Name: Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Impara a eseguire l'imaging confocal live dei meristemi apicali di Arabidopsis, pomodoro e soia. Questo protocollo efficiente consente la visualizzazione cellulare ad alta risoluzione senza fissazione o sezionamento del tessuto.

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Gli autori riconoscono Purdue Bindley Bioscience centro Imaging Facility per accedere al microscopio confocale a scansione laser e per il supporto tecnico, e gli autori apprezzano l'aiuto da Andy Schaber nella Purdue Bindley Imaging struttura. Questa attività è stata finanziata dalla Purdue University come parte di crocevia di AgSEED fondi per sostenere l'agricoltura e lo sviluppo rurale dell'Indiana.

1. preparazione di piatti Media e imaging
<ol><li>MS Piastre: aggiungere 0,5 x Murashige & Skoog MS medi, 1% agar in acqua deionizzata e poi regolare il pH a 5,8 utilizzando la soluzione di idrossido di potassio (facoltativo: aggiungere 1% di saccarosio per la coltivazione di piante a lungo termine). Piastre di autoclave e versare.</li>
	<li>Piatti di imaging: riempire di plastica di Petri (6 cm di larghezza, profondità 1,5 cm) a 0,5-0,8 cm con 1,5% di agarosio fuso.</li>
</ol>2. pianta crescita
<ol><li>
Crescita di Arabidopsis<ol>
<li>Seminare i semi sterilizzati sulle piastre di MS e posizionare le piastre inferiori a 4 ° C per due giorni. Quindi, spostare MS Piastre un giorno breve (8 h luce / 16h scuro), a 22 ° C per due settimane.</li>
		<li>Trapiantare le piantine al suolo e farli crescere in una giornata breve (8 h luce / 16h scuro) a 22 ° C per quattro settimane.</li>
		<li>Trasferire gli impianti a luce continua, a 22 ° C per indurre la transizione dalla vegetativa alla fase riproduttiva e per l'infiorescenza SAMs di imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescita del pomodoro e della soia<ol>
<li>Incubare i semi coperti con carta da filtro bagnata sotto 28 ° C, finche ' non germinano.</li>
		<li>Trapiantare le piantine al suolo e farli crescere in una lunga giornata (16 h luce / buio 8h) a 25 ° C per una settimana o più per il SAMs vegetativo di imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dissezione dell'apice del germoglio
<ol><li>Dissezione dell'apice sparare infiorescenza<ol>
<li>Tagliare l'apice di sparare infiorescenza insieme con il gambo principale 1-2 cm dalle piante di Arabidopsis imbullonate con una lama di rasoio. Tenere la parte basale del fusto principale e togliere come molti più vecchi organi di fiore come possibile dal gambo principale dissecando fuori i peduncoli con il forcipe di gioielli. Attenzione: Evitare le dita di taglio quando si utilizza una lama di rasoio. Smaltire l'usate lame di rasoio per una corretta dei taglienti.</li>
		<li>Tenere il gambo allegato dell'apex sparare con gioielli forcipe o le dita nel campo dello stereomicroscopio, continuare a rimuovere il resto dei fiori fino a quasi l'intera SAM può essere vista dagli oculari. Rimuovere i peduncoli chiaramente alla giunzione del gambo principale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissezione dell'apice vegetativo sparare<ol>
<li>Per visualizzare il SAMs vegetativo da pomodoro o soia, sezionare i cotiledoni, foglie e radici delle piante.</li>
		<li>Tenere gli ipocotili delle piante sotto lo stereomicroscopio e sezionare ulteriormente i primordi fogliari che copre il SAMs vegetativo utilizzando pinze gioielli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. colorazione
<ol><li>Per visualizzare direttamente le cellule in SAMs, usare preparate propidio ioduro (PI) soluzione per macchiare le pareti cellulari. Sciogliere la polvere di PI in acqua deionizzata sterile, fare soluzione colorante 1mL PI alla concentrazione di 1 mg/mL e conservare la soluzione PI in tubo del microcentrifuge coperto con carta stagnola.</li>
	<li>Pipettare 50 µ l di soluzione di PI in un ambiente pulito e Petri vuota e tuffo tutta dissecato sparare apice in tintura per 2 min risciacquo all'apice macchiato sparare due volte in acqua deionizzata sterile. Durante il processo di colorazione, immergere l'infiorescenza intero SAM o SAM vegetativa nella soluzione PI per ottenere la colorazione uniforme.</li>
</ol>5. immagine collezione
Nota: per questo metodo, tutti i Sam sono Imaging utilizzando un microscopio confocale in posizione verticale e con un 20x lente di immersione in acqua. Come descritto in altri protocolli9,12,13,15, è anche possibile immagine SAMs utilizzando un microscopio invertito. Inoltre, l'imaging diretta può avvenire utilizzando diverse marche di microscopi confocali, con la stessa procedura di preparazione del campione. In questo studio, la procedura di imaging è descritti in dettaglio come un esempio.
<ol><li>Perforare un foro al centro di un piatto di imaging utilizzando forcipe e bastone l'apice di sparare macchiato in posizione verticale nel mezzo.</li>
	<li>Riempire il piatto imaging con acqua deionizzata sterile per immergere completamente il campione. Osservazione dal microscopio stereo, pipetta su e giù per rimuovere le bolle d'aria intrappolate intorno il meristema. Quindi, regolare l'angolo del tronco in agar per assicurarsi che il SAM è completamente visibile dalla direttamente sopra.</li>
	<li>Mettere il piatto imaging sul palco campione del microscopio confocale. Acqua-immersione lente di abbassare e alzare il tavolino del microscopio campione per lasciare che la punta della lente tuffo in acqua.</li>
	<li>Aprire il software di microscopio confocale e localizzare il SAM il campo chiaro in oculari. Spostare il SAM campione a destra sotto la lente dell'obiettivo attraverso la regolazione del controller XY, quindi concentrarsi su SAM da oculari attraverso la regolazione con cautela il controller Z.</li>
	<li>Azionare la funzione di acquisizione del software microscopio confocale (Vedi Tabella materiali), avviare la modalità Live per visualizzare l'esempio dallo schermo del computer e impostare tutti i parametri per l'esperimento di scansione laser.<ol>
<li>Quando si regolano i parametri, è possibile utilizzare Gamma indicatore funzione per definire se il segnale è saturo o non.</li>
		<li>Facoltativamente, applicare la funzione di riutilizzare per ricaricare tutte le impostazioni di parametro dal file selezionato confocale. Nota: Ha suggerito i parametri di imaging: Laser line (eccitazione): 515 nm o 561 nm; Emissione: 570-650 nm; Pinhole: 1 unità arioso (AU); Guadagno: 600-750, modalità di scansione: telaio; Misura telaio: 512 X 512 o 1024 X 1024; velocità di scansione: da 7 a Max; Direzione di scansione: bi-direzione; Media numero: 2-4; Con una media di metodo: dire; Profondità di bit: 16 Bit; Intervallo di scansione: 0,5-1 µM. Ottimizzare ulteriormente, tutti questi parametri in base alla natura dei campioni differenti della pianta e le specifiche esigenze di imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. image processing
<ol><li>Per la visualizzazione di viste di sezione trasversale e ortogonali ottico, è necessario utilizzare lo stesso software commerciale per l'acquisizione di immagine. Aprire il file originale confocale, fai clic su menu ortho, selezionare ortho. Quindi selezionare una delle due posizioni x, z e y posizione posizione dell'immagine e salvare le immagini come file tiff.<ol>
<li>Facoltativamente selezionare funzione distanza 3D per definire la distanza fisica tra due punti che sono stati selezionati dallo stack delle immagini confocale.</li>
		<li>In alternativa, utilizzare Fiji/Image J, il pacchetto di elaborazione di immagine risorse open per visualizzare le viste di sezione trasversale e ortogonali.</li>
		<li>Aprire il file originale confocale con Fiji, fare clic sul menu immagine, selezionare stack e quindi selezionare viste ortogonali.</li>
		<li>Selezionare XY, YZe XZ piani in posizione centrale e salvare come immagini in formato Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per visualizzare una proiezione 3D trasparente, utilizzare lo stesso software.<ol>
<li>Aprire il file originale confocale, fai clic su menu 3De selezionate trasparente per generare una vista di proiezione 3D.</li>
		<li>Facoltativamente fare clic su menu 3D, selezionare aspettoe quindi selezionare trasparenza per regolare tre parametri della proiezione tra cui soglia, rampa e massimo per la trasparenza del 3D immagine.</li>
		<li>Fai clic su menu 3D, selezionare aspetto, quindi luce per regolare la luminosità dell'immagine in 3D.</li>
		<li>Esportare le immagini proiettate e salvarli come file Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per visualizzare una proiezione 3D intensità massima, aprire i file confocale con lo stesso software e fare clic sul menu 3D.<ol>
<li>Selezionare menu 3D e massima.</li>
		<li>In alternativa, è possibile utilizzare J Fiji/immagine per visualizzare una proiezione 3D intensità massima.</li>
		<li>Aprire il file originale confocale con Fiji, fare clic sul menu immagine e selezionate pile.</li>
		<li>Selezionare progetto 3D e salvare come immagini in formato Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per visualizzare la profondità di visualizzazione delle immagini 3D di codifica, è possibile utilizzare lo stesso software.<ol>
<li>Fare clic su menu 3D e selezionare aspetto.</li>
		<li>Selezionare speciali e Profondità di codifica.</li>
		<li>In alternativa, è possibile utilizzare J Fiji/immagine per visualizzare la profondità di codifica vista.</li>
		<li>Aprire i file confocale, fare clic sul menu immagine, selezionare Hyperstack.</li>
		<li>Selezionare codice temporale-colore e salvare come immagini in formato Tiff. Nota: La profondità z-stack codifica possono essere acquisiti anche attraverso il plugin Z codice Stack per Fiji.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la visualizzazione 3D vista di rotazione come indicato (film 1 e 2 di film), utilizzare lo stesso software (Vedi la Tabella materiali).<ol>
<li>Aprire i file confocale, fai clic su menu 3De selezionare serie.</li>
		<li>Selezionare il rendering di seriee selezionare una delle quattro opzioni tra cui girare intorno a x, girare intorno a y, inizio e fineed elenco posizione.</li>
		<li>Salvare la serie di rendering dei file AVI.</li>
		<li>In alternativa, è possibile utilizzare J Fiji/immagine per visualizzare la vista di rotazione 3D.</li>
		<li>Aprire il file originale confocale con Fiji, fare clic sul menu immaginee selezionate pile.</li>
		<li>Selezionare progetto 3D e salvare come video in formato AVI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging che possa essere applicato allo studio dei meristemi apicali di sparare da diverse piante con piccole modifiche, aprendo una nuova strada per studiare la regolazione del meristema in fasi sia vegetativi e riproduttivi in piante modello e colture. In contrasto con il SEM e metodi di colorazione istologici, questo protocollo può aiutare a rivelare sia vista di superficie e interne strutture cellulari di SAMs, senza la necessità di alta intensità di lavoro esempio fissazione e/...

Il meristema pianta contiene un pool di cellule staminali indifferenziate e continuamente sostiene la crescita delle piante dell'organo e sviluppo1. Durante lo sviluppo postembrionale, quasi tutti i tessuti fuori terra di un impianto sono derivati da sparare meristema apicale (SAM). Nelle colture, l'attività e la dimensione del database SAM e sua derivati meristemi floreali sono strettamente associati con molte caratteristiche agronomiche come sparare architettura, produzione di frutta e il rendimento della semente. Ad esempio, nel pomodoro, una SAM allargato causa un aumento le riprese e la ramificazione di infiorescenza e così risultati nel generare extra fiore e frutta organi2. Nel mais, un aumento nella dimensione di SAM conduce ad un più alto numero di inizializzazione e la resa totale3,4. Nella soia, l'indeterminatezza del meristema è anche strettamente associato con l'architettura di sparare e resa5.
La morfologia e l'anatomia dei Mas può essere caratterizzate da diversi metodi, tra cui sezionamento/colorazione istologica e scansione microscopia elettronica (SEM)6, entrambi i quali notevolmente hanno avanzato la ricerca di meristema fornendo la vista in sezione o una vista tridimensionale (3D) superficie SAMs. Tuttavia, entrambi i metodi sono molto tempo, che coinvolge diversi passaggi sperimentale dalla preparazione del campione per l'acquisizione di dati, e questi metodi dipendono principalmente da campioni fissati. Gli avanzamenti recenti nella tecnica di microscopia confocale a scansione laser hanno superato questi limiti e ci forniscono un potente strumento per indagare la struttura cellulare e il processo di sviluppo di pianta tessuti e organi7,8. Attraverso ottico piuttosto che fisico tessuto microscopia confocale, sezionamento consente la raccolta di una serie di immagini dello stack z e le successive ricostruzioni 3D del campione attraverso software di analisi di immagine.
Qui, descriviamo una procedura efficace per indagare sia all'interno e strutture superficiali del vivente SAMs da diverse piante mediante microscopia confocale, che potenzialmente permette ai ricercatori di compiere la sperimentale di scansione laser processo all'interno di più breve 20 minuti. Diverso da altri metodi pubblicati per live imaging confocale di Arabidopsis infiorescenza SAMs9,10,11,12,13,14, 15 e Arabidopsis fiori12,13, Qui dimostriamo che questo protocollo è altamente efficiente per studiare non solo i meristemi infiorescenza delle specie modello, ma anche la ripresa vegetativa Meristemi apicali da diverse colture, come il pomodoro e soia. Questo metodo non si basa su marcatori fluorescenti transgenici e potenzialmente può essere applicato per studiare i meristemi sparare da molte diverse specie e cultivar. Inoltre, presentiamo anche passaggi per visualizzare e analizzare diverse SAMs in una vista 3D di elaborazione delle immagini semplici. Presi insieme, questo semplice metodo faciliterà i ricercatori a comprendere meglio la struttura e il processo di sviluppo di meristemi da organismi modello e colture.

<table><tbody><tr><td>Agar Phyto</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF Pinze super fini Inox Tip Size .025 X .005mm, per la dissezione di apici di germogli.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale verticale LSM 880&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog MS medio</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 20x/1.1 lente per immersione in acqua</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Prodotti scientifici</td><td>229694</td><td>Utilizzo per la produzione di lastre MS</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica60 mm X 15</td><td>CELLTREAT Prodotti scientifici</td><td>229665</td><td>Utilizzo come piastre</td></tr> di <tr><td>imaging Miscela di propagazione</td><td>Sungro Horticulture</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>1 mg/mL soluzione in acqua, per colorare le pareti cellulari</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>Per tagliare l'apice del germoglio dalle piante</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen nero</td><td>Zeiss</td><td>Software di acquisizione immagini</td><td></td></tr></tbody></table>

formazione immagine confocal live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Le funzioni del meristema apicale (SAM) di sparare come un serbatoio di cellule staminali conservate ed esso genera aboveground quasi tutti i tessuti durante lo sviluppo postembrionale. L'attività e la morfologia dei Mas determinare importanti caratteristiche agronomiche, quali sparare architettura, dimensioni e numero di organi riproduttivi e soprattutto, la produzione di granella. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per analizzare sia la morfologia superficiale e la struttura cellulare interna del vivente SAMs da specie diverse attraverso il microscopio confocale a scansione laser. L'intera procedura dalla preparazione del campione per l'acquisizione di immagini tridimensionali ad alta risoluzione (3D) può essere eseguita entro 20 minuti più breve. Dimostriamo che questo protocollo è altamente efficiente per studiare non solo l'infiorescenza SAMs delle specie modello ma anche meristemi vegetativi da colture diverse, fornendo uno strumento semplice ma potente per studiare l'organizzazione e lo sviluppo di Meristemi attraverso diverse specie vegetali.

Per valutare l'efficienza del nostro protocollo e per esplorare la morfologia dei meristemi da specie diverse, abbiamo effettuato esperimenti dal vivo imaging confocale sul meristema infiorescenza da Arabidopsis e meristemi vegetativi da pomodoro e soia. In questo studio, Arabidopsis ecotipo Landsberg erecta, cultivar di pomodoro Micro-Tom e cultivar di soia 82 Williams sono stati usati come esempi.
Vi...

Questo protocollo presenta come immagine live e analizzare i meristemi apicali di sparare da specie diverse di piante mediante microscopia confocale a scansione laser.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

I meristemi apicici controllano la crescita e la riproduzione delle piante. Questo metodo ci aiuta a indagare la morfologia e le strutture interne dei meristemi apicali di germogli non solo nelle specie modello ma anche in diverse colture. Questa tecnica è una procedura molto efficiente.Il meristem apicale shoot può essere visualizzato direttamente in un'alta risoluzione cellulare senza alcuna fissazione del campione ad alta intensità di lavoro e passaggi di sezionamento dei tessuti. Per iniziare, coltiva piante di Arabidopsis, pomodoro e soia come descritto nel protocollo di testo. Tagliare l'apice del germoglio di infiorescenza dalle piante di Arabidopsis imbullonato.Tenere la parte basale del gambo principale e utilizzare le forcep per rimuovere il maggior numero possibile di organi floreali più vecchi dal gambo principale. Continuare a rimuovere il resto dei fiori nel campo del microscopio stereo fino a quando il meristem apicico shoot può essere visualizzato dagli oculari. Per visualizzare i meristemi apicale del germoglio vegetativo dal pomodoro o dalla soia, sezionare i cotiledoni, le foglie e le radici della pianta.Tenere gli ipocotili della pianta al microscopio stereo e utilizzare le forcep per sezionare ulteriormente le foglie e la primordia fogliare che coprono i meristemi apicali del germoglio vegetativo. Pipetta 50 microlitri di soluzione di ioduro di propidio in una piastra di Petri pulita e vuota. Immergere l'intero apice del germoglio sezionato nella tintura per due minuti.Durante il processo di colorazione, immergere l'intero meristem apico del germoglio di infiorescenza o nel meristem apicico del germoglio vegetativo nella soluzione di ioduro propidio per ottenere una colorazione uniforme. Risciacquare l'apice del germoglio macchiato due volte in acqua sterile e deionizzata. Ora, perforare un buco al centro di un piatto di imaging preparato usando le forcep e attaccare l'apice del germoglio macchiato in posizione verticale nel mezzo.Riempire il piatto di imaging con acqua sterile e deionizzata per immergere completamente il campione. Visualizzare il campione attraverso il microscopio stereo. Pipetta su e giù per rimuovere le bolle d'aria intrappolate intorno al meristem.Quindi, regolare l'angolo dello stelo nell'agar per assicurarsi che il meristem apicico di tiro sia completamente visibile dall'alto. Ora, posizionare la scheda di imaging sullo stadio campione del microscopio confocale. Abbassare l'obiettivo di immersione in acqua e sollevare lo stadio del campione del microscopio per lasciare che la punta dell'obiettivo si tuffi nell'acqua.Aprire il software al microscopio confocale e utilizzare gli oculari per individuare e concentrarsi sul meristem apicico shoot nel campo luminoso. Utilizzare la funzione Acquisition nel software al microscopio confocale. Avviare la modalità live per visualizzare l'esempio dallo schermo del computer e impostare tutti i parametri per l'esperimento di scansione laser.Quando si regolano i parametri, utilizzare la funzione Indicatore intervallo per definire se il segnale è saturo o meno. Lo stesso software utilizzato per l'acquisizione di immagini può essere utilizzato per visualizzare una proiezione trasparente tridimensionale. Aprite il file confocale originale, fate clic sul menu 3D e selezionate Trasparente (Transparent) per generare una vista di proiezione 3D.Facoltativamente, selezionate Trasparenza (Transparency) per regolare tre parametri della proiezione, tra cui Soglia, Rampa e Massimo per la trasparenza dell'immagine 3D. Ora, selezionare Luce per regolare la luminosità dell'immagine 3D. Esportare le immagini proiettate e salvarle come file TIFF.Per visualizzare la visualizzazione della codifica di profondità delle immagini 3D, utilizzare lo stesso software. Anche in questo caso, fare clic sul menu 3D e selezionare Aspetto. Selezionate Speciale (Special) e Codifica profondità (Depth Coding).Esportare le immagini proiettate e salvarle come file TIFF. Questa immagine dalla sezione ortogonale attraverso il centro dell'Arabidopsis spara meristem apicale mostra che le pareti orizzontali sono macchiate di ioduro di propidio in quasi tutte le cellule a strati cellulari multipli. Una vista di una sezione trasversale attraverso il corpus dell'infiorescenza spara meristem apicale mostra che anche le cellule del piano XY sono chiaramente immagini.La vista di proiezione 3D rivela che il meristem dell'infiorescenza forma una struttura a cupola ed è circondato dal primordia dei fiori in via di sviluppo. Questa immagine dalla sezione ortogonale attraverso il centro del meristem apicale del germoglio di pomodoro mostra anche che le pareti orizzontali sono macchiate di ioduro di propidio a più strati cellulari, sebbene il segnale di ioduro propidio dalla regione interna profonda sia leggermente inferiore. Un'immagine di una sezione trasversale attraverso gli strati profondi del meristem apicali di tiro vegetativo rivela le cellule dei piani XY e il confine formato tra il meristem vegetativo e il primordia fogliare.La vista di proiezione 3D può inoltre fornire una visione completa della forma e dell'organizzazione del meristem vegetativo dal pomodoro. Qui è mostrata una vista ortogonale attraverso il mezzo del meristem apicale del germoglio di soia e una proiezione 3D dello stesso meristem apicale di ripresa. Sono osservabili anche il meristem vegetativo a cupola e la sua nuova primordia fogliare derivata.Lo ioduro di propidio può facilmente macchiare le cellule danneggiate o morte, il che influenzerà notevolmente la qualità delle immagini, quindi è importante evitare qualsiasi danno fisico durante la preparazione di campioni meristem apicali.

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