici.
In secondo luogo, il bromuro di etidio richiede luce UV per il rilevamento. Thiazole orange similmente possibile utilizzare luce UV se desiderato, ma può anche essere rilevata con luce blu. Luce UV, mentre comunemente usati, ha alcuni svantaggi salienti. In primo luogo, è dannoso per gli occhi e la pelle umana. Mentre la luce UV può essere utilizzata in modo sicuro da professionisti qualificati, pelle o occhi danni accidentali (funzionalmente simili a scottature) da laboratorio UV luce non sono infrequenti specialmente con gli scienziati inesperti. In secondo luogo, la luce UV è estremamente dannoso a DNA campioni5, che riduce il successo di esperimenti a valle (ad esempio la legatura e trasformazione)1,6,7. TO permette la rilevazione con luce blu (λex, max = 510 nm (488 nm e 470 nm mostrano anche forte eccitazione)), che non provoca danni alla pelle o DNA danni (anche se qualsiasi luce intensa può ancora essere dannoso per gli occhi), diminuendo notevolmente i rischi per entrambi lo scienziato e l'esempio.
Non è l'alternativa di tintura fluorescente solo al bromuro di etidio; il suo vantaggio è il costo. A è stato scoperto nel 1980 come una macchia di reticolociti8e ha trovato il programma di utilità in un certo numero di fluorescenza basati sul DNA esperimenti9,10,11,12,13. È attualmente venduto da più fornitori. A è il composto progenitore di ulteriori, più costoso, coloranti commerciale blu-luce – rilevabile e si comporta allo stesso modo durante l'elettroforesi, usando UV o luce blu per rilevazione1. Inoltre, mentre altri coloranti sono più sensibili a concentrazioni molto basse di DNA di EtBr o TO, per esperimenti di elettroforesi generico, questi coloranti sono proibitivamente costosi in molti contesti.

<table><tbody><tr><td>Scala del DNA a 2 log</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio (grado di analisi genetica)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Torcia a luce blu</td><td>WAYLLSHINE (Amazon)</td><td>WAYLLSHINE LED</td><td></td>blu scalabile</tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>etidio bromuro</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Per confronto, non necessario per il protocollo</td></tr><tr><td>Apparecchio in gel (Owl Easy Cast)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager Viewing Glasses</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>Necessario per l'utilizzo della torcia a luce blu.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (transilluminatore a luce blu)</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td> La <td>torcia a luce blu può essere utilizzata come alternativa</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Per confronto, non necessario per il protocollo</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Tiazolo arancione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Gli occhiali sono inclusi anche con Invitrogen G6600</td></tr></tbody></table>

elettroforesi di dna usando thiazole orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

L'elettroforesi del gel del DNA usando agarosio è uno strumento comune in laboratori di biologia molecolare, consentendo la separazione dei frammenti di DNA di dimensioni. Dopo la separazione, il DNA è visualizzato dalla macchiatura. In questo articolo viene illustrato come utilizzare DNA thiazole orange a macchia. Arancio di tiazolo paragona favorevole ai comuni metodi di colorazione, in quanto è sensibile, poco costoso, eccitabile con UV o luce blu (per evitare danni di campione) e più sicuro che il bromuro di etidio. Laboratori già attrezzati per eseguire esperimenti di elettroforesi di DNA usando il bromuro di etidio possono passare generalmente coloranti senza ulteriori modifiche ai protocolli esistenti, utilizzando la luce UV per il rilevamento. Rilevamento di luce blu per evitare danni di campione può inoltre avvenire con un filtro di origine e di emissione di luce blu. Laboratori già attrezzati per il rilevamento di luce blu possono semplicemente passare coloranti senza ulteriori modifiche ai protocolli esistenti.

Arancio di tiazolo consente l'individuazione di DNA, senza utilizzare il bromuro di etidio e senza l'utilizzo di luce UV danneggiano il DNA. Bromuro di etidio è ben noto per essere mutageno, quindi eliminarlo dal laboratorio può essere vantaggioso. Luce UV danneggia il DNA e abbassa l'efficienza di trasformazione in modo significativo, considerando che la luce blu non danneggia il DNA. Limiti di rilevazione sono simili tra il bromuro di etidio, thiazole orange e un colorante DNA commerciale comune, blu-luce – rilevabile ...

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare thiazole orange per la rilevazione di DNA negli esperimenti di elettroforesi del gel. L'uso dell'arancio di tiazolo permette l'eliminazione del bromuro di etidio, e rilevazione di fluorescenza può essere realizzato con UV o luce blu.

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Questo protocollo è un'alternativa facile ed economica all'uso del bromuro di etidio per il rilevamento del DNA durante l'elettroforesi. Rimuovendo il bromuro di etidio, la luce UV o la luce blu possono essere utilizzate per il rilevamento. La luce blu non è dannosa per il DNA, il che migliora le possibilità di successo per gli esperimenti a valle.È davvero facile provarlo. Devi solo sostituire il bromuro di etidio nei tuoi gel con l'arancia tiazolo. Per iniziare, preparare mini-gel all'1% mescolando circa 0,7 grammi di agarosio in 70 millilitri di tamponi tris-acetato-EDTA o tris-borato.Quindi, sciogliere l'arancione tiazolo in DMSO per creare una soluzione stock 10.000X. Sebbene non particolarmente sensibile alla luce, conservare l'arancione tiazolo al buio quando non è in uso. Per la conservazione a lungo termine, fare aliquote della miscela tiazolo arancione-DMSO e congelarle.Quindi, aggiungere l'arancia tiazolo a una concentrazione finale di 1,3 microgrammi per millilitro e microonde la miscela di tampone di agarosio e arancia tiazolo per sciogliere l'agarosio per circa 60 secondi. Versare la miscela di agarosio in un apparecchio di fusione del gel contenente un pettine approp

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Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

In questo video, dimostriamo il test di spostamento della mobilità elettroforetica per rilevare le interazioni proteina-DNA utilizzando sonde di DNA marcate con fluorescenza a infrarossi. Quando la proteina si lega alla sonda del DNA, forma un grande complesso che migra lentamente e appare come una banda spostata sul gel.

Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica per il rilevamento di complessi fattore di trascrizione-DNA

Descriviamo una procedura multi-target cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) in embrioni di Drosophila intatte che permettono il rilevamento simultaneo e specifico di tre diversi modelli di distribuzione mRNA da contrastanti precipitati di colore.

Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l'osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l'imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

Macchiatura di molecole di DNA per microscopia a fluorescenza permette uno scienziato per visualizzarli durante un esperimento. Nel metodo presentato qui, molecole di DNA sono pre-colorati con coloranti fluorescenti e digeriti con metilazione ed enzimi di restrizione sensibili non-metilazione.

Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione

Qui presentiamo un metodo sensibile, rapido e discriminante di colorazione post-gel per immagini di RNA etichettati con aptamers RNA Mango I, II, III o IV, utilizzando gel nativi o denacilidi di gel poliacrilamina (PAGE). Dopo aver eseguito gel PAGE standard, l'RNA con etichettatura mango può essere facilmente macchiato con TO1-Biotin e quindi analizzato utilizzando lettori di fluorescenza comunemente disponibili.

Visualizzazione fluorescente dell'RNA marcato al mango nei gel di poliacrilofofora tramite un metodo poststaino

Qui, descriviamo la procedura per analizzare la progressione della replicazione attraverso ripetizioni patogene e inclini alla struttura utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale.

Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Scopri un'alternativa sicura ed economica al bromuro di etidio per la visualizzazione del DNA in elettroforesi su gel usando il thiazole orange. Questo metodo consente il rilevamento con luce blu, preservando l'integrità del DNA per esperimenti successivi.

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

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