Name: Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per lanalisi specifica del ciclo cellulare dellespressione proteica cellulare da citometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Scopri l'isolamento e la colorazione dei keratinociti cutanei del topo per l'analisi del ciclo cellulare mediante citometria di massa. Questo metodo consente di profilare oltre 40 marcatori proteici con precisione.

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Il sostegno a questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Dermatologia, dal Gates Center for Regenerative Medicine presso l'Università del Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Gli autori riconoscono la sovvenzione di supporto e risorsa di supporto Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) per il funzionamento del citometro di massa e sono grati per Karen Helm e Christine Childs al centro per i loro consigli di esperti sul flusso e sulla citometrica di massa Tecniche.

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso del campus medico dell'Università del Colorado ha approvato gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo.
1. Preparativi
<ol><li>Progettare un pannello anticorpo con tag metallici. Utilizzare il software di progettazione pannello online gratuito12 e includere 127IododeoxyUridina (IdU), 164Dy (Dysprosium) etichettato anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), e 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinaSer807/811 (pRB)13. Aggiungere altri anticorpi con etichetta metallica che non si sovrappongono nel segnale di canale14.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock IdU. Sciogliere la polvere IdU a 10 mg/mL in 0,1 N NaOH a 60 gradi centigradi. Soluzione di stock Aliquot IdU in tubi di microcentrismo e congelare a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.<ol>
<li>Regolare il pH della soluzione IdU a 7,5 con 12 N HCl immediatamente prima dell'uso. Testare con una striscia di pH su uno scarto per assicurarsi che la soluzione sia a pH 7.5. NOTA: Il tempo prolungato (>5 min) di IdU a pH 7.5 comporterà precipitazioni e una nuova aliquota di IdU è necessaria quando questo accade.</li>
		<li>Utilizzare adeguate dispositivi di protezione personale (ad esempio, guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) e lavorare in un armadietto di sicurezza nella movimentazione di soluzioni NaOH o HCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una soluzione di fissaggio di paraformaldeide 2x (PFA). Combinare 5 mL di 10x PBS (pH 7.5) e 1 mL di 16% PFA con 44 mL di grado molecolare puro dH2O (3,2% concentrazione finale). NOTA: Uno stock di PFA può essere preparato come pubblicato in precedenza15 o acquistare il 16% di scorte prive di metalli contaminati.<ol>
<li>Utilizzare adeguate attrezzature di protezione personale e lavorare in un armadio di sicurezza durante la movimentazione di polvere e soluzioni PFA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il barium (Ba2 )gratuito 1x PBS combinando 5 mL di 10x PBS (pH 7.5) senza metalli con 45 mL di puro grado molecolare dH2O. NOTA: La qualità di PBS e di altri reagenti è molto importante per evitare di contaminare i metalli che possono introdurre rumore di fondo durante l'analisi dei dati citometrici di massa.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 100 mm di cisplatina. Sciogliere 300.5 mg di cisplatina polvere in 10 mL di DMSO. Conservare in aliquote a -80 gradi centigradi. Preparare una soluzione di lavoro cisplatina da 10 mM per esperimenti da utilizzare oltre 1 d.</li>
	<li>Preparare soluzioni di separazione epidermide/dermide. Preparare una soluzione di stock 20x dispase sciogliendo 30 mg in 1 mL di HBSS o PBS. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 m e conservare in aliquote a -20 gradi centigradi. Preparare una soluzione di brodo di collagenasi di tipo 1x IV a 1 mg/mL in HBSS, filtrare sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 m e conservare le aliquote a -20 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Etichettatura della fase S per incorporazione IdU
<ol><li>Pesare i topi. Utilizzare p1-P3 cuccioli neooatici o topi adulti di 8-10 settimane e utilizzare topi maschi o femmine da un C57BL/6, FvB, o 129 sfondi. Determinare una dose a 0,1 mg IdU (pH 7.5)/g peso corporeo. Ad esempio, un mouse da 25 g richiede 0,25 mL di IdU.</li>
	<li>Somministrare la dose di IdU mediante un'iniezione intraperitoneale e attendere 2 h prima della raccolta delle cellule. Utilizzare una siringa di tubercolina per iniettare cuccioli neooatali. NOTA: Una dose di 2 mg/mL di IdU può essere utilizzata con cellule di coltura tissutale con un'incubazione di 1 h a 37 gradi centigradi prima della raccolta e dell'etichettatura per la citometria di massa.</li>
</ol>3. Isolamento delle celle per l'etichettatura
<ol><li>Soluzioni stock disaffetto disaffetto e collagenase. Diluire la soluzione di stock 20x dispase a 1x (1,5 mg/mL) in STERILe HBSS o PBS. Tenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'uso.</li>
	<li>Combina 2 volumi di dispasi con 1 volume di collagene in un volume totale che permette alla pelle di galleggiare liberamente. Ad esempio, la digestione di 5 pelli di topo neonale può essere galleggiata su 8 mL di 1x dispase con 4 mL di collagene in un piatto Petri da 100 mm.</li>
	<li>Seguire i metodi approvati per eutanasia i topi sperimentali (ad esempio, il controllo del sovradosaggio/punta dell'isoflurano o l'inalazione di CO 2/lussazione cervicale). Pulire la pelle dell'orecchio adulto con una soluzione di iodio (vedi Tabella deimateriali) e risciacquare con acqua sterile quando le cellule isolate devono essere utilizzate per la coltura dei tessuti.</li>
	<li>Rimuovere chirurgicamente l'orecchio alla base (Figura 1A). Sciacquare le orecchie in PBS sterile quando le cellule isolate devono essere utilizzate per la coltura dei tessuti. Mettere su una piastra petri secco da 100 mm.</li>
	<li>Separare con cura anteriore dalla pelle posteriore creando inizialmente una tasca al centro o al bordo dell'area di taglio utilizzando pinze sottili e tirando i due lembi della pelle a parte ( Figura 1B-D). Procedere con entrambe le pelli anteriori e posteriori. NOTA: istruzioni dettagliate per sezionare la pelle di topo neoooattale sono fornite da Litchi et al.16 Inoltre, l'uso di un ambito di dissezione può aiutare nella separazione della pelle anteriore da posteriore e nell'identificazione dei lati epidermis/dermici pelle: i capelli sono visibili sul lato dell'epidermide, mentre il derma avrà un aspetto gelatinoso.</li>
	<li>Posizionare con attenzione le pelli anteriori e posteriori dell'orecchio con il lato derma della pelle che tocca la soluzione dispasi/collagenase ( Figura 1E). Utilizzare 1 mL sia per la pelle anteriore che posteriore di un singolo orecchio per pozzo di una piastra di coltura 12 bene. Incubare a 37 oC per 1 h. In alternativa, galleggiare pelli su 1x soluzione dispasi a 4 gradi centigradi per 16-18 h. NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con tecnica sterile quando le cellule devono essere coltivate.</li>
	<li>Posizionare la pelle digerita con il lato dell'epidermide toccando la superficie di un piatto Petri pulito. Appiattire la pelle e far scorrere delicatamente il derisito fuori l'epidermide lavorando dal centro ai bordi in un modello circolare.</li>
	<li>Scartare il derma o digerirlo ulteriormente per liberare i fibroblasti per la coltura o l'analisi dei tessuti16. NOTA: Il derma sarà più scuro in apparenza e hanno una composizione gelatinosa e appiccicosa. Il derma dovrebbe facilmente staccarsi. Il fallimento o la difficoltà di rimuovere il derma suggerisce una digestione dei tessuti insufficiente. Tuttavia, l'incubazione estesa nel buffer di digestione ridurrà la vitalità cellulare. L'epidermide rimarrà sul piatto Petri e avrà un aspetto sbiancato.</li>
	<li>Sollevare delicatamente l'epidermide afferrando i bordi e staccarlo dalla superficie del piatto Petri. Posizionare con attenzione l'epidermide su una soluzione di distacco cellulare preriscaldata (vedere Tabella dei materiali) per 5 min a 37 o 20 min a RT. Utilizzare 500 l di soluzione di distacco cellulare per 2 epidermises dell'orecchio adulto per bene di una piastra di coltura 12 pozzi e utilizzare 750 L di distacco cellulare soluzione per una singola epidermide neooatale per pozzo di un piatto di 6 pozzi.</li>
	<li>Afferrare l'epidermide con pinze sterili e strofinare trascinando l'epidermide contro il fondo del piatto per dissociare le cellule. Aggiungere 1 mL di DMEM contenente l'1% di FBS (0,01 mL) e passare attraverso un setaccio di 40 celle in un tubo di raccolta. Sciacquare bene con altri 2 mL di DMEM e aggiungere alla sospensione cellulare.</li>
	<li>Centrifuga a 120 x g per 5 min. Aspirare il supernatante con attenzione.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1-2 mL di DMEM contenente l'1% di FBS. Determinare la cella e % conteggi di cellule vive utilizzando Trypan Blue e un emocitometro o un dispositivo di conteggio automatizzato. Cellule di Pellet come descritto al punto 3.11. NOTA: Dopo il passaggio 3.12, le cellule possono essere coltivate in supporti di coltura tissutale appropriati. 17 mi lato</li>
</ol>4. Etichettatura Cisplatina per determinare le cellule vive / morte
<ol><li>Risospendere 1-3 x 106 celle per 1 mL di DMEM contenente 25 cisplatin (2,5 - L di stock/mL). Incubare per 1 min e dissetare pipettando con un volume uguale di FBS (ad esempio, 1 mL).</li>
	<li>Centrifuga a 120 x g per 5 min. Decant supernatant in un becher contenente candeggina diluita e tubi invertiti per drenare la soluzione rimanente su un tovagliolo di carta. Toccare delicatamente per liberare la soluzione rimanente su pellet e sidewall del tubo.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in2 mL di PBS senza Ba 2. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 4.2. NOTA: Si consiglia di fissare le cellule se non possono essere macchiate immediatamente.</li>
</ol>5. Fissazione delle cellule con etichetta cisplatin (opzionale)
<ol><li>Risospendere 1-3 x 106 cellule con etichetta tura cisplatina in 1 mL di PBS senza Ba2. Vorticare le cellule a bassa potenza continua e aggiungere dropwise 1 mL (1 volume) del buffer di fissaggio PFA 2x. Incubare a RT per 10 min su una piattaforma a dondolo.</li>
	<li>Cellule di Pellet come descritto al punto 4.2, ma centrifugare a 500 x g per 5 min.</li>
	<li>Lavare le celle con2 mL di cellule PBS e pellet senza Ba 2, come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 5.3 una volta.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2mL di PBS senza Ba 2. Conservare a 4oC per <3 d. Aggiungere FBS al 3% (ad esempio, 0,3 mL di FBS/mL di celle) del volume totale se si conserva più a lungo >3 d, quindi mescolare e congelare a -80 gradi centigradi. NOTA: la fissazione può influire sul rilevamento di alcuni incarnati. Gli effetti della fissazione sul segnale anticorpale devono essere determinati empiricamente.</li>
</ol>6. Codifica a barre dei campioni (opzionale ma consigliato)
<ol><li>Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2 e quindi risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di 1x buffer di fissaggio (vedere Tabella dei materiali). Incubare a RT per 10 min.</li>
	<li>Lavare le celle con 1 mL di buffer permeabilizzazione del codice a barre (vedere Tabella dei materiali). Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 6.2 una volta.</li>
	<li>Aggiungete 100 l di buffer di permeabilizzazione del codice a barre ai codici a barre (vedere Tabella deimateriali)18 e mescolate immediatamente mentre le celle del passaggio 6.2 sono a pelletizzazione.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in un buffer di permeabilizzazione di 800 ll di codice a barre. Aggiungere la soluzione del codice a barre alle celle, mescolare e incubare a RT per 30 min. Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Lavare nuovamente le celle in 2 mL di buffer di colorazione cellulare (vedere Tabella deimateriali) e pellet. NOTA: Fino a 20 campioni possono essere etichettati con varie combinazioni di metalli Palladium18. Altre strategie di codifica a barre sono descritte altrove15.</li>
</ol>7. Etichettatura delle cellule per la citometria di massa
<ol><li>Risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di soluzione di lavoro buffer di colorazione dell'antigentà nucleare (vedere Tabella dei materiali). Combinare i campioni in un unico tubo per i passaggi successivi quando si utilizzano campioni con codice a barre. Incubare a RT per 30 min. Pellet come descritto nel passaggio 5.2.</li>
	<li>Risospendere 1-3 x 106 celle in 2 mL di buffer di permeabilizzazione della colorazione dell'antigen nucleare (vedere Tabella dei materiali). Scalare in base alle esigenze. Ad esempio, utilizzare 6 mL di buffer per 10 campioni combinati con un numero di celle di 9 x 106 celle. Pellet come descritto nel passaggio 5.2.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 7.2. Vorticare delicatamente il pellet cellulare nel volume residuo lasciato nel tubo.</li>
	<li>Aggiungere 50 - L di cocktail anticorpale intracellulare per 1-3 x 106 cellule. Scalare in base alle esigenze. Ad esempio, utilizzare 150 l del cocktail anticorpale per 10 campioni combinati con un numero di cellule di 9 x 106 cellule. Mescolare e incubare a RT per 45 min. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione cellulare e pellet come descritto nel passaggio 5.2.</li>
	<li>Risospendere il pellet 1-3 x 106 celle in 2 mL di buffer di colorazione cellulare. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 7.5 una volta. NOTA: Altre soluzioni tampone possono essere utilizzate per colorare la membrana extracellulare o i marcatori citolasmici e lo sperimentatore potrebbe dover ottimizzare la colorazione se è necessario rilevare gli epitopi in diverse posizioni cellulari. Le cellule possono anche essere fissate in PFA dopo il passaggio 7.5 quando si utilizzano celle vive per la colorazione.</li>
	<li>Risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di soluzione di intercalazione e conservare per 1-3 d a 4 gradi centigradi.<ol>
<li>Conservare le celle a -80 gradi centigradi in DMSO contenente la soluzione per le celle >3 d. Pellet come descritto nel passaggio 5.2 se le cellule sono in soluzione di intercalazione. Risospendere il pellet (1-3 x 106 celle) in 1 mL di celle di colorazione cellulare e di pellet come descritto nel passaggio 5.2. Resuspend pellet in 1 mL del 10% DMSO/90% FBS19, trasferire in un crioviale, mettere in un contenitore di congelamento isopropanolo, e conservare a -80 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Lavare 1-3 x 106 celle con 2 mL di buffer di colorazione cellulare, pellendo come descritto nel passaggio 5.2. Eseguire due lavature aggiuntive con 2 mL di acqua, pellendo come descritto nel passaggio 5.2.</li>
	<li>Diluire le perline di calibrazione EQ 1:9 in acqua (soluzione di riserva a 3,3 x 105 perline/mL).</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL con soluzione diluita perline EQ. Filtrare le cellule attraverso tubi di flusso del farro da 35 m.</li>
	<li>Eseguire campioni sul citometro di massa e acquisire dati. I dati verranno depositati in un formato di file Flow Cytometry Standard (FCS).</li>
</ol>8. Elaborazione e analisi dei file di dati di citometria di massa
<ol><li>Normalizzare i file FCS. Utilizzare un programma gratuito disponibile allhttps://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
</li>
	<li>Deconvolute file FCS con codice a barre. Separare la popolazione di codici a barre raggruppati in file con codice a barre separati con un programma gratuito disponibile allhttps://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
</li>
	<li>Analizzare i file FCS normalizzati. Utilizzare programmi commerciali21,22 o freeware (vedi web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).</li>
</ol>

<ol><li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+proliferation+markers%3A+PCNA%2C+Ki-67%2C+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li>
<li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3%2C+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedCentral+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).</li>
<li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li>
<li>http://www.dvssciences.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.dvssciences.com">http://www.dvssciences.com</a> (2019).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465(2016).</li>
<li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li>
<li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>http://www.cytobank.org. , 
 <a target="_blank" href="http://www.cytobank.org">http://www.cytobank.org</a> (2019).</li>
<li>http://www.flowjo.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com">http://www.flowjo.com</a> (2019).</li>
<li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45%3A+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li>
<li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS%2FFLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid%2Ferythroid+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li>
<li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li>
<li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li>
<li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery%2C+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li>
<li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li>
<li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li>
<li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto in questo documento può essere completato in circa 8 ore. Il risultato finale è una sospensione delle cellule arricchite in PC che possono essere analizzati per l'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Diversi studi precedenti hanno delineato metodi per isolare i K dalla pelle umana e del topo16,25. Questi studi includono anche protocolli per l'isolamento dei KC per la citometria di flusso26. T...

La correlazione dell'espressione genica con le fasi del ciclo cellulare rimane una sfida nell'analisi di modelli animali di malattie iperplastiche come il cancro. Parte di questa sfida è la coordinazione delle proteine di interesse (POI) con marcatori di proliferazione. Le cellule proliferative possono essere trovate in varie fasi del ciclo cellulare tra cui G1, S, G2 e M. Ki67 è uno dei marcatori più comunemente utilizzati di proliferazione ed è espresso in tutte le fasi del ciclo cellulare. È stato ampiamente utilizzato nell'analisi dei tessuti sia umani che murini1,2,3. Tuttavia, come altri marcatori di proliferazione generale, Ki67 non discerne singole fasi del ciclo cellulare. Un approccio più preciso utilizza l'incorporazione di analoghi nucleotiditici tiofini come Bromodeoxyuridina (BrdU) in cellule che stanno replicando attivamente il loro genoma (cioè, S-fase)4,5. Uno svantaggio dell'uso di analoghi nucleotidi è la necessità di somministrarli agli animali vivi ore prima dell'analisi. Ki67 e BrdU sono comunemente rilevati su sezioni di tessuto fisso dall'uso di anticorpi. Un vantaggio di questo approccio è che la posizione dei POI può essere accertata all'interno dell'architettura dei tessuti (ad esempio, lo strato basale dell'epidermide cutanea). Questo approccio inoltre non richiede la dissociazione dei tessuti che può portare a cambiamenti nell'espressione genica. Uno svantaggio è che la fissazione dei tessuti o l'elaborazione del tessuto per il congelato dello Strumento di personalizzazione di Office o la sezionamento della paraffina possono occludere i bersagli degli anticorpi (ad esempio, gli antigeni). Il recupero degli antigeni richiede in genere la digestione di calore o tessuto. Anche la quantificazione delle intensità di colorazione può essere difficile. Ciò è dovuto alle variazioni nella colorazione, nello spessore della sezione, nel rilevamento del segnale e nella distorsione dello sperimentatore. Inoltre, un numero limitato di marcatori può essere rilevato contemporaneamente nella maggior parte delle configurazioni di laboratorio tipiche. Tuttavia, gli approcci di colorazione multiplex più recenti promettono di superare questi limiti; esempi sono la citometria di massa di imaging e l'amplificazione del segnale Tyramide6,7.
La citometria di flusso è un'altra potente tecnologia per rilevare le cellule che proliferano. Permette il rilevamento multiplex di marcatori nelle stesse cellule, ma richiede la dissociazione dei tessuti per la maggior parte dei tipi di cellule non ematopoietiche. L'analisi delle cellule che proliferano viene eseguita regolarmente mediante l'uso di coloranti che legano il DNA (ad esempio, Propidium Iodide (PI))8. La citometria di flusso permette anche una determinazione più precisa delle fasi del ciclo cellulare quando accoppiato con il rilevamento dell'incorporazione BrdU9. Anche se un approccio potente, la citometria di flusso BrdU/PI ha i suoi svantaggi. Non è in grado di risolvere le fasi G2/M e G0/G1 senza l'inclusione di anticorpi specifici per fase. Tuttavia, il numero di anticorpi che possono essere utilizzati è limitato dall'autofluorescenza cellulare, dalla fuoriuscita spettrale delle emissioni di fluoroforo e dall'uso di controlli di compensazione. Questa limitazione segna più difficile e laborioso rilevare co-rilevare l'espressione dei marcatori del ciclo cellulare con i POI. Un approccio più facile è quello di utilizzare la citometria di massa10,11. Questa tecnologia utilizza anticorpi coniugati in metallo che hanno uno spettro di rilevamento più stretto. Una volta che le cellule sono macchiate con anticorpi marcati metallici, vengono vaporizzate e i metalli rilevati dalla spettrometria di massa del tempo di volo della citometria (CyTOF). A causa di queste proprietà, la citometria di massa consente il rilevamento multiplex di >40 marcatori diversi utilizzando piattaforme esistenti10,11. Inoltre, è possibile codici a barre campioni con metalli che si traducono in risparmio di anticorpi preziosi, riducendo al contempo la variabilità di colorazione da campione a campione. D'altra parte, la citometria di massa ha diversi svantaggi. Ci sono un numero limitato di anticorpi con etichettatura metallica disponibile in commercio per le cellule non derivate dal sangue. La quantificazione del contenuto del DNA è meno sensibile rispetto all'uso di coloranti del DNA fluorescente e la citometria di massa ha una gamma dinamica ridotta di rilevamento del segnale rispetto alla citometria del flusso di fluorescenza.
Il protocollo qui descritto è stato progettato per analizzare la dinamica del ciclo cellulare dai cheratinociti appena isolati (KC) dalla pelle del topo e caratterizzare l'espressione della proteina specifica del ciclo cellulare in queste cellule usando la citometria di massa. Questo protocollo può essere utilizzato anche con cellule coltivate o adattato ad altri tipi di cellule.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Cell Treat</td><td>229512</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione intercalatrice</td><td>Fluidigm</td><td>201192A</td><td>125 &; M - Soluzione intercalatrice Ir</td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>Paraformaldeide</td><td>Scienze 30525-89-4</td><td>16 %&nbsp; PFA</td></tr><tr><td>Tappo filtro tubi di flusso</td><td>Fisher/Corning</td><td>352235</td><td>35 &; m dimensione dei pori&nbsp;</td></tr><tr><td>Setaccio per celle</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td>40 &mu; m dimensione dei pori&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di distacco cellulare</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-ACCUTASE-100</td> Soluzione di iodio <td>accutasio</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher/Purdue</td><td>67618-151-17</td><td>Betadine 7,5%-iodio scrub chirurgico</td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione del codice a barre&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td></tr><tr><td>Codici a barre</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td></tr><tr><td>Strisce pH</td><td>EMD</td><td>9590</td><td>colorpHast</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Dulbecco' s Eagle Media</td></tr><tr><td>modificato Pinza fine</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-5-PO</td><td>Dumostar #5</td></tr><tr><td>Pinza curva di precisione</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-7-PO</td><td>Dumostar #7</td></tr><tr><td>Perle di calibrazione</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>EQ Perle di calibrazione a quattro elementi</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>Hank's Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>Water</td><td>Fisher</td><td>SH30538.03</td><td>Hyclone Acqua di grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Iododeossiuridina</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>I7125</td><td>IdU</td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>ThermoFisher</td><td>366656PK</td><td>filettatura interna</td></tr><tr><td>Tampone di colorazione cellulare</td><td>Fluidigm</td><td>201068</td><td>Maxpar Tampone di colorazione cellulare</td></tr><tr><td>Fix & tampone permanente</td><td>Fluidigm</td><td>201067</td><td>Maxpar Fix & Tampone permanente</td></tr><tr><td>Fix I tampone</td><td>Fluidigm</td><td>201065</td><td>Maxpar Fix I tampone</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Rockland</td><td>MB-008</td> Contenitore per il congelamento dell'isopropanolo <td>10x PBS senza metallo</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Mr.Frosty</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>NaOH Kord-Valmark</td><td>2900</td><td>Fornito da Genesee 32-107&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL conico</td><td>Olympus/Genesee</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conico</td><td>Olympus/Genesee</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Cell Treat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Sigma</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma/Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione per colorazione con antigene nucleare</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per colorazione con antigene nucleare</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per tubercolina</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Worthington Bioscience</td><td>CLSS-4</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e colorazione dei keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare e quantificare i cambiamenti dell'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare utilizzando singole cellule isolate dall'epidermide della pelle del topo. Ci sono sette passi importanti: separazione dell'epidermide dal dermide, digestione dell'epidermide, colorazione delle popolazioni di cellule epidermiche con cisplatina, codice a barre campione, colorazione con anticorpi metallici marcati per marcatori del ciclo cellulare e proteine di l'interesse, la rilevazione di anticorpi con etichettatura metallica mediante citometria di massa e l'analisi dell'espressione nelle varie fasi del ciclo cellulare. Il vantaggio di questo approccio rispetto ai metodi istologici è il potenziale per esaminare il modello di espressione di >40 marcatori diversi in una singola cella in diverse fasi del ciclo cellulare. Questo approccio consente anche l'analisi di correlazione multivariata dell'espressione proteica che è più quantificabile rispetto ai metodi istologici/immagini. Lo svantaggio di questo protocollo è che è necessaria una sospensione di singole cellule, che si traduce nella perdita di informazioni sulla posizione fornite dalla colorazione delle sezioni di tessuto. Questo approccio può anche richiedere l'inclusione di marcatori aggiuntivi per identificare diversi tipi di cellule nelle sospensioni cellulari grezze. L'applicazione di questo protocollo è evidente nell'analisi dei modelli di malattia iperplastica della pelle. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di specifici sottotipi di cellule (ad esempio, cellule staminali) mediante l'aggiunta di anticorpi specifici del lignaggio. Questo protocollo può anche essere adattato per l'analisi delle cellule della pelle in altre specie sperimentali.

La tabella 1 mostra le rese cellulari e la fattibilità previste dall'orecchio adulto del topo (Figura 1) e dalla pelle neoatale in condizioni non patologiche. La tabella mostra anche i dati rappresentativi degli animali provenienti da uno sfondo misto C57/126. Si prevede che la pelle di altri ceppi si tradurrà in rese cellulari e vitalità simili. La resa approssimativa dipende dalla superficie della pelle e indica che la pelle neonale sarebbe...

Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Questo protocollo è significativo per due motivi principali. Numero uno, consente a un utente di essere in grado di determinare gli stati del ciclo cellulare delle cellule della pelle che sono state isolate da un modello animale. Ci permette anche di essere in grado di analizzare l'espressione proteica nelle fasi discrete del ciclo cellulare.Rispetto ai precedenti metodi di determinazione della proliferazione cellulare, il nostro metodo consente una determinazione più precisa delle diverse fasi del ciclo cellulare, e possiamo anche analizzare più di 40 marcatori diversi nelle varie fasi della divisione cellulare. Ciò migliora notevolmente l'applicazione e la versatilità del metodo. Questo protocollo può essere utilizzato nella ricerca sul cancro e in qualsiasi altro tipo di malattia in cui è necessario determinare modelli specifici di espressione proteica del ciclo cellulare.Inoltre, questo protocollo può essere modificato in altri tipi di cellule e in altri organismi modello. La prima volta che l'utente dovrebbe concentrarsi sul ottenere la migliore preparazione cellulare di qualità possibile. Ciò richiede la lavorazione tempestiva della pelle sperimentale utilizzando reagenti freschi, un tempo minimo di digestione dei tessuti e un attento smaltimento del supernatante dopo la centrifugazione per preservare l'integrità e la quantità delle cellule.Per iniziare, progetta un pannello anticorpale con tag metallico utilizzando un software di progettazione di pannelli online gratuito, come descritto nel manoscritto. Quindi preparare una soluzione di stock idU sciogliendo la polvere idU a 10 milligrammi per millilitro in idrossido di sodio normale 0,1 a 60 gradi Celsius. Dopo aver aliquoto la soluzione stock idU in tubi a microcentrifugo, congelarli a meno 20 gradi Celsius per lo stoccaggio a lungo termine.Immediatamente prima dell'uso, regolare il pH della soluzione IdU a 7,5 con 12 acido cloridrico normale e testare con una striscia di pH su un'aliquota di scarto per assicurarsi che la soluzione sia a pH 7,5. Per preparare una soluzione di fissaggio a due x paraformaldeide, combinare cinque millilitri di 10 x PBS e un millilitro di 16%PFA con 44 millilitri di pura acqua distillata di livello molecolare. Per preparare 100 millimolare soluzione di cisplatino, sciogliere 300,5 milligrammi di polvere di cisplatino in 10 millilitri di DMSO.Per gli esperimenti da utilizzare per un giorno, preparare una soluzione di lavoro a cisplatino da 10 millimolare. Pesare i topi e quindi determinare una dose a 0,1 milligrammi di IDU per grammo di peso corporeo. Somministrare la dose calcolata di IDU mediante iniezione intraperitoneale e attendere due ore prima della raccolta delle cellule.Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per rimuovere chirurgicamente l'orecchio del topo eutanasiato precedentemente iniettato con IdU alla base dell'orecchio. Posizionare l'orecchio su una piastra di Petri asciutta di 100 millimetri. Separare accuratamente la parte anteriore dalla pelle posteriore utilizzando forcep fini per creare una tasca al centro o al bordo dell'area tagliata, quindi separare i due lembi della pelle e procedere con la pelle anteriore e posteriore.Posizionare con cura le pelli anteriori e posteriori di un orecchio in un unico pozzo di un piatto di coltura da 12 pozzetti, riempito con un millilitro di soluzione di dispasi/collagenasi preparata al momento, con il lato derma della pelle che tocca la soluzione. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per digerire la pelle. Posizionare l'orecchio digerito o la pelle neonatale in una piastra di Petri pulita con il lato epidermide che tocca la superficie del piatto.Usando le forcelle, appiattire la pelle e far scorrere delicatamente il derma dall'epidermide lavorando dal centro ai bordi con un motivo circolare. Con le forcep, afferrare l'epidermide ai bordi e sollevarla delicatamente staccandola dalla superficie della piastra di Petri. Posizionare con cura l'epidermide su una soluzione di distacco cellulare prerifuocata in un pozzo di una piastra.Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius o 20 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare forcep sterili per afferrare l'epidermide e strofinare trascinando l'epidermide contro il fondo del piatto per dissociare le cellule. Aggiungere un millilitro di DMEM contenente l'1%FBS e passare attraverso un setaccio cellulare di 40 micrometri in un tubo di raccolta.Risciacquare bene con altri due millilitri di DMEM e aggiungere alla sospensione cellulare. Dopo aver centrifugato a 120 volte g per cinque minuti, aspirare con cura il supernatante. Riutilizzarlo in uno o due millilitri di DMEM contenente l'1%FBS e pelletare nuovamente le celle come in precedenza.Per etichettare le cellule per determinare le cellule vive e morte, resuspend da uno a tre milioni di cellule in un millilitro di DMEM contenente 25 micromolare cisplatino e incubare per un minuto. Tempra mediante pipettazione con un volume uguale di FBS. Dopo aver centrifugato a 120 volte g per cinque minuti, decantare il supernatante in un bicchiere contenente candeggina diluita e invertire i tubi per drenare la soluzione rimanente su un tovagliolo di carta.Resuspend il pellet cellulare in due millilitri di PBS privo di cationi di bario e centrifugarli di nuovo come descritto in precedenza. Per fissare le cellule, risosopendare il pellet cellulare in un millilitro di PBS privo di cationi bario. Vortice le cellule sotto bassa potenza continua e aggiungere un millilitro dei due x PFA buffer di fissazione drop-wise.Posizionare su una piattaforma a dondolo e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver centrifugato a 500 volte g per cinque minuti, decantare con cura il supernatante. Lavare le celle con due millilitri di PBS privo di bario, centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni e ripetere la fase di lavaggio.Infine, resuspend il pellet in due millilitri di PBS privo di cationi di bario. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti e decantare con cura il supernatante. Risospendire le cellule in un millilitro di un tampone di fissazione x e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e ripetere la centrifugazione.Per lavare le celle, aggiungere un millilitro di buffer di permeabilizzazione del codice a barre. Durante la centrifugazione cellulare a 500 volte g per cinque minuti, preparare i codici a barre aggiungendo loro 100 microlitri di buffer di permeabilizzazione dei codici a barre e mescolare immediatamente. Resuspend il pellet cellulare in 800 microlitri di tampone di permeabilizzazione dei codici a barre.Aggiungere la soluzione di codici a barre alle cellule, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifuga a 500 volte g per cinque minuti. Lavare nuovamente le cellule in due millilitri di tampone di colorazione cellulare e centrifugare.Successivamente, resospendare da uno a tre milioni di cellule in un millilitro di soluzione di lavoro tampone di colorazione dell'antigene nucleare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver centrifugato a 500 volte g per cinque minuti, decantare con cura il supernatante. Rimospendare le cellule in un millilitro di tampone di permeabilizzazione dell'antigene nucleare e centrifugare di nuovo.Dopo la resuspensione ripetuta e la centrifugazione, rimorsi il pellet cellulare nel volume residuo con un vortice delicato. Aggiungere 50 microlitri di cocktail di anticorpi intracellulari, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Aggiungere due millilitri di tampone di colorazione cellulare.Centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni del passaggio precedente e rimuovere il supernatante. Rimospendare il pellet in due millilitri di tampone di colorazione cellulare, centrifugare a 500 volte g per cinque minuti e ripetere la sospensione e la centrifugazione. Resospendare le cellule in un millilitro di soluzione di intercalazione e conservare per uno o tre giorni a quattro gradi Celsius.Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, lavare il pellet con due millilitri di tampone di colorazione cellulare, centrifugare nelle stesse condizioni ed eseguire due lavaggi aggiuntivi con due millilitri di acqua, con la stessa centrifugazione. Rimescolare il pellet cellulare ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro con soluzione diluita di perline EQ, quindi eseguire i campioni sul citometro di massa. Vengono determinate le rese cellulari previste e la vitalità dall'orecchio adulto del topo e dalla pelle neonatale.La resa approssimativa dipende dalla superficie della pelle. La pelle neonatale è una scelta migliore per gli esperimenti che richiedono un numero maggiore di cellule. Viene mostrata la strategia di gating di base da selezionare per le cellule intatte, singole e vitali, dopo la normalizzazione e la deconvoluzione dei dati di citometria di massa codificati a barre.La percentuale di cellule vitali può essere indicativa della qualità o delle condizioni delle cellule prima della colorazione. Vengono mostrate anche differenze di vitalità tra le cellule carcinoma coltivate rispetto alle cellule isolate dell'orecchio del topo. Le cellule vitali sono state gated sulla lunghezza dell'evento rispetto al CD45 per escludere le cellule ematopoietiche.L'inclusione di marcatori di lignaggio consente la selezione delle popolazioni cellulari di interesse in diverse fasi del ciclo cellulare. Il profilo del ciclo cellulare di base è ottenuto dal rilevamento di BrdU contro PI nella citometria a flusso a base fluorescente. Tuttavia, l'inclusione di altri marcatori di proliferazione con citometria di massa, consente un'identificazione più precisa delle fasi del ciclo cellulare.Seguendo questo approccio, i profili del ciclo cellulare possono essere costruiti per diversi tipi di cellule o condizioni sperimentali, come i profili per le celle positive CD45 negative rispetto a CD45 dello stesso esperimento. In un altro esempio, l'analisi dei marcatori che definiscono le vie di segnalazione EGFR e mTOR PI3K nella fase G-one, ha rivelato profili di espressione simili nelle celle negative CD45, mostrate in arancione, e nelle cellule positive CD45, mostrate in blu. La citometria di massa richiede molte cellule di alta qualità.Se un utente è interessato a una popolazione cellulare rara, potrebbe essere necessario un numero maggiore di celle. Le cellule vive isolate possono essere utilizzate per l'analisi del DNA o dell'RNA, studi biochimici o possono essere utilizzate nella coltura tissutale prima della fissazione e della colorazione per la citometria di massa. L'utente deve utilizzare attrezzature di protezione individuale e un armadietto di sicurezza quando necessario, quando lavora con paraformaldeide, acido cloridrico o idrossido di sodio.

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Biologia dello sviluppo

Carcinogenesi è un processo che coinvolge le interazioni tra cellule tumorali e il microambiente cancro. Per sezionare gli eventi molecolari, si ha la necessità di isolare diverse popolazioni di cellule in diverse fasi durante lo sviluppo del cancro. Utilizzando un modello murino di carcinoma a cellule basali, si descrive un protocollo per l'analisi di cellule durante la carcinogenesi.

Analisi popolazione cellulare Durante carcinogenesi della pelle

La pelle ospita una complessa rete di cellule immunitarie. Descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo, proveniente da diverse parti del corpo dell'animale, al fine di ottenere una sospensione unicellulare e analizzare le diverse popolazioni leucocitarie residenti nella pelle mediante citometria a flusso.

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Questo protocollo descrive la digestione enzimatica della pelle di topo in un terreno ricco di sostanze nutritive seguita dalla separazione in gradiente per isolare i leucociti.  Le celle così derivate possono essere utilizzate per diverse applicazioni a valle. Si tratta di un'alternativa efficace, economica e migliorata alle macchine per la dissociazione dei tessuti e ai protocolli di digestione dei tessuti più aggressivi basati su tripsina e dispasi.

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Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Questo articolo descrive la raccolta e l'elaborazione di campioni per l'analisi della citometria di massa.

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Questo rapporto descrive un protocollo CUBIC per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare pattern di espressione delle proteine, le cellule proliferanti, e sebociti alla risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale dei topi adulti per una varietà di applicazioni a valle come la biologia molecolare, la biochimica, lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza e gli usi primari in vitro (ad esempio, clonogenici cheratinociti).

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

L'espansione clonale è una caratteristica chiave della risposta delle cellule T antigene-specifiche. Tuttavia, il ciclo cellulare delle cellule T che rispondono all'antigene è stato scarsamente studiato, in parte a causa di limitazioni tecniche. Descriviamo un metodo citometrico a flusso per analizzare le cellule T CD8 antigene-specifiche in espansione clonale nella milza e nei linfonodi di topi vaccinati.

Un test di citometria a flusso basato su DNA / Ki67 per l'analisi del ciclo cellulare di cellule T CD8 antigene-specifiche in topi vaccinati

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&amp;RUN).

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&amp;RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Descriviamo i protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula di cellule epiteliali timiche-di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

Scopri l'isolamento e la colorazione dei keratinociti cutanei del topo per l'analisi del ciclo cellulare mediante citometria di massa. Questo metodo consente di profilare oltre 40 marcatori proteici con precisione.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per lanalisi specifica del ciclo cellulare dellespressione proteica cellulare da citometria di massa (Video) | JoVE Journal

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

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