Name: Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Scopri la tomografia a coerenza ottica automatizzata per studiare la morfogenesi dei biofilm su larga scala. Questo sistema non invasivo consente il monitoraggio tridimensionale di biofilm superiori a 250 mm².

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Ringraziamo Mauricio Aguirre Morales per il suo contributo allo sviluppo di questo sistema.  Il sostegno finanziario è stato fornito dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza a T.J.B.

1. Configurazione del dispositivo di posizionamento
<ol><li>Collegare il dispositivo di posizionamento a una scheda microcontrollore, seguendo le istruzioni in https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.</li>
	<li>Collegare il microcontrollore a un computer a scheda singola con connessione internet tramite un cavo USB e installare il server GRBL come descritto nel https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Ora il dispositivo di posizionamento dovrebbe essere navigabile da una pagina web ospitata in http://IP:5020/. In alternativa, è possibile navigare nel dispositivo di posizionamento con uno script Python, come illustrato nella prima parte dell'esempio di lavoro ImagesAcquisition.ipynb (File supplementare 2).</li>
</ol>2. Configurazione dello Strumento di personalizzazione di Office
<ol><li>Montare la sonda dello Strumento di personalizzazione di Office sul dispositivo di posizionamento utilizzando un supporto compatibile con coda di colomba. Se necessario, installare un adattatore di immersione sull'obiettivo.</li>
	<li>Posizionare il computer e l'unità di base dello Strumento di personalizzazione di Office su un banco accanto all'esperimento (ad esempio, dispositivi microfluidici, camere di flusso, flumi, sistemi di filtrazione). Assicurarsi che il cavo ottico (lunghezza massima di circa 1,8 m) sia liberamente in movimento, abbastanza a lungo da raggiungere tutte le posizioni previste e non interferisca con la configurazione sperimentale.</li>
	<li>Installare il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office con il software disponibile come descritto dal produttore.</li>
	<li>Installare i pacchetti software per l'acquisizione automatica dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office come descritto in https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.</li>
</ol>3. Acquisizione di immagini
<ol><li>Accendere il sistema OCT e il dispositivo di posizionamento. Assicurarsi che il dispositivo possa muoversi liberamente.</li>
	<li>Aprire il file config.json in un editor di testo. Modificare il file config.json per regolare il parametro di acquisizione dell'immagine predefinito (Tabella 2), ad esempio l'indice di rifrazione (1,33 per l'acqua a 20 , 1,00 per air) e la cartella di destinazione per i dati e i metadati acquisiti.</li>
	<li>Definire le dimensioni del campo di visualizzazione (FOV) e il numero di a-scan per B-scan in config.json. NOTA: questi due parametri determinano la dimensione dei voxel del set di dati finale e le dimensioni del file di output e devono corrispondere alla risoluzione ottica della sonda (la dimensione di voxel x-y non deve essere inferiore alla metà della risoluzione ottica). Il numero di scansioni A e B influisce sull'entità spaziale da coprire e quali operazioni con lo spazio disponibile su disco e la potenza di elaborazione.</li>
	<li>Definire i limiti del segnale dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office di output in config.json. Questi dipendono dal tipo di campione. Si raccomanda quindi di determinare questi parametri in base agli istogrammi di intensità di una serie di scansioni preliminari. Salvare le modifiche in config.json.</li>
	<li>Spostare il probe dello Strumento di personalizzazione di Office fino a un sito di interesse. Mettere a fuoco il campione e regolare il braccio di riferimento e l'intensità della sorgente luminosa per una qualità ottimale dell'immagine. Ripetere questa procedura per un certo numero di posizioni e prendere nota delle coordinate. NOTA: ciò consentirà la successiva acquisizione automatica dell'analisi automatica dello Strumento di personalizzazione di Office intorno a questi punti di riferimento. Si noti che la lunghezza e l'intensità del braccio di riferimento non possono essere modificate durante l'acquisizione automatica dell'immagine.</li>
	<li>Aprire il file ImageAcquisition.ipynb (File supplementare 2) in Juypter Notebook. Ogni cella contiene il codice per eseguire attività specifiche e può essere eseguito separatamente tramite la pressione di Cell Eseguire ,oppure premere CTRL e INVIO o MAIUSC e INVIO.<ol>
<li>Impostare il percorso per le librerie necessarie e i parametri di configurazione predefiniti. In alternativa, definire un nuovo set di parametri temporanei.
</li>
		<li>Connettersi al dispositivo di posizionamento e inizializzare lo Strumento di personalizzazione di Office.</li>
		<li>Calibrare il dispositivo di posizionamento (cioè, eseguire un "homing").</li>
		<li>Acquisire i set di dati che coprono le posizioni di interesse in un modello a scansione singola o mosaico, specificando il numero e la sovrapposizione (ad esempio, 30%) di piastrelle vicine. NOTA: la memoria viene allocata prima della scansione, che ottimizza l'utilizzo delle risorse del computer. I dati vengono salvati in formato 8 bit ,ovvero .raw per risparmiare spazio di archiviazione, nella cartella di destinazione definita in config.json, utilizzando il timestamp e la posizione come convenzione di denominazione (ad esempio, %Y%m%d_%H%M%S_<position>). I metadati, incluse le impostazioni e le coordinate dello Strumento di personalizzazione di Office, vengono salvati nella stessa cartella in un filecon estensione srm con la stessa convenzione di denominazione. A seconda di impostazioni quali FOV e risoluzione, le dimensioni del file possono raggiungere fino a 1,5 GB per analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.</position></li>
	</ol>
</li>
	<li>Per evitare l'interruzione dell'acquisizione dei dati, assicurarsi che lo spazio disponibile su disco sia sufficiente o spostare continuamente i set di dati dello strumento di personalizzazione di Office in un disco rigido esterno.</li>
</ol>4. Correzione e visualizzazione dell'immagine
<ol><li>Aprire il blocco appunti di Jupyter ImageProcessing.ipynb ( File supplementare1) per un esempio di elaborazione delle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office (correzione della distorsione, sottrazione dello sfondo, calcolo delle mappe di elevazione, cucitura delle mappe di elevazione).</li>
	<li>Se necessario, ritagliare le scansioni oct per escludere i segnali spurie e riorientare il set di dati (biofilm dovrebbe apparire sopra il substrato).</li>
	<li>Corretto per l'aberrazione sferica. Ciò avviene con un algoritmo di correzione che utilizza una superficie di riferimento altamente riflettente nota per essere piatta (ad esempio, fondo del flume, substrato). In primo luogo, l'algoritmo definisce una griglia di linee verticali 20-20 regolarmente distanziate sul piano xy dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office. Quindi, seleziona un'area circolare intorno a ogni punto e calcola la media delle intensità del segnale lungo il profilo verticale (Figura 2B). I profili verticali vengono elaborati con un filtro gaussiano modificato: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59356/59356eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> dove x è il segnale di ingresso, e la sua deviazione standard, mentre C è determinato come: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59356/59356eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> La superficie di riferimento è localizzata come maxima locale in ciascuno di questi profili. I punti identificati in modo non corretto vengono filtrati in base alle posizioni dei loro vicini in tre dimensioni (Figura 2C). Infine, una superficie polinomiale di 2nd ordine che riflette la distorsione introdotta dall'obiettivo di scansione è montata su questi punti (Figura 2C). La superficie montata viene quindi utilizzata per spostare ogni pixel nella direzione z, ottenendo così un'immagine appiattita. I parametri di questo algoritmo devono essere regolati in base alle caratteristiche dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.</li>
	<li>Correggere il rumore di fondo. Identificare un'area vuota dell'immagine (in genere sopra il biofilm) e utilizzare l'algoritmo di correzione per sottrarre l'intensità media dello sfondo dai valori di intensità dell'immagine per produrre un'immagine finale corretta dello Strumento di personalizzazione di Sistema (Figura 2D).</li>
	<li>Calcolare una mappa di elevazione dal set di dati 3D OCT. In questa fase, definire una superficie di riferimento di interesse per l'esperimento specifico (ad esempio, il substrato) e un'intensità di soglia appropriata. Quindi, utilizzare l'algoritmo di calcolo della mappa di elevazione dei privilegi per calcolare lo spessore del biofilm per ogni coordinata (x,y) della maschera binaria e assegnarlo a una nuova matrice 2D (Figura 3A). I valori di spessore vengono quindi assegnati a una matrice 2D delle dimensioni dell'immagine originale nelle direzioni x e y. Viene eseguito il rendering di un'immagine in cui la quota altimetrica della superficie viene segnalata come valore in scala di grigi (Figura 3B).</li>
	<li>Nel caso in cui diverse scansioni dello OCT sono prese in un modello a mosaico, definire il numero di righe e colonne e cucire le rispettive mappe di elevazione. La figura 5 presenta esempi di mappe di elevazione cucite, che coprono l'ampia gamma di scale e risoluzioni spaziali raggiungibili con la configurazione descritta.</li>
</ol>

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature reviews. Microbiology. 14, 563(2016).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillation+characteristics+of+biofilm+streamers+in+turbulent+flowing+water+as+related+to+drag+and+pressure+drop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop.</a> Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+migratory+ripples+in+a+mixed+species+bacterial+biofilm+growing+in+turbulent+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow.</a> Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).</li>
<li>Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Natural+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).</li>
<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Microbiology. 14, 251-263 (2016).</li>
<li>Battin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+landscapes%3A+new+paths+to+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial landscapes: new paths to biofilm research.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).</li>
<li>Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+coherence+microscopy+for+the+in+situ+investigation+of+the+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm.</a> J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002(2016).</li>
<li>Wagner, M., Horn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+in+biofilm+research%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li>
<li>Haisch, C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+transient+processes+in+biofilms+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography.</a> Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).</li>
<li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+W+%22Optical+Coherence+Tomography%3A+Technology+and+Applications%22">Optical Coherence Tomography: Technology and Applications</a>. , Springer Verlag. (2008).</li>
<li>Fercher, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+%E2%80%93+development%2C+principles%2C+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Medizinische+Physik%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography – development, principles, applications.</a> Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).</li>
<li>Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+speed+spectral-domain+optical+coherence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy.</a> Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).</li>
<li>Fortunato, L., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+biofouling+assessment+in+spacer+filled+channels+using+optical+coherence+tomography+%28OCT%29%3A+3D+biofilm+thickness+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping.</a> Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
<li>Roche, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benthic+biofilm+controls+on+fine+particle+dynamics+in+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams.</a> Water Resources. 53, 222-236 (2016).</li>
<li>Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approach+to+characterize+fouling+on+a+flat+sheet+membrane+gravity+driven+submerged+membrane+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor.</a> Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).</li>
<li>Morgenroth, E., Milferstedt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+engineering%3A+linking+biofilm+development+at+different+length+and+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Environmental+Science+and+Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales.</a> Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).</li>
</ol>

La sediglia è stata impiegata presso Thorlabs Inc.

L'imaging dello OCT è adatto per risolvere le strutture nella gamma dei micrometri con un FOV di diversi millimetri quadrati. È quindi un potente strumento per la ricerca sui biofilm10,18. Tuttavia, lo OCT è attualmente limitato a un'area discansione massima di 100 - 256 mm 2, mentre i modelli strutturali dei biofilm spesso superano questa scala spaziale19, soprattutto quando la differenziazione morfologica è guidata da gradient...

I biofilm sono un adattamento di stile di vita microbico di grande successo e queste comunità di microrganismi associate a matrici associate a matrici e associate a matrici dominano la vita microbica in ambienti naturali e industriali1,2. Lì, i biofilm formano architetture complesse, comegli streamer allungati 3, le increspature4 o i tappi simili a funghi5 con importanti conseguenze per la crescita del biofilm, la stabilità strutturale e la resistenza allo stress6. Mentre molto sulla differenziazione strutturale dei biofilm è stata appresa dal lavoro sulle culture monospecie coltivate in camere di flusso in miniatura, la maggior parte dei biofilm sono comunità altamente complesse, spesso compresi i membri di tutti i domini della vita6. Apprezzare questi complessi biofilm come paesaggi microbici7 e comprendere come la struttura e la funzione dei biofilm interagiscono in comunità complesse è quindi in prima linea nella ricerca sui biofilm.
Una comprensione meccanicistica della morfogenesi di biofilm complessi in risposta a segnali ambientali richiede esperimenti attentamente progettati in combinazione con osservazioni spaziali e temporali della struttura fisica dei biofilm attraverso bilance8. Tuttavia, l'osservazione non distruttiva della crescita di biofilm nei sistemi sperimentali è stata fortemente limitata da vincoli logistici come la necessità di spostare campioni (ad esempio, al microscopio) spesso danneggiando la delicata struttura del biofilm.
Il protocollo qui presentato introduce un sistema completamente automatizzato basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente il monitoraggio in situ e non invasivo della morfogenesi dei biofilm su scala mesoscala (gamma mm). L'OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm con applicazioni nel trattamento delle acque e nella ricerca sul biofouling, medicina9 ed ecologia del flusso10. Nella PTOM, una sorgente di luce a bassa coerenza viene divisa in un campione e in un braccio di riferimento; viene analizzata l'interferenza della luce riflessa e dispersa dal biofilm (braccio campione) e la luce del braccio di riferimento. Una serie di profili di intensità assiale (A-scan) che contiene informazioni strutturali risolte in profondità viene acquisita e unita in un B-scan (una sezione trasversale). Una serie di B-scan adiacenti compone la scansione del volume 3D finale10. Il PToM fornisce una risoluzione ottica laterale nell'intervallo di circa 10 m ed è quindi adatto per studiare la differenziazione strutturale mesoscopica dei biofilm10,12. Per una descrizione più dettagliata dello Strumento di personalizzazione di Office, fare riferimento a Drexler e Fujimoto13e Fercher e colleghi14. Sebbene il campo visivo di una singola analisi xy dello Strumento di personalizzazione di Office raggiunga fino a centinaia di micrometri quadrati, i modelli su scala più grande non possono essere quantificati mediante lo Strumento di personalizzazione di Office in una singola analisi. Per quanto riguarda i biofilm in habitat naturali come corsi d'acqua e fiumi, questo attualmente limita la nostra capacità di valutare la morfogenesi del biofilm su scale corrispondenti al modello fisico e idraulico dell'habitat.
Per superare questi limiti spaziali e acquisire automaticamente le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office, è stata montata una sonda di imaging dello OCT basata su un dominio spettrale su un sistema di posizionamento a 3 assi. L'installazione consente l'acquisizione di diverse scansioni OCT in un mosaico sovrapposto (taccature), ottenendo in modo efficace l'imaging tomografico di aree di superficie fino a 100 cm2. Inoltre, l'elevata precisione di posizionamento di questo sistema consente di monitorare in modo affidabile la crescita e lo sviluppo delle caratteristiche dei biofilm in siti specifici durante esperimenti a lungo termine. Il sistema è modulare e singoli componenti (ad esempio, dispositivo di posizionamento e OCT) dell'installazione possono essere utilizzati come soluzioni autonome o combinati in modo flessibile. Figura 1 fornisce una panoramica dei componenti hardware e hardware dell'installazione.
Il sistema è stato testato con un dispositivo di posizionamento CNC a supporto GRBL disponibile in commercio (Table of Materials). Le distanze di funzionamento di questa specifica piattaforma di posizionamento sono di 600-840-140 mm, con una precisione indicata dal produttore di 0,05 mm e una risoluzione programmabile di 0,005 mm. GRBL è un open-source (licenza GPLv3), un controllo del movimento ad alte prestazioni per CNC Dispositivi. Pertanto, ogni dispositivo di posizionamento basato su GRBL (versione > 1.1) deve essere compatibile con le linee guida e i pacchetti software qui presentati. Inoltre, il software potrebbe essere adattato ad altri controller stepmotor con tipo di ingresso STEP-DIR con poche modifiche.
Il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzato per valutare le prestazioni del sistema (Tabella dei materiali) presenta una sorgente luminosa a bassa coerenza con una lunghezza d'onda centrale di 930 nm (larghezza di banda : 160 nm) e lunghezza e intensità del braccio di riferimento regolabili. Nell'esempio qui presentato è stato utilizzato anche un adattatore per l'immersione della sonda dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella dei materiali). Il pacchetto software sviluppato qui per l'acquisizione automatica dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office dipende in modo critico dall'SDK fornito insieme al sistema dello Strumento di personalizzazione di Office specifico, tuttavia, i sistemi dello Strumento di personalizzazione di Office dello stesso produttore con lenti di scansione e lunghezze d'onda centrali diverse dovrebbero essere prontamente compatibile.
Il dispositivo GRBL è controllato da un server Web installato su un computer a scheda singola (Figura 1). Ciò garantisce il controllo remoto del dispositivo da qualsiasi computer con accesso a Internet o rete locale. Il dispositivo DELLO Strumento di personalizzazione di Office è controllato da un computer separato, consentendo il funzionamento del sistema OCT a parte la configurazione sperimentale automatizzata. Infine, i pacchetti software includono librerie per sincronizzare il posizionamento del probe dello Strumento di personalizzazione di Office e l'acquisizione dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office (ad esempio, per acquisire automaticamente i set di dati di imaging 3D in un modello a mosaico o in un insieme di posizioni definite). La definizione della posizione della sonda OCT in 3D consente di regolare in modo efficace il piano focale in base a insiemi di scansioni (regionali). In particolare, su superfici non uniformi, è possibile specificare piani focali diversi (ad esempio, posizioni diverse nella direzione z) per ogni analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.
È stato sviluppato un set di pacchetti softwareper elaborare le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella 1). Navigazione del dispositivo di posizionamento, l'acquisizione della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office e l'elaborazione del set di dati vengono eseguite con notebook Jupyter con codifica Python, che consentono una notevole flessibilità nello sviluppo e nell'ottimizzazione del software. Due esempi lavorati e annotati di tali notebook (rispettivamente per l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini) sono disponibili da https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Essi sono da intendersi come punti di partenza per la personalizzazione del metodo. Un notebook Jupyter è un'applicazione basata su browser web che contiene celle con codice Python con annotato. Ogni passaggio è contenuto in una cella del blocco appunti, che può essere eseguita separatamente. A causa della diversa lunghezza del percorso della luce attraverso l'obiettivo di scansione (aberrazione sferica)15, le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office appaiono distorte (Figura 2A). Abbiamo sviluppato un algoritmo per correggere automaticamente questa distorsione nelle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office acquisite (contenute in ImageProcessing.ipynb, Supplementary File 1). Inoltre, la morfologia dei biofilm può essere visualizzata come una mappa di elevazione 2D, come è stato precedentemente utilizzato nei sistemi di membrana16, e illustriamo come le mappe di elevazione ottenute da scansioni prese in una matrice di afiltura possono essere cucite.
Infine, la funzionalità dell'installazione di laboratorio descritta viene illustrata utilizzando un esperimento a flume in cui il biofilm del flusso fototrofico è esposto a un gradiente di velocità del flusso.

<table><tbody><tr><td>Sonda OCT</td><td>Thorlabs</td><td>GAN210C1</td><td>dispositivo di imaging OCT</td></tr><tr><td>Lente di scansione OCT</td><td>Thorlabs</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore ad immersione</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-IMM3-SP1</td><td></td></tr><tr><td>Stepcraft 840 CK</td><td>STEPCRAFT</td><td>NA</td><td>dispositivo di posizionamento</td></tr><tr><td>microcontrollore</td><td>Arduino Uno R3</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera a scheda singola</td><td>Raspberry PI</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>fotocamera Canon EOS 7D Mark II</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>obiettivo della fotocamera</td><td>Canon MACRO EFS 35 mm</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografia a coerenza ottica 3d automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

I biofilm sono uno stile di vita microbico di maggior successo e prevalgono in una moltitudine di ambienti ambientali e ingegnerizzati. Comprendere la morfogenesi dei biofilm, cioè la diversificazione strutturale dei biofilm durante l'assemblaggio della comunità, rappresenta una sfida notevole su scale spaziali e temporali. Qui presentiamo un sistema automatizzato di imaging di biofilm basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT). L'OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm. Tuttavia, la quantità di dati che attualmente possono essere acquisiti ed elaborati ostacola l'inferenza statistica di modelli su larga scala nella morfologia dei biofilm. Il sistema di imaging automatizzato dello OCT consente di coprire ampie scale temporali spaziali ed estese della crescita dei biofilm. Combina un sistema OCT disponibile in commercio con una piattaforma di posizionamento robotico e una suite di soluzioni software per controllare il posizionamento della sonda di scansione dello Strumento di personalizzazione di Office, nonché l'acquisizione e l'elaborazione di set di dati di imaging di biofilm 3D. Questa configurazione consente il monitoraggio automatizzato in situ e non invasivo dello sviluppo di biofilm e può essere ulteriormente sviluppata per associare l'imaging dello OCT a macrofotografia e alla profilatura dei microsensori.

Dimostriamo la funzionalità del sistema automatico di imaging OCT utilizzando un esperimento di flume progettato per studiare la morfogenesi spatio-temporale dei biofilm fototrofici. Una geometria gradualmente restringimento dei flumi indusse gradienti in velocità di flusso lungo il centro del flume (vedi riferimento17).  Lo sviluppo temporale e la differenziazione strutturale del biofilm sono stati monitorati per 18 giorni con l'obiettivo di comprendere meglio gli effetti delle condizioni idrodinam...

I biofilm microbici formano architetture complesse a interfasi e si sviluppano in modelli spaziali altamente dipendenti dalla scala. Qui, introduciamo un sistema sperimentale (hard e software) per l'acquisizione automatizzata di set di dati di tomografia a coerenza ottica 3D (OCT). Questo set di strumenti consente la caratterizzazione non invasiva e multiscala della morfogenesi dei biofilm nello spazio e nel tempo.

Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Qui presentiamo un sistema automatizzato basato sulla tomografia a coerenza ottica o OCT. Questo ci permette di monitorare la struttura dei biofilm su grandi scale spaziali o lunghi periodi di tempo. L'imaging OCT è adatto per risolvere strutture nell'intervallo del micrometro, tuttavia è attualmente limitato a un'area massima di circa 250 millimetri quadrati.I biofilm spesso superano questa scala, specialmente quando la differenziazione è guidata da gradienti ambientali su larga scala. La configurazione sperimentale ci permette di monitorare la morfogenesi tridimensionale dei biofilm su grandi scale spaziali e lunghi periodi di tempo. Il sistema è veloce, preciso e funziona in modo autonomo.Abbiamo studiato la morfogenesi dei biofilm nei flussi in cui guidano importanti processi ecosistemici. Tuttavia, il sistema può essere utilizzato per studiare biofilm in altri sistemi naturali o ambienti ingegnerizzati. Il software per il posizionamento, l'acquisizione di immagini e l'analisi è scritto in Python.Sono disponibili tramite jupyter notebook. Si tratta di soluzioni facili da usare, liberamente disponibili e flessibili. Crediamo che la rappresentazione visiva della configurazione aiuti altri utenti a riprodurre l'installazione e a comprendere meglio il software.Speriamo che questo ispiri altri ricercatori ad adottare approcci simili. Ecco una panoramica dell'installazione. Il sistema è composto da un dispositivo di posizionamento di precisione, la sonda OCT, ed è assemblato attorno a un flume in plexiglass.Inizia collegando il dispositivo di posizionamento seguendo insieme alle istruzioni pubblicate su GitHub. Una volta connesso, installare il server GRBL come descritto in una pagina GitLab separata. Il sistema di posizionamento può ora essere controllato attraverso questa pagina web;in alternativa può essere controllato attraverso uno script Python come mostrato nell'esempio lavorato.Posizionare il computer e l'unità di base dello Strumento di personalizzazione di Office su un banco accanto alla configurazione sperimentale contenente dispositivi microfluidici, camere di flusso, fumi o sistemi di filtrazione. Se non è già installato, installare il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office insieme al software disponibile come descritto dal produttore. Quindi installare i pacchetti software per l'acquisizione automatica della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office come descritto nei documenti GitLab collegati qui.Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, montare la sonda tomografica a coerenza ottica sul dispositivo di posizionamento utilizzando un supporto a coda di rondine compatibile. Se necessario, installare un adattatore ad immersione sull'obiettivo, quindi alimentare il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office e il dispositivo di posizionamento. Aprire il software dello Strumento di personalizzazione di Office commerciale, individuare un sito di interesse, concentrarsi sul campione e regolare il braccio di riferimento e l'intensità della sorgente luminosa per una qualità dell'immagine ottimale.Prendete nota delle coordinate e ripetete questa procedura per un certo numero di posizioni mantenendo la stessa lunghezza e intensità del braccio di riferimento. Aprire ImageAcquisition. ipynb trovato nel file complementare 2 di questo articolo nel quaderno Jupyter.Ogni cella contiene codice per eseguire attività specifiche e può essere eseguita separatamente premendo Cella, quindi Esegui o Controlla e Invio o Invio e Invio. Seguire l'esempio elaborato per impostare il percorso delle librerie necessarie per collegare il dispositivo di posizionamento per calibrare il dispositivo di posizionamento per inizializzare lo scanner dello Strumento di personalizzazione di Office. Quindi regolare i parametri di acquisizione, incluso l'indice di rifrazione, le dimensioni del campo visivo e il numero di scansioni A per scansione B.Inoltre, impostare i limiti del segnale della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office in base agli istogrammi di intensità delle scansioni preliminari e alla cartella di destinazione per i dati e i metadati acquisiti. A seconda del campo visivo e della risoluzione, le dimensioni del file possono raggiungere fino a 1,5 gigabyte per scansione dello Strumento di personalizzazione di Office. Questi due parametri determinano la dimensione dei voxel nel set di dati finale e le dimensioni del file di output.Dovrebbero corrispondere alla risoluzione ottica della sonda OCT. Come evidenziato nell'esempio elaborato, è possibile acquisire una singola analisi dello Strumento di personalizzazione di Office con parametri predefiniti o acquisire una singola scansione specificando un set diverso di parametri. È inoltre possibile fornire coordinate specifiche per spostare il dispositivo di posizionamento e acquisire una singola scansione dello Strumento di personalizzazione di Office.Questa funzione consente di tornare ripetutamente nella stessa identica posizione nell'esperimento con un'elevata precisione spaziale. I dati vengono salvati in 8 bit. formato non elaborati per risparmiare spazio di archiviazione.I metadati, incluse le impostazioni e le coordinate dello Strumento di personalizzazione di Office, vengono salvati nella stessa cartella in un file json con la stessa convenzione di denominazione. In alternativa, specificare un elenco di posizioni di interesse e acquisire automaticamente le rispettive scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office. Al fine di caratterizzare le strutture morfologiche del biofilm attraverso grandi gradienti ambientali, acquisire scansioni in un motivo a mosaico.Per questo, specificare il numero di riquadri adiacenti con una sovrapposizione predefinita del 30%Le scansioni non elaborati dello Strumento di personalizzazione di Office appaiono distorte. Ciò è dovuto alle differenze nella lunghezza del percorso attraverso il sistema ottico. Abbiamo sviluppato un algoritmo che corregge questa distorsione come mostrato negli esempi lavorati.Per iniziare la correzione dell'immagine, aprire il notebook Jupyter ImageProcessing.ipynb. Seguendo questo esempio, ritagliare prima le scansioni oct per escludere segnali spuri e riorientare il set di dati in modo che il biofilm appaia sopra il substrato. Successivo corretto per l'aberrazione sferica.A tale scopo, l'algoritmo localizza una superficie piana altamente riflettente nell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office e la utilizza come riferimento per appiattire le scansioni. Attraverso una griglia 20 per 20, l'algoritmo identifica quindi i massimi locali nell'intensità del segnale per localizzare la superficie di riferimento. Quindi una superficie polinomiale di secondo ordine viene montata su questi punti e utilizzata per spostare ogni pixel della scansione OCT in direzione Z.I parametri di questo algoritmo devono essere regolati in base alle caratteristiche della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office. Questa correzione consente una superficie di riferimento omogenea su più immagini e facilita quindi la cucitura di immagini su larga scala. Una volta appiattita l'immagine, le immagini vengono corrette per il rumore di fondo identificando un'area vuota dell'immagine sopra il biofilm e sottraendo l'intensità media dello sfondo.Quindi calcola una mappa di elevazione dal set di dati dello Strumento di personalizzazione di Office 3D. A tale fine, definire una superficie di riferimento come il substrato e scegliere una soglia di intensità appropriata. Quindi viene eseguito il rendering di una mappa di elevazione con l'altezza del biofilm riportato come valore in scala di grigi.Se le immagini sono state acquisite in un motivo a mosaico, cucire le rispettive mappe di elevazione applicando l'algoritmo di cucitura. Utilizzando l'imaging oct automatizzato, la morfogenesi spatiotemporale dei biofilm a flusso fototrofico è stata esaminata utilizzando esperimenti sui fumi. I flumes sono fatti di plexiglass e si allargano gradualmente dall'interno al deflusso.Ciò si traduce in un gradiente nella velocità del flusso. Ecco una mappa di elevazione di un biofilm che cresce lungo l'intero gradiente di velocità del flusso. È importante sottolineare che il sistema automatizzato di imaging OCT consente una misurazione continua di parametri strutturali come lo spessore del biofilm, la rugosità e il biovolume in diverse condizioni di flusso che vanno dalla velocità a basso flusso alle condizioni di velocità ad alto flusso.Insieme ai cambiamenti morfologici, il biovolume medio è diminuito significativamente in funzione della distanza dall'ingresso nel flume. La qualità delle scansioni oct dipende in modo critico dalla lunghezza del braccio di riferimento e dalla distanza di messa a fuoco. Potrebbe essere necessario riadattare questo parametro durante gli esperimenti.Per garantire l'accuratezza del dispositivo di posizionamento, ricordarsi di eseguire regolarmente operazioni di homing. Questo dispositivo di imaging automatizzato può essere facilmente accoppiato con la profilazione del microsensore per una caratterizzazione funzionale dei biofilm. Oct è una tecnica di imaging emergente e prevediamo che il sistema qui presentato stimoli la ricerca sulla struttura del biofilm.Ciò può essere rilevante per tecnologie come il trattamento dell'acqua potabile o il biotrattamento.

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