La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic
1 giugno 2019
Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l'utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.
Il mio laboratorio è interessato alla meccanobiologia, che esamina come le cellule esercitano e sono influenzate dalle forze meccaniche. Un modo per quantificare la meccanobiologia è misurare la contrattilità cellulare. Nelle cellule aderenti, la contrattilità si manifesta nelle forze di trazione esercitate sul substrato cellulare. Quantifichiamo queste forze utilizzando una metodologia generalmente indicata come microscopia a forza di trazione o TFM. E TFM è implementato in un'ampia varietà di metodi diversi, ma un aspetto comune è che è una tecnica di laboratorio piuttosto seriale e lenta fatta tipicamente in un singolo piatto come questo qui. Questo ci limita a valutare una popolazione o una condizione alla volta. In tutta la coltura cellulare è stato migliorato qualche tempo fa, ma creando piatti multiwell e abbiamo pensato, non sarebbe fantastico che potessimo TFM con la stessa maggiore produttività e la stessa efficienza di tempo e reagenti? E questa era la nostra soluzione. Così abbiamo creato un piatto di forza di trazione di 96 pozzi. E sembra molto simile a un piatto convenzionale di coltura tissutale da 96 pozzi, tuttavia con questo piatto possiamo non solo esaminare 96 diverse condizioni di coltura cellulare, ma anche quantificare la loro contrattilità cellulare. Questo presenta una soluzione di produttività molto più elevata rispetto agli approcci a piatto singolo, che ci consente di esaminare diverse condizioni cellulari e risposte contrattili. Durante la metastasi tumorale, le cellule tumorali viaggiano dal loro sito primario ai siti secondari, diffondendo la malattia nel nostro corpo. Questo comportamento metastatico delle cellule tumorali rappresenta il 90% della morte correlata al cancro. Uno dei meccanismi proposti per le cellule tumorali epiteliali per acquisire un fenotipo più migratore e invasivo è la transizione epiteliale-mesenchimale, EMT. Durante l'EMT, diventano più migratori e invasivi, cambiando il loro comportamento fisico. Per comprendere meglio questi cambiamenti nel comportamento fisico, utilizziamo il nostro substrato di silicio morbido per misurare i cambiamenti nella contrattilità delle cellule della ghiandola mammaria del topo con induzione EMT da parte di TGF-In questo studio, abbiamo studiato come diverse concentrazioni e tempi di incubazione del comportamento fisico delle cellule influenzate dal TGF. Il polidimetilsiloxano è una gomma molto conforme con il modulo di Young più basso di circa 0,6 kilopascal. La rigidità di questo materiale può anche essere tonnibile utilizzando diverse concentrazioni di agente di reticello tra cui SYLGARD 184.To misurare le proprietà meccaniche del PDMS usiamo un reometro. Dopo aver miscelato la parte A e la parte B del PDMS, in un rapporto peso uno a uno e aver aggiunto l'agente polimerizzante con la percentuale di peso specificata, caricare il lotto preparato sulla piastra del reometro. Assicurarsi di caricare abbastanza del campione per coprire completamente l'area del mandrino. È importante assicurarsi che il mandrino tocchi completamente il campione senza lasciare spazio libero sul bordo. Qualsiasi campione aggiuntivo deve essere accuratamente tagliato e pulito dalla piastra. Misurare il modulo di stoccaggio finale e la dipendenza dal tempo della viscoelasticità di ciascun campione facendo sweep di tempo e frequenza a un ceppo di taglio oscillatorio dello 0,5%Newsha]Questo grafico è un esempio di test seq del tempo, dopo aver fatto per misurare il comportamento reologico del polidimetilsiloxano con ceppo oscillatorio applicato dello 0,5% e temperatura del 100
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Panoramica
Questo studio presenta un saggio ad alta capacità per la forza di trazione, realizzato con gomma di silicone (PDMS), progettato per indagare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante diversi processi biologici. L'utilità del metodo viene dimostrata mediante la misurazione dell'aumento della contrattilità dipendente dal TGF-β durante la transizione epitelio-mesenchimale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Biomeccanica
- Ingegneria biomedica
Sfondo
- La contrattilità cellulare è fondamentale in diversi processi biologici.
- Comprendere le variazioni della contrattilità può fornire informazioni sui meccanismi delle malattie.
- I metodi tradizionali possono presentare carenze in termini di produttività e sensibilità.
- Il PDMS è un materiale versatile per la creazione di saggi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio ad alto rendimento per misurare la contrattilità cellulare.
- Valutare l'impatto del TGF-β sulla contrattilità durante la transizione epitelio-mesenchimale.
- Fornire un metodo affidabile per lo studio del comportamento cellulare in diverse condizioni.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di un saggio per la misura della forza di trazione utilizzando PDMS.
- Misurazione della contrattilità cellulare in risposta a TGF-β.
- Analisi ad alto rendimento per la valutazione di multipli campioni.
- Valutazione della dinamica della transizione epitelio-mesenchimale.
Risultati principali
- Misurazione riuscita delle variazioni della contrattilità nelle cellule.
- Incrementi dipendenti da TGF-β nella contrattilità dimostrati.
- Validata l'utilità del saggio basato su PDMS.
- Fornite informazioni sulle meccaniche dei processi di transizione cellulare.
Conclusioni
- Il saggio della forza di trazione con PDMS è efficace per lo studio della contrattilità cellulare.
- È stata confermata un'aumentata contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchimale.
- Questo metodo può essere applicato a diverse ricerche biologiche e biomediche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa piattaforma ad alta capacità di microscopia delle forze di trazione consente una valutazione quantitativa della contrattilità cellulare in un formato scalabile, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta. Collegando la transizione epitelio-mesenchimale indotta da TGF-β a modifiche biofisiche misurabili, il metodo fornisce un valore predittivo per la validazione degli obiettivi nella ricerca sulla fibrosi e sulle metastasi. Il sistema basato su PDMS offre riproducibilità e compatibilità con i flussi di lavoro esistenti in piastre multipozzetto, migliorando il riutilizzo aziendale nei percorsi di biologia della scoperta e di sviluppo dei saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi del TGF-β come modulatore della contrattilità cellulare durante l'EMT, supportando il test di ipotesi su potenziali bersagli.
- Valore operativo: Fornisce dati sulla contrattilità dipendenti dalla dose e risolti nel tempo, utili per prioritizzare bersagli meccanicistici nei percorsi della fibrosi e del cancro.
- Valore predittivo: Quantifica fenotipi biofisici associati all'EMT, facilitando la selezione preclinica di bersagli e la riduzione dei rischi nei percorsi molecolari.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative della contrattilità indipendenti dal substrato, per la standardizzazione dei saggi nel campo dello screening meccanobiologico.
- Valore operativo: Compatibile con formati a 96 pozzetti, consentendo lo screening parallelo di librerie di composti o di diverse concentrazioni di citochine.
- Prontezza del saggio: Utilizza substrati in PDMS stabili e inerti con modulo regolabile (0,4–100 kPa) e durata illimitata in magazzino, riducendo la variabilità tra lotti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la dose e la durata del TGF-β all'output contrattile, sostenendo modelli preclinici di EMT allineati ai biomarcatori.
- De-risking Meccanicistico: Permette la valutazione delle variazioni della contrattilità come lettura funzionale in sistemi rilevanti per la malattia, prima della validazione in vivo.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione del progetto correlando l'intervento molecolare alla modulazione del fenotipo biofisico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del target all'identificazione del composto attivo, fornendo letture biofisiche che orientano i processi decisionali nelle fasi iniziali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sugli effetti della segnalazione del TGF-β sulla meccanica cellulare e sulla contrattilità.
- Screening: Permette una quantificazione ad alto rendimento e riproducibile delle forze di trazione in formati multi-well per l'analisi dose-risposta.
- Analisi: Genera parametri di contrattilità (entità e distribuzione della forza) che consentono il confronto tra diverse concentrazioni di TGF-β e tempi di esposizione.
- Ricerca traslazionale: Collega l'induzione in vitro dell'EMT a modifiche biomeccaniche misurabili, sostenendo la rilevanza del modello preclinico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la misurazione delle forze di trazione, applicabile a diversi tipi cellulari e bersagli di meccanobiologia nell'oncologia e nella fibrosi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità nei fenotipi meccanobiologici.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a substrati standardizzati in PDMS e compatibilità con piastre multipozzetto.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo test in parallelo di diverse condizioni e riducendo il consumo di reagenti per ogni punto dati.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione degli obiettivi corretta per il rischio, basandosi su variazioni quantitative della contrattilità durante le transizioni patogeniche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nell'analisi delle immagini di microscopia a forza di trazione (TFM) e nella preparazione dei substrati in PDMS.
- Si basa sulla reometria per la caratterizzazione del substrato e sulla microscopia a fluorescenza per la quantificazione delle forze di trazione.
- Necessita della standardizzazione della densità di semina, della funzionalizzazione del substrato e delle condizioni di acquisizione delle immagini tra diversi pozzetti.
- L'adattamento a diversi tipi cellulari potrebbe richiedere un'ottimizzazione della rigidità del substrato e dei ligandi di adesione.
- I limiti pratici includono l'uniformità dello spessore del substrato e la possibile autofluorescenza del PDMS a determinate lunghezze d'onda.
