Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Il protocollo presentato faciliterà gli studi sugli effetti trans e multigenerazionali delle proteine che possono esistere a lungo nell'ambiente. Abbiamo utilizzato un nematode free-living con 99.5 come ermafroditi per risparmiare tempo e fatica nello studio degli effetti trans e multigenerazionali. Questa tecnica può essere utilizzata per dimostrare gli impatti a lungo termine dei farmaci finali perché il nematode nel presente protocollo condivide molti meccanismi o percorsi conservativi con l'uomo.

Questo metodo può fornire informazioni sui campi della sintesi farmaceutica e della gestione ambientale perché hanno bisogno di feedback sui potenziali rischi delle sostanze chimiche. Questo metodo può essere applicato alla Daphnia magna con maggiore attenzione alla tossicità acquatica. Anche Drosphila melanogaster per esplorare ulteriormente l'influenza sul genere.

Sarebbe bloccato dall'idea che studiare gli effetti nel corso delle generazioni richiede tempo ed energia. Non aver paura alla prima impressione. Seguire il protocollo ti farà guadagnare un risultato fruttuoso.

Per coltura E.coli, pipetta 200 microlitri dalle sospensioni batteriche in 50 millilitri di mezzo LB in un pallone. Oppure usa un anello inoculante per scegliere una piccola colonia dagli agar NGM e posizionarla nel mezzo LB. Per la coltura C.elegans, al microscopio, contare i nematodi sugli agar NGM impilanti preparati in precedenza.

Quando il numero raggiunge quasi 2.000, utilizzare una punta sterile per tagliare 1/6 dell'agar NGM e trasferirlo su agar NGM appena preparati con prato batterico. Tieni gli agar NGM a testa in giù in un incubatore di 22 gradi Celsius per la cultura successiva. Dopo circa 36 ore, i nematodi diventano gravidi.

Utilizzare due millilitri di acqua sterile per scaricare i nematodi gravidi e le uova di nuova produzione su ciascun agar NGM in tubi di centrifuga sterili. Posizionare i tubi su un rack per 30 minuti per depositare i nematodi, quindi scartare l'85% dei supernatanti pipettando. È molto importante giudicare se i nematodi sono abbastanza gravidi per la sincronizzazione.

In caso contrario, l'operazione di sincronizzazione dell'età sarebbe vana. Mescolare i pellet con sette volumi di soluzione di ipoclorito di sodio e agitare i tubi della centrifuga ogni due minuti per cinque-otto volte per lelyse le larve e i nematodi adulti. Centrifugare i tubi a 700 volte G per tre minuti a 20 gradi Celsius e quindi scartare i supernatanti pipettando.

Sospendere di nuovo i pellet in cinque volumi di acqua sterile per lavare le uova sincronizzate con l'età. Centrifuga a 700 volte G per tre minuti a 20 gradi Celsius. Ripetere il lavaggio con acqua sterile, due volte.

Quindi, aggiungere un volume di acqua sterile nei tubi per sospendere le uova sincronizzate con l'età. Distribuire le sospensioni delle uova pipettando cinquanta micro litri su ogni nuovo agar NGM con prato batterico. Tenere gli agar NGM dall'alto in un incubatore di 20 gradi Celsius per 30 minuti, consentendo all'acqua di evaporare o essere assorbita dal prato batterico.

Quindi, gira gli agar NGM, a testa in giù, per la cultura successiva, e segna il tempo come il tempo delle uova. 36 ore dopo il tempo delle uova, i nematodi raggiungono lo stadio delle larve L3. Utilizzare due millilitri di acqua sterile per scaricare i nematodi da ogni agar NGM in tubi di centrifuga.

Dopo essersi sistemato per 30 minuti, sostituire l'85% dei supernatanti con K Medium per digerire il cibo nelle viscere per due ore. Quindi, scarta i supernatanti. Utilizzare K Medium per regolare le sospensioni del nematode a circa 200 nematodi per 100 microlitri per esperimenti successivi.

Per evitare effetti sui bordi, nella zona centrale di una micropiatta sterile da 96 pozzetti, aggiungere 100 microlitri di soluzioni di controllo preparate o chimiche in 10 pozzi, come si replica in sei gruppi. Aggiungere 100 microlitri del nematode preparato K Medium a ciascuno dei 60 pozzi. Contrassegnare l'ora come T0. Eseguire l'esposizione per 24-96 ore.

Dopo l'esposizione, utilizzare una pipetta per raccogliere i nematodi da cinque pozzi in ogni gruppo, in sei tubi di centrifuga da 1,5 millilitri. Depositare i nematodi per 30 minuti e quindi pipettare per scartare i supernatanti. Lavare i nematodi sul fondo con un millilitro di acqua sterilizzata.

Sistemare i nematodi per 30 minuti. Scartare i supernatanti e utilizzare i nematodi nella parte inferiore per le misurazioni degli indicatori della generazione padre esposta, contrassegnati come F0. Raccogli i nematodi dai restanti cinque pozzi in ogni gruppo. Sistemare e lavare i nematodi come in precedenza.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di acqua sterile per sospendere di nuovo i nematodi in ogni tubo e trasferire le sospensioni nematode uniformemente su tre agar NGM appena preparati con prato batterico. Incubare i nematodi per 36 ore per gravidi ed eseguire la sincronizzazione dell'età, come in precedenza. Dopo aver incubato le uova sincronizzate sugli agar NGM con prato batterico per 36 ore, sciacquare i nematodi in sei tubi di centrifuga.

Dopo la sedimentazione e il lavaggio con un millilitro di acqua sterilizzata, utilizzare i nematodi nella parte inferiore per misurazioni indicatori della generazione di prole contrassegnate come T1. Mescolare 99 millilitri degli agar NGM caldi con un millilitro di controllo o soluzioni chimiche. Dopo aver preparato gli agar con sospensioni batteriche secondo il manoscritto, nell'armadio di biosicurezza, mettere da parte i coperchi superiori delle piastre di Petri ed esporre il prato batterico alla luce UV per 15 minuti. Pipettare le uova sincronizzate con l'età sugli agar trattati con UV.

Contrassegnare l'inizio dell'esposizione alla generazione padre, F0, come giorno zero. Incubare gli agar per tre giorni a 20 gradi Celsius. Quindi, utilizzare i nematodi maturi per misurare gli effetti in F0. Inoltre, il terzo giorno, utilizzare un'asta di vetro dotata di un filo di fibra prodotto dall'uomo piegato in un anello per raccogliere nematodi maturi F0 e scivolare sulla superficie di nuovi agar NGM trattati con UV.

Il quarto giorno, scegli e scarta i nematodi F0 maturi dagli agar NGM. Il sesto giorno, utilizzare i nematodi maturi F1 che hanno sperimentato l'esposizione per tre giorni per la misurazione degli indici. In questo protocollo, gli effetti transgenerazionali di cadmio, rame, piombo e zinco sulla frequenza di piegatura del corpo hanno mostrato che le inibizioni nel genitore nematode, F0, dopo l'esposizione prenatale erano inferiori a quelle della loro progenie, T1. Gli effetti residui multigenerazionali del sulfamethoxazolo sulla durata e sulla riproduzione del nematode hanno mostrato che la riproduzione è stata significativamente influenzata dall'esposizione alla linea germinale e le tossicità sono persistete nelle generazioni non esposte dalle generazioni T3 a T6.

L'esposizione multigenerazionale e gli effetti residui multigenerazionali del lindano sugli indici biochimici e genetici del nematode hanno mostrato effetti obesogenici con disturbi nella regolazione del segnale di insulina. Inoltre, i cambiamenti tra la segnalazione sgk-1 e akt-1 indicavano che i nematodi di diverse generazioni di esposizione mostravano diverse strategie di risposta per la tolleranza e l'evitamento. Controllare lo stato di vita dei nematodi prima di ogni operazione e modificare di conseguenza i seguenti passaggi.

Altri effetti, ad esempio gli effetti obesogenici delle sostanze chimiche, possono essere inclusi per rispondere ulteriormente alla crescente prevalenza dell'obesità nel corso delle generazioni. Sulla base del metodo, è possibile esplorare ulteriori meccanismi. Ad esempio, i segnali epigenetici ereditari tra generazioni.

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