Nuovo protocollo per la generazione di cellule dendritiche fisiologiche immunogene

Le cellule fisiologiche dendritiche che presentano l'antigene, vengono interruttori immunitari che avviano l'immunità e la tolleranza delle cellule T specifiche dell'antigene. Questo documento delinea un metodo efficiente per la produzione di PhDC. L'uso clinico delle cellule dendritiche è ostacolato dai metodi citocine non fisiologici utilizzati per produrle.

Il nostro metodo supera questo problema attraverso un'efficiente segnalazione piastrinica della conversione da monocite a CC negli esseri umani e nei topi. Questi PhDC non dipendono da condizioni di citochina non disponibili in vivo, quindi possono generare potenti risposte cliniche alle cellule T antitumorali sia negli esseri umani che nei topi con tumori consolidati. L'iniziazione piastrinica indipendente dalle specie della maturazione da monocita a PhDC ha un'ampia applicabilità sperimentale.

Il PhDC consente la dissezione della fisiologia delle cellule dendritiche, facilita l'induzione dell'immunità terapeutica anti-cancro ai tumori immunogenici e offre promesse per la vaccinazione antimicrobica personalizzata. Questo sistema sperimentale è nuovo e molteplici aspetti di esso come il rivestimento della camera di plastica, il trattamento delle cellule tumorali con 8-MOP / UVA, le condizioni di flusso e il rilascio di monociti sono meglio rappresentati visivamente. A dimostrare la procedura sarà Eve Robinson, un tecnico del mio laboratorio.

Per raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico, è stato istituito per la prima volta un tubo da 15 millilitri con quattro millilitri di mezzo di isolamento dei linfociti per cinque-10 topi sanguinati. Quindi strato lentamente il sangue raccolto da topi portanti di tumore sopra il mezzo. Ruotare le cellule a 1.000 a 1.500 volte G per 20 minuti per separare i PBBC dai globuli rossi.

Al termine della centrifugazione, raccogliere lo strato plasmatico superiore, lasciando 0,5 millilitri rimanenti sopra il mantello buffy e conservare a quattro gradi Celsius per un uso successivo. Successivamente, raccogliere lo strato di mantello buffy in un tubo pulito da 15 millilitri riempito con PBS a 15 millilitri e girare a 250 volte G in una centrifuga di coltura tissutale standard per 10 minuti per raccogliere il PBMC. Al termine della centrifugazione, pipettare con cura il supernatante e far scorrere il tubo per rimescolare il pellet.

Quindi aggiungere due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi ACK al tubo per rimuovere eventuali globuli rossi rimanenti dal PBMC. Incubare il PBMC sul ghiaccio per 10 minuti. Riempire il tubo con PBS a 15 millilitri e girare verso il basso a 250 volte G in una centrifuga di coltura tissutale standard per 10 minuti per raccogliere il PBMC.

Pipettare con cura il supernatante e far scorrere il tubo per allentare il pellet. Resuspend il pellet in 300 microlitri di FBS. Per preparare le cellule tumorali YUMM1.7 per gruppo di trattamento, è necessario prima rimorsipare il pellet di cellule tumorali in FBS a 2,5 milioni di cellule per 300 microlitri.

Con le luci del cappuccio di coltura tissutale spente, aggiungere 8-metossipsoralen per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro alla sospensione cellulare tumorale YUMM1.7. Quindi, mescolare le cellule, avvolgere il contenitore cellulare in un foglio e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Per pre-rivestire una piastra di coltura tissutale da 12 pozzetti, aggiungere un millilitro di FBS a un pozzo per ogni gruppo di trattamento di cinque topi e refrigerare la piastra a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, sotto una cappa di coltura tissutale, rimuovere FBS dai pozzi e aggiungere 300 microlitri di cellule tumorali esposte a metossipsoralen per pozzo. Quindi esporre la piastra contenente celle all'ultravioletto prerifapidto Una sorgente luminosa per l'irradiazione totale di quattro joule per centimetro quadrato. Per raccogliere cellule tumorali trattate con 8 metossipsoralen/UVA da ogni pozzo, ruotare accuratamente la piastra e la pipetta per garantire il completo recupero cellulare.

Per eseguire il passaggio della piastra di transimmunizzazione per ogni gruppo di trattamento di cinque topi, combinare 300 microlitri del PBMC appropriato e 300 microlitri di cellule tumorali trattate con 8 metossipsoralen / UVA in un tubo conico da 1,5 millilitri e mescolare le cellule. Quindi, aprire i morsetti dei tubi di ingresso e di uscita della piastra TI. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per riempire il tubo TI con FBS, chiudendo i morsetti mentre il tubo viene riempito per trattenere FBS all'interno del tubo.

Scollegare la siringa. Posizionare saldamente una punta della pipetta P1000 nell'aspirazione della piastra TI. Tenere la piastra con un angolo di 45 gradi e riempire lentamente la piastra con PBMC e mix di cellule tumorali, evitando bolle.

Rimuovere la punta della pipetta dall'aspirazione prima di rilasciare il pistone della pipetta. Riportare le celle rimanenti al tubo conico da 1,5 millilitri. Incubare i tubi riempiti di FBS, la piastra TI riempita di cellule e il tubo conico da 1,5 millilitri contenente le cellule rimanenti nell'incubatrice di coltura tissutale a 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, rilasciare i morsetti e svuotare i tubi TI per gravità. Quindi inserire una punta della pipetta P1000 con lo stantuffo premuto nella porta piastra per rimuovere le celle dalla piastra TI. Tenere la piastra con un angolo di 45 gradi e riempire la punta della pipetta P1000.

Riposizionare le celle nel tubo conico originale da 1,5 millilitri. Per far funzionare la piastra TI, collegare il tubo di uscita alla piastra e fissare la piastra TI nel sistema di funzionamento della piastra. Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro, disegnare quei 600 microlitri di PBMC e miscela di cellule tumorali dal tubo conico da 1,5 millilitri.

Attaccare la siringa al tubo d'ingresso con il morsetto aperto e riempire lentamente fino a quando il fluido non raggiunge l'estremità del tubo. Attaccare l'estremità libera del tubo d'ingresso alla piastra TI e continuare a caricare delicatamente il volume rimanente. Chiudere il morsetto d'ingresso al termine.

Staccare la siringa da un millilitro e collegare il tubo d'ingresso alla pompa della siringa. Fissare il tubo di uscita a un tubo conico pulito da 1,5 millilitri per la raccolta delle celle. Regolare la portata della pompa della siringa a 0,09 millilitri al minuto.

Inclinare la piastra TI di circa 30 gradi verso il lato della pompa della siringa utilizzando una piattaforma di corsa a piastre TI. Rilasciare con cura il morsetto sul tubo d'ingresso. Avviare la pompa della siringa, osservando attentamente come si riempie la piastra TI.

Una volta che la piastra TI è completamente riempita, inclinarla di circa 30 gradi nella direzione opposta mentre si svuota. Quando tutte le celle del liquido si trovano nel tubo di raccolta conico da 1,5 millilitri, arrestare la pompa. Per lavare la piastra TI, scollegare i tubi d'ingresso dalla pompa della siringa e collegarlo a una siringa da un millilitro riempita con 600 microlitri di FBS.

Riempire fino a quando FBS è completamente caricato. Quindi scollegare la siringa e attaccare il tubo alla pompa della siringa. Regolare la portata della pompa della siringa a 0,49 millilitri al minuto.

Rilasciare il morsetto d'ingresso ed eseguire la piastra TI, raccogliendo il lavaggio nello stesso tubo conico da 1,5 millilitri. Scorrere o toccare delicatamente la piastra TI per tutto il tempo per aiutare a staccare ed eluire eventuali cellule aderenti mentre la piastra si svuota. Scollegare il tubo conico da 1,5 millilitri di raccolta dalla configurazione della piastra TI.

Ruotare il tubo di raccolta nel microfugo da banco a 250 volte G per otto minuti e scartare il supernatante. Per eseguire la co-incubazione notturna di PBMC con antigene, è necessario prima rimorsizzare il PBMC e il pellet di cellule tumorali in due millilitri di RPMI chiaro integrati con siero del topo autologo al 15%. Quindi piastrere le cellule in un piatto sterile non trattato con coltura tissutale di 35 millimetri e incubare durante la notte in condizioni standard di coltura tissutale.

Il giorno seguente, staccare con cura tutte le cellule aderenti dal fondo del piatto con un raschietto per la coltura tissutale. Ruotare il piatto mentre si raschia per garantire una raccolta uniforme delle celle. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri.

Aggiungere due millilitri di PBS al piatto e ripetere la fase di raschiatura, raccogliendo le cellule nello stesso tubo. Risciacquare il piatto da 35 millimetri con un millilitro di PBS e aggiungere il risciacquo allo stesso tubo. Ruotare a 250 volte G in una centrifuga standard di coltura tissutale per 10 minuti per raccogliere le cellule.

Pipettare con cura il supernatante, quindi scorrere il tubo per rimescolare il pellet. La terapia ha mostrato una riduzione della crescita del tumore YUMM1.7 in oltre 100 topi trattati rispetto al controllo, come osservato nei dati cumulativi sulla crescita tumorale di nove esperimenti indipendenti condotti in due anni. Le curve rappresentative di crescita tumorale per i singoli animali all'interno di un esperimento forniscono un senso di variabilità nel sistema.

Quando monociti o piastrine sono esauriti dalla frazione PBMC o quando il passaggio della piastra viene omesso, l'effetto terapeutico non è più osservato. Il trattamento è inefficace in assenza delle cellule immunitarie o di una fonte di antigene, o in presenza di un antigene non corrispondente, come i tumori YUMM1.7 trattati utilizzando cellule carcinoma del colon MC38. Per un risultato immunizzando, è anche fondamentale evitare l'esposizione del PBMC a 8-metossipsoralen.

L'analisi FACS del cambiamento dei marcatori indicati dai corrispondenti controlli IgG nelle cellule CD11c+ umane tra PBMC appena isolati, PBMC trattato con TI, PBMC trattato con TI senza passaggio a piastre, piastrine esaurite prima del passaggio della piastra, o entrambe le precedenti, ha mostrato che l'attivazione cc dipende dalla presenza di piastrine nel PBMC e dal passaggio della piastra TI. I PC umani attivati dal TI possono elaborare e incrociare efficacemente gli antigeni peptidici, o gli antigeni di intere cellule tumorali umane esposte a 8 metossipsoralen per attivare linee cellulari T specifiche dell'antigene umano in saggi in vitro in modo ti-e piastrinica-dipendente. La specificità delle risposte delle cellule T dipende dall'origine degli antigeni elaborati.

Quando si induce l'immunità anti-cancro, l'apoptosi di ogni linea cellulare tumorale deve essere titolazione per massimizzare l'immunogenicità. Poiché l'immunità indotta sarà specifica per l'immunizzazione degli antigeni, sarà possibile una dissezione dettagliata di ciascun sistema. Ogni tumore sperimentale o clinico, e ogni risposta antimicrobica, sarà informativo in modo univoco.

Ogni singolo cancro umano ha la sua gamma di antigeni specifici del tumore. Il PhDC esegue lo smistamento e la presentazione necessari degli antigeni tumorali, senza richiedere la loro preventiva identificazione di laboratorio. Tieni presente che la luce 8-MOP e UVA sono cancerogene.

Utilizzare dispositivi di protezione appropriati e seguire le procedure di sicurezza durante la manipolazione di 8-MOP e quando si lavora con sorgenti luminose UVA.