Name: Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dallepatocito del cancro epatocellulare in aumento nellimpostazione dellinfiammazione epatica e della fibrosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Scopri un modello ortotopico murino di carcinoma epatocellulare che replica le caratteristiche immunitarie umane. Questo metodo facilita lo studio dell'immunotolleranza tumorale e delle risposte al trattamento.

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Questo lavoro è supportato da NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) e NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

NOTA: Tutta la procedura, inclusi i soggetti animali, è stata approvata dall'IACUC presso l'Università del Missouri. Tutti i topi hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio". La seguente procedura per l'isolamento cellulare e l'inoculazione deve essere eseguita in un cofano. Tutti gli esecutori devono indossare l'attrezzatura protettiva personale standard per la manipolazione dei topi e dei tessuti.
1. Induzione di fibrosi e cirrosi del fegato con iniezione IP di tetracloruro di carbonio (CCl4)
NOTA: vedere la figura 1. (CCl4 è reagente altamente pericoloso, deve essere maneggiato con attenzione e indossando guanti resistenti alle sostanze chimiche)
<ol><li>Ottenere topi maschi C57BL/6J di età di sei-otto settimane (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare la soluzione 10% CCl4 (v/v) nell'olio di mais in un tubo di centrifuga. Determinare il volume totale in base al numero di mouse da inimettere (vedere il passaggio 1.6).</li>
	<li>Utilizzare la tecnica di manipolazione dei mouse appropriata per selezionare un mouse per l'iniezione.</li>
	<li>Trattenere manualmente il mouse con il suo lato dorsale (addome) verso l'alto.</li>
	<li>Pulire il sito di iniezione sulla parete addominale del topo strofinando con 70% alcol.</li>
	<li>Iniettare i topi maschi C57BL/6J con 160 gradi l di 10% soluzione CCl4 mediante iniezione intraperitoneale (IP) utilizzando un ago monouso da 25 calibro.</li>
	<li>Assicurarsi che l'ago penetri appena attraverso la parete addominale (circa 4-5 mm) con smusso rivolto verso l'alto e leggermente angolato a 15-20 gradi.</li>
	<li>Iniettare i topi due volte a settimana per un totale di quattro settimane-ogni topo riceverà un totale di otto iniezioni. NOTA: Due settimane dopo l'ultima iniezione, i topi trattati sono pronti per l'inoculazione ISPL di epatociti oncogeni da topi MTD2.</li>
</ol>2. Isolamento degli epaticiti tag transgenici dai topi Line MTD2
NOTA: vedere la Tabella 1 per le ricette della soluzione.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x Soluzione di sale bilanciato di Earle senza Ca o Mg (EBSS senza Ca o Mg)</td>
			<td>4 g di KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 H2o 10 g di destrosio Aggiungere acqua a 1 litro, pH a 4,32 Filtro passa attraverso</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione 1</td>
			<td>20 mL 10x EBSS senza Ca o Mg 44 g di NaHCO3 1,33 mL 1,5M Di hepes 10 mL da 10 mL EGTA Aggiungere acqua a 200 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione 2</td>
			<td>100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Aggiungere acqua a 1 litro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di collagenasi dello 0,75%</td>
			<td>15 mg di collagenasi tipo 1 20 mL della soluzione 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezzo completo</td>
			<td>2 giri al rin 50 mL FBS 5 mL 100x Penicillina-Streptomicina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette di soluzione.
<ol><li>Ottenere la linea MTD2 topi38 per servire come fonte di epatociti oncogenici.</li>
	<li>Anestesizzai i topi MTD2 di 5 settimane usando il 2,5% di isoflurane. NOTA: l'anestesizzazione corretta verrà controllata con il metodo del pizzico dei dipighi. In breve, con due dita, dare il topo del mouse / piede una buona stretta. Se non c'è una reazione di astinenza, l'animale viene giudicato abbastanza profondo da iniziare l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Quando adeguatamente sedati, posizionare i topi in una posizione supina e fissare le estremità con nastro adesivo per fornire un'adeguata esposizione della superficie addominale.</li>
	<li>Eseguire un'incisione laparotomia mediana utilizzando forbici lungo la lunghezza della linea alba abbastanza grande da fornire un'adeguata esposizione del fegato.</li>
	<li>Sposizionare l'intestino a sinistra per fornire una migliore esposizione del fegato e triade portale.</li>
	<li>Dissezitto sopra il fegato per esporre la vena cava inferiore (IVC).</li>
	<li>Ligate l'IVC sopra il fegato utilizzando un morsetto dell'arteria.</li>
	<li>Tornando al bordo inferiore del fegato, utilizzare un ago farfalla (vedi materiali) per ottenere l'accesso IV alla vena del portale. Fissare il catetere a mano.</li>
	<li>Successivamente perfondere il fegato del topo utilizzando una siringa di iniezione a 8,9 mL/min con 15 mL di soluzione 1, 15 mL di 0.75% soluzione collagenasi 2, e 15 mL di soluzione 2 tramite il catetere.</li>
	<li>Raccogliere il fegato perfuso tagliando e prendendo la massa tumorale dai topi MTD2 in un tubo conico 50 mL con 10-15 mL di PBS.</li>
	<li>Rimuovere PBS e lavare un tempo aggiuntivo con PBS; non centrifugare in questo passaggio.</li>
	<li>Tagliare il fegato in pezzi più piccoli utilizzando le forbici e poi lavare di nuovo con PBS 2x per rimuovere il sangue rimanente.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di mezzo RPMI completo al tubo conico e tritare continuamente il fegato con le forbici a piccoli pezzi (<3 mm) tessuto dovrebbe passare senza intoppi attraverso una pipetta 5 mL.</li>
	<li>Aggiungere l'RPMI completo a un volume finale di 30 mL e sospendere il fegato utilizzando una pipetta da 5 mL.</li>
	<li>Filtrare la soluzione mista con un colino da 70 m in un tubo conico da 50 ml.</li>
	<li>Lavare il colino più volte con RPMI completo e regolare il volume finale a 50 mL aggiungendo ulteriore supporto RPMI.</li>
	<li>Ruotare rapidamente la sospensione con una centrifuga fino a un massimo di 500 giri/min; una volta che la velocità è accelerata a 50 x g, la centrifuga deve essere fermata.</li>
	<li>Decant il supernatante e sospendere pellet in 20 mL di PBS.</li>
	<li>Contare le cellule utilizzando l'esclusione blu Trypan e un emocitometro, quindi regolare la concentrazione cellulare a 2,5 x 106/mL per la seguente inoculazione cellulare. NOTA: Il rendimento previsto da 5 grammi di tessuto tumorale è 80 milioni di epatociti con vitalità >95%.</li>
</ol>3. Inoculare gli epatociti dai topi MTD2 al fegato di topi selvatici C57BL/6J mediante iniezione ISPL
<ol><li>La tecnica asettica deve essere utilizzata in tutte le procedure</li>
	<li>Anestesizzare i topi maschi CCl4trattati C57BL/6J con 2,5% isoflurane, i topi devono essere trattati con lubrificante oculare per evitare che gli occhi si asciughino.</li>
	<li>Preparare le siringhe con 200 o più l of epatociti per l'iniezione.</li>
	<li>Quando adeguatamente sedati, posizionare i topi con il lato sinistro verso l'alto.</li>
	<li>Rasare l'intero fianco sinistro dei topi, quindi strofinare l'area, alternando tra 70% alcol e betadine tre volte.</li>
	<li>Somministrare 5 mg/kg di carprofen sottocutaneamente prima dell'incisione chirurgica.</li>
	<li>Fai un'incisione di 1 cm sul fianco sinistro parallela alla costola 13dall'estremo dorsale che inizia appena sotto il muscolo della colonna vertebrale.</li>
	<li>Identificare la milza, quindi esternarla con pinze a punta smussata.</li>
	<li>Ritagliare la milza con due clip in titanio di medie dimensioni. Posizionare entrambe le clip tra l'arteria splenica e la vena, lasciare spazio tra le clip per tagliare in seguito dopo l'inoculazione. NOTA: L'obiettivo è quello di isolare il polo inferiore della milza per ridurre il rischio di semina.</li>
	<li>Iniettare 200 l (0,5 milioni) degli epatociti preparati nel polo inferiore della milza utilizzando un ago da 27 G.</li>
	<li>Ritagliare il ramo inferiore del pedicolo (vasi a palo splenico inferiori) con una clip di medie dimensioni.</li>
	<li>Tagliare la milza tra le due clip posizionate inizialmente.</li>
	<li>Rimuovere il polo inferiore della milza che è stato iniettato direttamente con cellule tumorali.</li>
	<li>Utilizzare 3-0 polyglactin 910 interrotto sutura per chiudere lo strato muscolare interno.</li>
	<li>Utilizzare clip di ferita d'acciaio sterilizzato per chiudere lo strato cutaneo esterno. NOTA: Le clip in acciaio sono preferite rispetto alle suture per evitare che gli animali mastichino le suture, lasciando una ferita spalancata.</li>
	<li>Somministrare 5 mg/kg di carprofen subcutaneo dopo la sutura.</li>
	<li>Posizionare tutti gli animali che recuperano su un cuscinetto di riscaldamento a temperatura controllata e monitorare attentamente fino a completa ripresa dall'anestesia.</li>
	<li>Dare ai topi libero accesso all'acqua dopo l'intervento chirurgico. Se il topo si disidrata durante l'intervento chirurgico, somministrare i fluidi sottocutanei (<1 mL).</li>
	<li>Rimuovere le clip della pelle a 7-10 giorni post-operatori.</li>
</ol>

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<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

Non ce ne sono da dichiarare.

Con questo protocollo, abbiamo stabilito un modello murino affidabile e riproducibile di HCC che imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC. Clinicamente, molti fattori di rischio successivamente inducono lesioni epatiche, fibrosi epatica, cirrosi e la fase finale di HCC. Nel nostro protocollo, l'iniezione IP di CCl4 viene utilizzata per produrre prima fibrosi epatica in topi selvatici, che consente ai successivi epatociti oncogeni di formare i tumori nell'impostazione della fibrosi epatica. Abbiamo scope...

Il cancro epatocellulare (HCC) è il tipo di cancro in più rapido aumento negli Stati Uniti (USA)1,2,3. Ogni anno, circa 850.000 nuovi casi vengono diagnosticati4,5 e 700.000 pazienti muoiono per questa malattia letale6,7,8,9,10 , rendendola la seconda causa più alta di morte legata al cancro al mondo. La gestione dell'HCC comprende resezione chirurgica, trapianto, ablazione, chemioembolizzazione, o terapie sistemiche, come sorafenib11. La diagnosi precoce e la gestione con resezione chirurgica o trapianto hanno il più alto beneficio di sopravvivenza complessiva4. Purtroppo, la maggior parte dei pazienti presentano in una fase successiva e richiedono la gestione con ablazione, chemioembolizzazione o sorafenib12. Sorafenib, un inibitore della chinasi recettore (RTKI), è stato approvato dalla Food and Drug Administration nel 2008 come l'unica terapia farmacologica sistemica disponibile per il trattamento di HCC non aggiornabile. Anche se il farmaco fornisce solo un modesto aumento della sopravvivenza complessiva, da 7,9 a 10,7 mesi13, ha fornito una nuova strategia terapeutica che potrebbe essere utilizzata per gestire l'HCC.
La manipolazione del sistema immunitario per eliminare i tumori stabiliti è un settore in rapida crescita nella ricerca sul cancro14. Gli studi sui checkpoint immunitari hanno notevolmente avanzato lo sviluppo di farmaci immunoterapeutici nel trattamento del cancro15,16. La FDA ha approvato l'uso di anticorpi (Abs) contro l'antigene citotossico T-linfocito 4 (CTLA-4), la proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1), e la sua PD-L1 legante per il trattamento del melanoma, del cancro ai polmoni, al cancro della testa e del collo e cancro alla vescica17, 18 mi lato , 19 del 12 , 20.Le sperimentazioni cliniche di monoterapia o terapia combinata utilizzando uno o più anticorpi contro PD-1, PD-L1 o CTLA-4 per il trattamento di HCC avanzato sono in corso21,22,23e alcuni hanno mostrato risultati favorevoli. Nel 2017, la FDA ha concesso l'approvazione accelerata per gli anticorpi anti-PD-1 per il trattamento dei pazienti HCC, che sono resistenza allo sorafenib, ma il tasso di risposta complessivo di questa terapia è solo del 14,3%. Altre strategie non sono state tradotte in pratica clinica in questo momento24,25. Superare la tolleranza immunitaria profonda indotta dal tumore per migliorare la terapia del checkpoint immunitario26; prevedere l'efficacia della terapia con checkpoint immunitario; prevenire eventi avversi legati al sistema immunitario; ottimizzazione del percorso amministrativo, del dosaggio e della frequenza; e trovare combinazioni efficaci di terapie27,28,29 tutti rimangono compiti estremamente impegnativi.
Ci sono diversi approcci convenzionali utilizzati per indurre HCC nei modelli murini attualmente e sono utilizzati a seconda della particolare domanda di ricerca dello sperimentatore30. I modelli murini HCC indotti chimicamente con composti genotossici imitano la malignità indotta da lesioni. I modelli di Xenotrapianto attraverso l'impianto ectopico o ortotopico delle linee cellulari HCC sono adatti per lo screening farmacologico. Un certo numero di topi geneticamente modificati sono stati progettati per studiare la fisiofisiologia dell'HCC. I topi transgenici che esprimono geni virali, oncogeni e/o fattori di crescita consentono l'identificazione delle vie coinvolte nell'epatocarcinogenesi. A causa di limitazioni intrinseche, questi modelli non riassumono le caratteristiche immunitarie tipiche osservate nell'HCC umano, il che ha ostacolato significativamente la chiarificazione dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative14 ,15. Recentemente abbiamo creato un modello murino clinicamente rilevante. Questo nuovo modello non solo imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC, ma riflette anche le caratteristiche più tipiche della malattia umana, inclusa la disfunzione immunitaria. Abbiamo caratterizzato le sue caratteristiche biologiche e immunologiche. Sfruttando questo nuovo modello, abbiamo esplorato varie strategie immunoterapeutiche per trattare HCC31,32,33,34,35,36, 37. Questa piattaforma unica ci permette di studiare i meccanismi dell'immunotolleranza indotta dal tumore e di sviluppare strategie terapeutiche proof-of-concept per l'HCC verso un'eventuale traduzione clinica.

<table><tbody><tr><td>Macchina per anestesia</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>macchina per anestesia per chirurgia</td></tr><tr><td>Ago a farfalla</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Ago utilizzato per la perfusione epatica</td></tr><tr><td>C57BL / 6 topi</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Topi utilizzati nel prototolo</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>carprofene per il rilascio del dolore</td></tr><tr><td>Cell Strainer&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Filtro cellulare, 70&micro; m, per isolamento di epatociti</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>centrifuga per isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Clips&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Clip in Titanio per</td></tr><tr><td>Microscopio Milza</td><td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>Microscopio per osservazione cellulare</td></tr><tr><td>Topi Mtd2</td><td>N/A</td><td></td><td>Dono del Dr. William A Tenuto presso il Roswell Park Cancer Institute nel 2002, mantenuto nel nostro laboratorio</td></tr><tr><td>Ago</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>Ago BD precisionglide, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>sutura VICRYL rivestita</td></tr><tr><td>SV40 T Ag anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anti-SV40 Anti-antigene T per siringa IHC</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>REF 309626</td><td>Siringa TB da 1 mL per iniezione cellulare</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Soluzione di trypan blue per test di vitalità cellulare</td></tr><tr><td>Clip per ferite</td><td>Reflex</td><td>reflex9, Part. No. 201-1000</td><td>clip per ferite in acciaio inox per chiusura della ferita</td></tr></tbody></table>

un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

L'assenza di un modello animale clinicamente rilevante che affronti le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC) ha ostacolato significativamente la chiarimento dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative. Per sviluppare un modello animale ideale che riassume l'HCC umano, i topi maschi immunocompetenti C57BL/6J ricevono prima un'iniezione di tetracloruro di carbonio (CCl4)per indurre la fibrosi epatica, quindi ricevono epatociti oncogenici istogenici-normali dal giovane maschio L'antigene SV40 T (TAg)-mice transgenico (MTD2) per inoculazione intrasplenica (ISPL). Androgeno generato in topi maschi destinataria alla pubertà avvia l'espressione TAg sotto il controllo di un promotore specifico del fegato. Di conseguenza, gli epatociti trasferiti diventano cellule tumorali e formano masse tumorali nell'impostazione della fibrosi epatica/cirrosi. Questo nuovo modello imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC nel contesto della fibrosi/cirrosi epatica e riflette le caratteristiche più tipiche dell'HCC umano, inclusa la disfunzione immunitaria.

Gli epatociti oncogeni isolati dai topi transgenici TAg (Figura 2) sono stati seminati nel fegato di topi selvatici mediante iniezione intrasplenica (Figura 3). Gli epatociti trapiantati con successo e in modo affidabile sono cresciuti con successo e in modo affidabile tumori HCC ortotopici (Figura 4) con antigene tumorale specifico SV40 TAg (Figura 5) nell'impostazione di infiammazione epatica e fibrosi ( Figura1).
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Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello murino clinicamente rilevante del cancro al fegato che riassume le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC).

Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

L'uso di un solo modello per sviluppare un modello di massa tumorale epatocellulare potrebbe aiutare le persone a chiarire la loro immunotoleranza indotta dal tumore e specifiche immunorisomie tumorali indotte dal trattamento. Il tumore ortotopico che si sviluppa con la tecnica della fibrosi epatica imita le caratteristiche cliniche del cancro al fegato umano. Questo metodo potrebbe fornire uno strumento utile nello studio immunologico del cancro epatocellulare.La dimostrazione visiva di questo metodo può illustrare i passaggi tecnicamente più impegnativi, ad esempio l'iniezione intrasplenica, essenziali per un'esecuzione corretta di questo protocollo. Successivamente, trattenere manualmente un maschio, da sei a otto settimane C57 nero 6 mouse dorsale lato verso l'alto. Utilizzare scrub alternativi al 70% di etanolo e betadine per pulire il sito di iniezione tre volte.Quindi consegnare 160 microlitri di tetracloruro di carbonio al topo mediante iniezione intraperitoneale e riportare l'animale nella sua gabbia di casa. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, in un topo transgenico antigene simian 40 T di cinque mesi, posizionare il mouse in posizione supina e fissare gli arti con del nastro adesivo. Fare un'incisione di laparotomia mediana lungo la lunghezza della linea alba, abbastanza grande da fornire un'adeguata esposizione del fegato, e spostare l'intestino a sinistra.Sezionare sopra il fegato per esposizione la vena cava inferiore. Indurre un morsetto dell'arteria per ligare il vaso. Utilizzare un ago a farfalla per ottenere l'accesso endovenoso alla vena del portale e fissare manualmente il catetere.Cambiando con cura le siringhe per ogni soluzione, fornire con successo 15 millilitri di soluzione uno, 15 millilitri di soluzione di collagenasi 0,75% due e 15 millilitri di soluzione due senza collagenasi tramite catetere, a una portata approssimativa di 8,9 millilitri di soluzione al minuto. Alla fine della perfusione, raccogliere la massa tumorale in un tubo conico da 50 millilitri contenente da 10 a 15 millilitri di PBS. Asporta il tumore dal prossimo topo MTD2 come appena dimostrato.Usa le forbici per tagliare i fegati a pezzi più piccoli. Trasferire i tessuti in un nuovo contenitore di PBS fresco per rimuovere il resto del sangue dal tessuto prima di trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo RPMI completo. Tritare i campioni di fegato lavati fino a quando i pezzi possono adattarsi facilmente attraverso la punta di una pipetta da cinque millilitri.Aggiungere abbastanza mezzo al tubo per raggiungere un volume finale di 30 millilitri. Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per triturare i frammenti di tessuto, prima di filtrare la soluzione attraverso un colino di 70 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare il colino più volte con mezzo completo.Regolare il volume finale a 50 millilitri con un mezzo completo aggiuntivo. Ruotare rapidamente la sospensione per centrifugazione fino a un massimo di 50 volte g prima di fermare la centrifuga e decantare il supernatante. Quindi rimospensi il pellet in 20 millilitri di PBS per il conteggio.Per l'iniezione intrasplenica degli epatociti MTD2, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 per ogni animale ricevente con 220 microlitri di epatociti per topo. Confermare la mancanza di risposta al pizzico in un animale anestetizzato trattato con tetracloruro di carbonio. Iniziando appena sotto il muscolo della colonna vertebrale, quindi, fai un'incisione di un centimetro sul fianco sinistro parallela alla tredicesima costola dall'estremo dorsale e usa le forcep con punte smussate per esternarizzare la milza.Ritagliare la milza con due clip in titanio di medie dimensioni tra l'arteria e la vena splenica e fornire 200 microlitri di cellule nel polo inferiore della milza. Ritagliare il ramo inferiore del pedicolo con una clip di medie dimensioni e tagliare la milza tra le due clip inizialmente posizionate. Rimuovere il polo inferiore della milza che è stata iniettata direttamente con cellule tumorali e utilizzare 3-0 poliglactina 910 interrotta suturando per chiudere lo strato muscolare interno.Quindi utilizzare clip sterilizzate per ferite in acciaio per chiudere lo strato esterno della pelle e somministrare per via sottocutanea cinque milligrammi per chilogrammo di carprofene. Dopo l'isolamento dai topi transgenici dell'antigene T come dimostrato, si possono osservare sia epatociti che cellule infiltrazioni tumorali. Le celle in genere dimostrano una vitalità di quasi il 100% dopo l'elaborazione.Dopo l'inoculazione intrasplenica in animali trattati con tetracloruro di carbonio di tipo selvatico, gli epatociti trapiantati crescono con successo e in modo affidabile tumori del carcinoma epatocellulare ortotopico che esprimono l'antigene simian 40 T specifico del tumore. La preparazione della nostra popolazione vitale e pura di epatociti dalla massa MTD2 e la somministrazione accurata dell'iniezione intrasplenica sono importanti per il successo della procedura. Sebbene il nostro team abbia testato l'inoculazione di epatociti nei topi ricevente tramite iniezione intravascolare e intraperitoneale, questi altri metodi non sono stati in grado di indurre carcinoma epatocellulare ortotopico.Questo modello fornisce una piattaforma unica che consente l'indagine per la sorveglianza immunitaria e la tolleranza nelle sue fasi iniziali e successive della progressione tumorale. Si prega di fare attenzione quando si utilizza il tetracloruro di carbonio, in quanto è tossico.

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Infezione di topi con uno Adenovirus che esprime il autoantigene maggiore umano citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) riconosciuti da sieri di pazienti affetti da di tipo 2 risultati epatite autoimmune in una forma persistente di autoimmune-mediata malattia epatica caratterizzata da estensiva epatite, fibrosi e la generazione di uno CYP2D6 -specifica risposta immunitaria.

Il CYP2D6 modello animale: come indurre epatite autoimmune in topi

Xenotrapianti tumorali umani in topi immunodeficienti sono strumenti preziosi per studiare biologia del cancro. Sono descritti i protocolli specifici per generare xenotrapianti sottocutanei e intraepatiche da cellule di carcinoma epatocellulare umani o frammenti di tumore. Rigenerazione epatica indotta da epatectomia parziale in topi riceventi si presenta come una strategia per facilitare l'attecchimento intraepatica.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

L'interruzione del flusso biliare provoca un grave danno epatico colestatico infiammatorio con una caratteristica sequenza di alterazioni morfologiche tempo-dipendenti. Qui presentiamo un protocollo per la legatura chirurgica del dotto biliare comune nei topi che permette di indurre una forte risposta fibrotica dopo 21-28 giorni.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

La diffusione metastatica del cancro è la principale causa di decessi correlati al cancro. Forniamo una descrizione approfondita della nostra metodologia chirurgia sopravvivenza per stabilire un modello di sistema ortotopico singenici mouse "paziente-tipo" per lo studio dei meccanismi di metastatizzazione dei tumori di organi solidi.

A &quot;paziente-Like&quot; ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per stabilire topi umanizzati sia con il sistema immunitario umano che con le cellule epatiche. I topi immunodeficienti contemporanei ricostituiti ottenuti tramite iniezione intrasplessica di epotociti umani e CD34- cellule staminali ematopoietiche sono suscettibili di infezione da virus immunodeficienza umana-1 e ricapitolano i danni al fegato osservati pazienti affetti da HIV.

Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV

Questo protocollo presenta un modello biomimetico 3D con compartimento stromale fibrotico di accompagnamento. Preparato con idrogel fisiologicamente rilevanti in rapporti che imitano le proprietà bio-fisiche della matrice extracellulare stromale, mediatore attivo delle interazioni cellulari, della crescita tumorale e della metastasi.

Un modello biomimetico per il cancro al fegato per studiare le interazioni tumore-stroma in un ambiente 3D con proprietà bio-fisiche tonnibili

L'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC) genera metastasi epatiche ricche di stroma. Questo modello murino di metastasi epatiche CRC rappresenta uno strumento utile per studiare le interazioni tumore-stroma e sviluppare nuove terapie dirette dallo stroma come le terapie geniche mediate da virus adeno-associate.

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Qui, presentiamo un protocollo per creare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare ortotopico con e senza legatura dell'arteria epatica ed eseguire la tomografia ad emissione di positroni (PET) non invasiva dell'ipossia tumorale utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG).

Imaging PET/RM non invasivo in un modello murino ortotopico di carcinoma epatocellulare

Gli organoidi generati dai tumori dei pazienti vengono iniettati ortotopicamente nel fegato del topo. La resezione del tessuto epatico non tumorale porta a un ambiente rigenerativo nel tessuto epatico in cui si trova il tumore.

Un modello di xenotrapianto di organoidi derivato da pazienti con carcinoma epatocellulare per studiare l'impatto della rigenerazione epatica sulla crescita del tumore

Il modello murino di epatectomia parziale 2/3 (66%) è ben descritto in letteratura, ma sono state raramente utilizzate epatectomie più estese che imitano la sindrome di piccole dimensioni dopo trapianto di fegato. Descriviamo una procedura di epatectomia estesa al 78% in un modello murino che si traduce in circa il 50% di letalità postoperatoria nei topi sani.

Epatectomia estesa al 78% in un modello chirurgico murino

Questo protocollo presenta una pipeline di imaging completa per visualizzare e modellare la morfologia delle cellule stellate epatiche nel tessuto epatico intatto. Questo approccio combina la marcatura fluorescente dei fibroblasti tramite genetica del topo, la preparazione tissutale in situ basata su perfusione epatica e un metodo modificato di pulizia dei tessuti iDISCO per ottenere trasparenza ottica.

Mappatura della morfologia delle cellule stellate epatiche nei modelli murini di fibrosi epatica

Scopri un modello ortotopico murino di carcinoma epatocellulare che replica le caratteristiche immunitarie umane. Questo metodo facilita lo studio dell'immunotolleranza tumorale e delle risposte al trattamento.

Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dallepatocito del cancro epatocellulare in aumento nellimpostazione dellinfiammazione epatica e della fibrosi (Video) | JoVE Journal

Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

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