La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic
June 1st, 2019
Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l'utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.
Il mio laboratorio è interessato alla meccanobiologia, che esamina come le cellule esercitano e sono influenzate dalle forze meccaniche. Un modo per quantificare la meccanobiologia è misurare la contrattilità cellulare. Nelle cellule aderenti, la contrattilità si manifesta nelle forze di trazione esercitate sul substrato cellulare. Quantifichiamo queste forze utilizzando una metodologia generalmente indicata come microscopia a forza di trazione o TFM. E TFM è implementato in un'ampia varietà di metodi diversi, ma un aspetto comune è che è una tecnica di laboratorio piuttosto seriale e lenta fatta tipicamente in un singolo piatto come questo qui. Questo ci limita a valutare una popolazione o una condizione alla volta. In tutta la coltura cellulare è stato migliorato qualche tempo fa, ma creando piatti multiwell e abbiamo pensato, non sarebbe fantastico che potessimo TFM con la stessa maggiore produttività e la stessa efficienza di tempo e reagenti? E questa era la nostra soluzione. Così abbiamo creato un piatto di forza di trazione di 96 pozzi. E sembra molto simile a un piatto convenzionale di coltura tissutale da 96 pozzi, tuttavia con questo piatto possiamo non solo esaminare 96 diverse condizioni di coltura cellulare, ma anche quantificare la loro contrattilità cellulare. Questo presenta una soluzione di produttività molto più elevata rispetto agli approcci a piatto singolo, che ci consente di esaminare diverse condizioni cellulari e risposte contrattili. Durante la metastasi tumorale, le cellule tumorali viaggiano dal loro sito primario ai siti secondari, diffondendo la malattia nel nostro corpo. Questo comportamento metastatico delle cellule tumorali rappresenta il 90% della morte correlata al cancro. Uno dei meccanismi proposti per le cellule tumorali epiteliali per acquisire un fenotipo più migratore e invasivo è la transizione epiteliale-mesenchimale, EMT. Durante l'EMT, diventano più migratori e invasivi, cambiando il loro comportamento fisico. Per comprendere meglio questi cambiamenti nel comportamento fisico, utilizziamo il nostro substrato di silicio morbido per misurare i cambiamenti nella contrattilità delle cellule della ghiandola mammaria del topo con induzione EMT da parte di TGF-In questo studio, abbiamo studiato come diverse concentrazioni e tempi di incubazione del comportamento fisico delle cellule influenzate dal TGF. Il polidimetilsiloxano è una gomma molto conforme con il modulo di Young più basso di circa 0,6 kilopascal. La rigidità di questo materiale può anche essere tonnibile utilizzando diverse concentrazioni di agente di reticello tra cui SYLGARD 184.To misurare le proprietà meccaniche del PDMS usiamo un reometro. Dopo aver miscelato la parte A e la parte B del PDMS, in un rapporto peso uno a uno e aver aggiunto l'agente polimerizzante con la percentuale di peso specificata, caricare il lotto preparato sulla piastra del reometro. Assicurarsi di caricare abbastanza del campione per coprire completamente l'area del mandrino. È importante assicurarsi che il mandrino tocchi completamente il campione senza lasciare spazio libero sul bordo. Qualsiasi campione aggiuntivo deve essere accuratamente tagliato e pulito dalla piastra. Misurare il modulo di stoccaggio finale e la dipendenza dal tempo della viscoelasticità di ciascun campione facendo sweep di tempo e frequenza a un ceppo di taglio oscillatorio dello 0,5%Newsha]Questo grafico è un esempio di test seq del tempo, dopo aver fatto per misurare il comportamento reologico del polidimetilsiloxano con ceppo oscillatorio applicato dello 0,5% e temperatura del 100
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Panoramica
Questo studio presenta un test di forza di trazione ad alto rendimento fabbricato con gomma siliconica (PDMS), progettato per investigare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi biologici. L'utilità del metodo è dimostrata attraverso la misurazione degli aumenti di contrattilità dipendenti da TGF-β durante la transizione epiteliale-mesenchimale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Biomeccanica
- Ingegneria biomedica
Contesto
- La contrattilità cellulare è cruciale in vari processi biologici.
- Comprendere i cambiamenti di contrattilità può fornire informazioni sulle malattie.
- I metodi tradizionali possono mancare di rendimento e sensibilità.
- Il PDMS è un materiale versatile per creare test.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un test ad alto rendimento per misurare la contrattilità cellulare.
- Valutare l'impatto di TGF-β sulla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchimale.
- Fornire un metodo affidabile per studiare il comportamento cellulare in varie condizioni.
Metodi utilizzati
- Fabbricazione di un test di forza di trazione utilizzando PDMS.
- Misurazione della contrattilità cellulare in risposta a TGF-β.
- Analisi ad alto rendimento per valutare più campioni.
- Valutazione delle dinamiche di transizione epiteliale-mesenchimale.
Risultati principali
- Misura riuscita dei cambiamenti di contrattilità nelle cellule.
- Aumenti dipendenti da TGF-β nella contrattilità dimostrati.
- Validata l'utilità del test basato su PDMS.
- Fornito informazioni sui meccanismi dei processi di transizione cellulare.
Conclusioni
- Il test di forza di trazione PDMS è efficace per studiare la contrattilità cellulare.
- È stata confermata l'aumentata contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchimale.
- Questo metodo può essere applicato a vari studi biologici e biomedici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
