Name: Strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri la spettroscopia vibrazionale SFG per analizzare strutture interfacciari di polimeri e biomacromolecole con selettività di interfaccia. Questa tecnica ottica non invasiva rivela ordini conformazionali a livello submonostrato.

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Questo studio è stato sostenuto dal Programma di sviluppo chiave dello Stato per la ricerca di base della Cina (2017YFA0700500) e dalla National Natural Science Foundation of China (21574020). I Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali, un progetto finanziato dal Programma Accademico Prioritario Sviluppo degli Istituti di Istruzione Superiore jiangsu (PAPD) e dal Centro di Dimostrazione Nazionale per l'Ingegneria Biomedica Sperimentale Anche l'istruzione (Southeast University) è stata molto apprezzata.

1. SFG sperimentale
<ol><li>Utilizzare un sistema SFG picosecondo commerciale (Table of Materials), che fornisce un fascio fondamentale di 1064 nm con una larghezza dell'impulso di 20 ps e una frequenza di 50 Hz, basata su un laser Nd:YAG.</li>
	<li>Convertire il fascio fondamentale da 1064 nm in un fascio da 532 nm e in un fascio di 355 nm utilizzando il secondo e il terzo modulo armonico. Guidare direttamente il fascio di 532 nm come un fascio di luce di ingresso e generare l'altro fascio a infrarossi (IR) di ingresso che copre l'intervallo di frequenza da 1000 a 4000 cm-1 attraverso la generazione parametrica ottica (OPG)/amplificazione parametrica ottica (OPA)/ processo di generazione della frequenza di differenza (DFG).</li>
	<li>Impostare gli angoli di incidente di due travi di ingresso in modo che siano rispettivamente di 53 gradi (IR) e di 64 gradi (visibili), rispetto alla normale alla superficie.</li>
	<li>Per rilevare le strutture interfacciali interfacciali polimeriche (interfaccia pellicola/substrato o pellicola/altra interfaccia media), utilizzare ssp (fascio di frequenza a somma polarizzata s-polarizzato , fascio visibile polarizzato s e fascio infrarosso p-polarizzato) e combinazioni di polarizzazione ppp.</li>
	<li>Per rilevare le strutture secondarie delle proteine interfacciali e le strutture idriche che circondano il DNA, oltre a ssp e ppp, sono state utilizzate combinazioni di spp chirale e psp polarizzazione.</li>
	<li>Per garantire che i campioni non fossero danneggiati, controllare le energie dell'impulso infrarosso e visibile in modo che siano rispettivamente di 70 e 30 mJ. Uno schema del processo SFG con il diagramma del livello di energia è stato mostrato nella Figura 1. Figura 2 Mostra il sistema SFG nella nostra camera pulita.</li>
</ol>2. Coefficienti Fresnel
<ol><li>Utilizzare prismi ad angolo retto come substrati per tutti gli esperimenti discussi qui. Esistono due interfacce per una pellicola polimerica sul substrato solido, cioè la superficie polimerica nell'aria e l'interfaccia polimerica/substrato. Entrambi possono generare segnali SFG poiché la simmetria di inversione è interrotta in entrambe le interfacce. Pertanto, uno spettro SFG raccolto è interferito. Tuttavia, i coefficienti di campo locale o i coefficienti Fresnel alle due interfacce possono essere regolabili variando gli angoli dell'incidente o lo spessore della pellicola uno alla volta o contemporaneamente31,32. Questo ci offre l'opportunità di sondare il segnale vibrazionale SFG da una sola interfaccia. Qui, il film PHEMA sul prisma CaF2 è stato preso come esempio9.</li>
	<li>Come mostrato nella Figura 3, impiegare la geometria del prisma ad angolo retto per rilevare i segnali SFG generati dalla pellicola PHEMA inferiore. L'intensità di uscita SFG nella modalità riflessa è espressa come <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">(1) dove <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> indica l'efficace tensore di suscettibilità non lineare di secondo ordine. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq2.jpg" style="opacity: 0.9;">è costituito da tre parti, vale a dire l'interfaccia prism/polimero, l'interfaccia media polimero/inferiore (il mezzo inferiore comprende gas, liquido o solido.) e lo sfondo non risonante, come mostrato nell'equazione seguente. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq3.jpg" style="opacity: 0.9;">(2) Qui il mezzo inferiore potrebbe essere aria, acqua o qualcos'altro. F rappresenta il coefficiente Fresnel corrispondente responsabile della correzione del campo locale.</li>
	<li>In questo caso, applicare un modello a pellicola sottile per calcolare i coefficienti di Fresnel. Qui vengono presentate solo brevi procedure di calcolo.<ol>
<li>Per l'interfaccia prism/polymer, utilizzare <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq4.jpg" style="opacity: 0.9;">(3) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq5.jpg">(4) <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq6.jpg">(5) Il significato di ogni parametro mostrato è presentato di seguito.<ol>
<li>
i indica la frequenza del fascio.</li>
			<li>
tp e ts denotano i coefficienti di trasmissione complessivi e possono essere espressi come <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">(6) <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq8.jpg">(7)</li>
			<li>
tp12 e ts12 denotano i coefficienti di trasmissione lineare del fascio di luce all'interfaccia prisma/polimero.</li>
			<li>
rp23 e rs23 denotano i coefficienti di riflessione lineare del fascio di luce nell'interfaccia polimerica/media.</li>
			<li>
rappresenta la differenza di fase tra un fascio riflettente e il suo fascio riflettente secondario dopo che si propaga attraverso la pellicola sottile polimerica e poi riflette indietro, che può essere espressa come <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq9.jpg" style="opacity: 0.9;">(8)</li>
			<li>
rappresenta la lunghezza d'onda del fascio di luce e d è lo spessore della pellicola polimerica.</li>
			<li>
Gli n. 1 e i n. 2 rappresentano gli angoli degli incidenti rispettivamente nell'interfaccia prism/polimero e nell'interfaccia polimero/medio.</li>
			<li>
n1 e n2 rappresentano rispettivamente gli indici di rifrazione della pellicola prisma e polimerica.</li>
			<li>
n12 rappresenta gli indici refrattivi degli strati interfacciali polimerici per il prisma/polimero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per l'interfaccia polimerica/media, utilizzare <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq10.jpg">(9) <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq11.jpg">(10) <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq12.jpg">(11)<ol>
<li>
La differenza di fase dei campi elettrici leggeri in due interfacce.</li>
			<li>Poiché la larghezza dell'impulso per le nostre travi di input è di 20 ps, l'errore del ritardo temporale associato all'effetto di dispersione può essere trascurato.</li>
			<li>L'espressione di tale differenza di fase per l'uscita SFG, l'ingresso visibile e le travi a infrarossi di ingresso possono essere scritte separatamente come <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq13.jpg">(12) <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq14.jpg">(13) <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq15.jpg">(14) 
			 </li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Dalla discussione precedente, per il sistema prism-poliomer film-medium (1-2-3), esprimere i coefficienti Fresnel totali per le interfacce prism/polimero e polimero/medio come le seguenti equazioni, per le seguenti equazioni, per le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp . Naturalmente, entrambe le interfacce sono considerate azimuthally isotropico.<ol>
<li>Per l'interfaccia prism/polimero, le espressioni dei coefficienti totali di Fresnel per entrambe le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp sono presentate come segue.<ol>
<li>Per ssp, l'equazione è <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq16.jpg">(15)</li>
			<li>E per ppp, l'equazione è <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq17v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(16) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq18v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(17) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq19v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(18) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq20v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(19) 
			 </li>
			<li>
t10 e t01 denotano i coefficienti di trasmissione lineare rispettivamente alle interfacce aria/prisma e prisma/aria.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per l'interfaccia polimero/medio, le espressioni dei coefficienti totali di Fresnel per entrambe le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp sono descritte di seguito.<ol>
<li>Per ssp, l'equazione è <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq21.jpg" style="opacity: 0.9;">(20)</li>
			<li>Per ppp, le equazioni sono <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq22v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(21) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq23v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(22) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq24v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(23) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq25v3.jpg" style="opacity: 0.9;">(24) 
			    
			 </li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver calcolato i coefficienti di Fresnel utilizzando il modello sandwich, tracciarli in funzione dello spessore della pellicola, come illustrato nella Figura 4. NOTA: In questo caso, esiste una gamma di spessore per la raccolta del segnale SFG dall'interfaccia CaF2 prism/PHEMA con contributo trascurabile dall'altra interfaccia, che è di circa 150 nm. Allo stesso modo, uno spessore adatto può essere scelto per il rilevamento dell'interfaccia media PHEMA/inferiore con contributo trascurabile dall'interfaccia CaF2 prism/PHEMA.</li>
</ol>3. Ccombinazione di polarizzazione SFG
<ol><li>Per l'interfaccia achirale normale, in genere, utilizzare la simmetria di C. v in termini di media dell'insieme33,34. Con il funzionamento della simmetria di inversione, è possibile dedurre i componenti del tensore non lineare non lineare non-lineare non zero, che sono cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy, czyy e czzz (il termini esistenti possono essere ulteriormente ridotti se si assume un'interfaccia isotropica, il che significa che x e y sono uguali). Tuttavia, per l'interfaccia chirale, la situazione sarà diversa. L'interfaccia chirale possiede la simmetria di C, è consentita solo l'operazione di simmetria di rotazione. In questo caso, oltre ai normali termini achirali, più suscettibilità non lineari di secondo ordine sarà diverso da zero, che può essere definito come i termini chirali, vale a dire, czyx, czxy e cyzx sotto la considerazione di non elettronici Risonanza. Pertanto, utilizzando psp, pps e combinazioni di polarizzazione spp, gli spettri SFG chirali possono essere raccolti33,34.</li>
</ol>4. Preparazione del campione
<ol><li>Preparazione del film PHEMA<ol>
<li>Sciogliere la polvere di PHEMA (vedi Tabella deimateriali) in etanolo anidrio soro per preparare la soluzione rispettivamente con 2 wt% e 4 wt%.</li>
		<li>Prima della deposizione dei film PHEMA, immergere le prismi dell'angolo retto CaF2 nel solvente toluene prima di tutto e poi lavate con etanolo e acqua ultrapura (18,2 M .</li>
		<li>Successivamente, esporre i substrati (prismi ad angolo retto CaF 2) al plasma di ossigeno per rimuovere eventuali contaminanti organici dal pulitore di plasma (vedere Tabella dei materiali).<ol>
<li>Per prima cosa accendi il detersiva al plasma e mettici dentro i substrati.</li>
			<li>Quindi accendere la pompa del vuoto per aspirare il pulitore. Inserire l'ossigeno in esso.</li>
			<li>Infine impostare 4 minuti per la pulizia. Dopo di che, conservare i substrati puliti per la preparazione sequenziale della pellicola PHEMA.</li>
			<li>Quindi preparare le pellicole PHEMA sul CaF2 prismi da uno spin-coater (vedi Tabella dei materiali). Regolare gli spessori della pellicola in base alla concentrazione della soluzione e alla velocità di rotazione.<ol>
<li>Immobilizzare il prisma CaF2 sul disco da suzione di spin-coater.</li>
				<li>Eliminare una goccia della soluzione PHEMA preparata prima sui substrati puliti a 1.500 giri/mm per 1 min (spessore della pellicola 2 wt% per 100 nm e 4 wt% per 200 nm).</li>
			</ol>
</li>
			<li>Anneal tutte le pellicole PHEMA preparate in un forno a vuoto a 80 gradi durante la notte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della fibroina di seta (SF) NOTA: È stato adottato il protocollo suggerito da Kaplan et al.35.<ol>
<li>Mettere 7,5 g di bozzoli di seta di B. mori nel carbonato di sodio bollente (Na2CO3, 0,02 M) soluzione aqueous (3 L) per 30 m. Rimuovere il fibroso SF in un contenitore pulito.</li>
		<li>Lavare la SF fibrosa ottenuta con acqua deionizzata per tre volte sotto agitazione al fine di rimuovere le molecole di sericina e lasciare solo le molecole SF nel campione fibroso.</li>
		<li>Asciugare il campione fibroso di SF in un forno sottovuoto a 60 gradi centigradi durante la notte.</li>
		<li>Successivamente, sciogliere il campione fibroso degummed SF in un bromo di litio (LiBr, 9,3 M) soluzione aquesa (1 g di SF è stato risolto in 4 mL di soluzione LiBr.) e incubarlo a 60 gradi centigradi per 2 h sotto mescolando.</li>
		<li>Diallyze la soluzione SF contro l'acqua deionizzata (3.500 sacchetti di dialisi Da) per 3 giorni per rimuovere il disciolto LiBr. Cambiare nuova acqua deionizzata tre volte al giorno. Infine, conservare la soluzione SF elaborata a 4 gradi centigradi per i successivi esperimenti SFG.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di oligonucleotide duplex a catena corta<ol>
<li>Ordina il campione di oligonucleotide a filamento singolo con il suo glicole a 3'fine modificato da colesterolo-trietilene (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') da una società commerciale (vedi Tabella dei materiali) e da quella complementare. Per ogni singolo filamento, sciogliere 10 nmol della polvere campione in acqua ultrapura da 0,5 ml. Quindi mescolare insieme per formare la soluzione oligonucleotide duplex (10 nmol/mL).</li>
		<li>Mescolare 2 mg di 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) e 2 mg di DPPC detererated (d-DPPC) e scioglierli in 1 mL di cloroformio per preparare la soluzione lipidica.</li>
		<li>Preparazione del mostrato DPPC e d-DPPC da parte di un trogolo Langmuir-Blodgett (LB)<ol>
<li>Fissare il prisma CaF2 ad angolo retto a un supporto campione fatto in casa con una faccia di prisma perpendicolarmente immersa nell'ambiente acquoso della depressione LB.</li>
			<li>Successivamente, iniettare la soluzione di lipidi mista preparata prima sulla superficie dell'acqua fino a quando la pressione superficiale ha raggiunto un certo valore al di sotto di 34 mN-m.</li>
			<li>Dopo che la pressione superficiale si sta spegnendo, usate due barriere di Teflon per comprimere il monostrato lipidico con un rapporto di 5 mm/min fino a raggiungere una pressione superficiale di 34 mn.m.</li>
			<li>Sollevare il prisma con un monostrato lipidico fuori dall'acqua ad una velocità di 1 mm / min verticalmente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparazione dell'altro strato di lipidi<ol>
<li>Per facilitare l'assemblaggio dell'oligonucleotide duplex e delle molecole lipidiche attraverso l'interazione idrofobica (colesterolo e una catena alchile lipidica), mescolare la soluzione oligonucleotide duplex con la soluzione lipidica in un rapporto molare di 1:100 (olinucleotide a lipidi).</li>
			<li>Iniettare la soluzione oligonucleotide mista lipidica e duplex sulla superficie dell'acqua in un contenitore di Teflon fatto in casa fino a raggiungere una pressione superficiale di 34 mN-m 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Infine, mettere il mostrato lipidico nella parte inferiore del prisma a contatto con il monotema lipidico con oligonucleotidi duplex inseriti sulla superficie dell'acqua per formare il campione finale per la misurazione SFG.</li>
	</ol></li>
	<li>Equazione di Lorentz<ol>
<li>Utilizzare l'equazione Lorentz per adattarsi agli spettri SFG per estrarre le informazioni vibrazionali per una specifica modalità vibrazionale. <img alt="Equation 26" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq26.jpg" style="opacity: 0.9;">(25) dove <img alt="Equation 27" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq27.jpg"> rappresenta l'intensità della modalità <img alt="Equation 28" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq28.jpg"> qth vibrazionale, <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq29.jpg"> rappresenta la frequenza di risonanza, <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/59380/59380eq30.jpg"> indica la metà della larghezza a metà massima (HWHM) e rappresenta la frequenza di scansione del fascio IR incidente. </li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Non abbiamo niente da rivelare.

Per studiare le informazioni strutturali a livello molecolare, SFG ha i suoi vantaggi intrinseci (ad esempio, sensibilità monostrato o sub-monostrato e selettività interfacciale), che possono essere applicati per studiare varie interfacce, come il solido/solido, solido/ interfacce liquide, solide/gas, liquide/gas, liquide/liquide. Anche se la manutenzione dell'apparecchiatura e l'allineamento ottico richiedono ancora molto tempo, il payoff è significativo in quanto è possibile ottenere le informazioni dettagliate a livel...

Lo sviluppo della spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma (SFG) può essere datato al lavoro svolto da Shen et al. trent'anni fa1,2. L'unicità della selettività interfacciale e della sensibilità sub-monostrato rende la spettroscopia vibrazionale SFG apprezzata da un gran numero di ricercatori nei campi della fisica, della chimica, della biologia e della scienza dei materiali, ecc.3,4 ,5. Attualmente, un'ampia gamma di questioni scientifiche relative alle superfici e alle interfacce è in fase di studio utilizzando SFG, in particolare per interfacce complesse rispetto ai polimeri e alle biomacromolecole, come le strutture a catena e il rilassamento strutturale interfacce polimeriche sepolte, le strutture secondarie delle proteine e le strutture dell'acqua interfacciale9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.
Per le superfici e le interfacce polimeriche, i campioni di pellicola sottile sono generalmente preparati mediante rivestimento a spin per ottenere le superfici o le interfacce desiderate. Il problema sorge a causa dell'interferenza del segnale dalle due interfacce dei film così preparati, che porta a disagi per l'analisi degli spettri SFG raccolti27,28,29. Nella maggior parte dei casi, il segnale vibrazionale solo da una singola interfaccia, sia pellicola / substrato o pellicola / l'altro mezzo, è auspicabile. In realtà, la soluzione a questo problema è abbastanza facile, vale a dire, per massimizzare sperimentalmente i campi di luce presso l'interfaccia desiderabile e ridurre al minimo i campi di luce presso l'altra interfaccia. Pertanto, i coefficienti di Fresnel o i coefficienti di campo locali devono essere calcolati tramite il modello a pellicola sottile e devono essere convalidati rispetto ai risultati sperimentali3,9,10,11, 12,13,14,15,30.
Con il background di cui sopra in mente, alcune interfacce polimeriche e biologiche potrebbero essere studiate al fine di comprendere la scienza fondamentale a livello molecolare. Di seguito, prendendo come esempi tre problemi interfacciali: sondare la superficie poli(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) e l'interfaccia sepolta con il substrato9, formazione di fibrosi seta (SF) strutture secondarie sulla superficie del polistirolo (PS) e strutture idriche che circondano modello a catena corta oligonucleotide duplex16,21, mostreremo come la spettroscopia vibrazionale SFG aiuta a rivelare le strutture a livello molecolare interfacciale in connessione con la scienza sottostante.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850355P-1g</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092680</td><td>&ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Prisma CaF2</td><td>Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10005817</td><td>&ge; 96,0%</td></tr> <tr><td>DPPC deuterato (d-DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860345P-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Forno elettromagnetico</td><td>Zhejiang Supor Co., Ltd</td><td>C21-SDHCB37</td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett (LB) tramite</td><td>KSV NIMA Co., Ltd.</td><td>KN 2003</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di litio anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20056926</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di sintesi Milli-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td>Acqua ultrapura</td></tr><tr><td>Detergente al plasma</td><td>Chengdu Mingheng Science& Technology Co., Ltd</td><td>PDC-MG</td><td>Pulizia al plasma di ossigeno</td></tr><tr><td>Poli(2-idrossietilmetacrilato) (PHEMA)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>192066 MSDS</td><td>Mw = 300 000</td></tr><tr><td>Polistirene</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>330345 MSDS</td><td>Mw = 48 kDa e Mn = 47 kDa</td></tr><tr><td>bozzoli</td><td></td><td></td> di seta <td>Da Bombyx mori</td></tr><tr><td>Singolo filamento complementare di oligonucleotide</td><td>Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.</td><td>H03596</td><td>5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'Singolo</td></tr> <tr><td>filamento di oligonucleotide</td><td>Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.</td><td>H04936</td><td>&nbsp; 3&cent;-estremità modificata da colesterolo-trietilene glicole (Chol-TEG) (5&cent;-GCTTCCGAAGGTCGA-3&cent;)</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019260</td><td>&ge; 99,8%</td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Istituto di Microelettronica dell'Accademia Cinese delle Scienze</td><td>KW-4A</td><td>Per la preparazione di film ploymer&nbsp;</td></tr><tr><td>Profilatore a gradini</td><td>Veeco</td><td>DEKTAK 150</td><td>Per la misura dello spessore del film</td></tr><tr><td>Sistema di spettroscopia vibrazionale a somma di frequenza (SFG)</td><td>EKSPLA</td><td></td><td>Un sistema SFG commerciale a picosecondi</td></tr></tbody></table>

strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Come spettroscopia ottica non lineare di secondo ordine, la spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza della somma (SFG) è stata ampiamente utilizzata nello studio di varie superfici e interfacce. Questa tecnica ottica non invasiva può fornire le informazioni locali a livello molecolare con sensibilità monostrato o submonostrato. Qui stiamo fornendo una metodologia sperimentale su come rilevare selettivamente l'interfaccia sepolta sia per le macromolecole che per le biomacromolecole. Con questo in mente, vengono discusse le strutture secondarie interfacciali della fibroina di seta e delle strutture idriche intorno al modello short-chain oligonucleotide duplex. Il primo mostra una sovrapposizione a catena o un effetto di confinamento spaziale e il secondo mostra una funzione di protezione contro gli ioni Ca 2 opiù risultanti dalla sovrastruttura del colonna vertebrale chirale dell'acqua.

Nella parte del coefficiente Fresnel della Sezione Protocollo, abbiamo dimostrato che, teoricamente, è possibile rilevare selettivamente una sola interfaccia alla volta. Qui, sperimentalmente, abbiamo confermato che questa metodologia è fondamentalmente corretta, come illustrato nella Figura 5 e Figura 6.
Figura 5 Mostra la struttura PHEMA interfacciale sepolta dopo l'intrusione dell'acqua con una pellico...

Essendo ampiamente utilizzata, la spettroscopia vibrazionale della generazione di frequenza della somma (SFG) può aiutare a rivelare l'ordine conformazionale della catena e il cambiamento strutturale secondario che avviene nelle interfacce polimeriche e biomacromolecolari.

Strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Gli spettri vibrazionali di generazione della frequenza somma sono montati per studiare le interfacce con la selettività interfacciale. Tuttavia il metodo del coefficiente di Fresnel può aiutare a risolvere l'effetto di interferenza quando esiste un'altra interfaccia. Il principale vantaggio di SFG è la selettività interfacciale e la sensibilità del sottomonostrato.Questa tecnica ottica non invasiva è adatta per investire varie interfacce come interfacce solido-liquido, solido-solido, liquido-liquido, gas solido e gas liquido. Suggeriamo ai principianti di praticare molto il sistema SFG con l'aiuto di esperti in ottica e SFG. Non ci sono scorciatoie.SFG non è stato generalmente riconosciuto come tecnica potente, quindi vorremmo attirare più interesse del pubblico e incoraggiare più ricercatori ad applicare questa tecnica. Per iniziare, preparare circa cinque millilter di una soluzione a due o 4% in peso di poli-2-idrossietile metacrilato o PHEMA in etanolo anidro. Conservare la soluzione in laboratorio tre giorni prima dell'uso.Successivamente, immergere quattro prismi ad angolo retto di fluoruro di calcio di grado IR in toluene anidro di grado analitico per almeno 12 ore. Quindi immergere i prismi in 30 millilter di etanolo e pulire le superfici con cotone sgrassante per circa 10 minuti. Risciacquare il prisma con acqua ultra pura per due minuti e asciugarli con gas azoto.Quindi, posizionare i prismi in un pulitore di plasma di ossigeno ed evacuare la camera. Trattare i prismi con plasma di ossigeno per quattro minuti e conservarli nella camera fino a quando non vengono utilizzati. La preparazione della pellicola deve avvenire entro un'ora dal trattamento al plasma.In questo studio, per rilevare selettivamente l'interfaccia barriera è di grande importanza scegliere lo spessore del film appropriato in base al risultato calcolato del modello del coefficiente di Fresnal. Quando sei pronto per preparare le pellicole PHEMA, fissare un prisma pulito in un porta prisma su uno spin coater e applicare una goccia della soluzione di PHEMA in etanolo sul prisma. Eseguire lo spin coater a 1.500 giri/min per un minuto per preparare il film PHEMA.Rivestire allo stesso modo prismi aggiuntivi trattati con plasma con PHEMA. Ricottura le pellicole in un forno a vuoto impostato a 80 gradi Celsius per almeno 10 ore. Per eseguire l'esperimento posizionare la faccia rivestita PHEMA del prisma in acqua deionizzata.Attendere da 10 a 20 minuti e quindi valutare la struttura PHEMA interfacciale alle interfacce acqua e prisma con una certa spettroscopia di generazione di frequenza. Durante il funzionamento del sistema FGS non lasciare che il fascio di luce venga direttamente negli occhi. Per iniziare a preparare la soluzione di fibroina di seta riscaldare tre litri di carbonato di sodio acquoso molare fino all'ebollizione.Far bollire 7,5 grammi di bozzoli di seta Bombyx mori in questa soluzione mescolando per 30 minuti. Trasferire la materia fibrosa in un contenitore pulito e mescolarla in due o tre litri di acqua deionizzata per otto-10 minuti tre volte per lavare via le molecole di sericina indesiderate. Asciugare la materia fibrosa in un forno a vuoto a 60 gradi Celsius per almeno 15 ore.Successivamente, sciogliere un grammo di fibroina di seta secca e degummed in quattro millilter di bromuro di litio acquoso molare 9.3. Mescolare la soluzione a 60 gradi Celsius per due ore. Quindi posizionare la soluzione di fibroina di seta in un sacchetto di dialisi Daton da 3.500.Dializzare la soluzione contro un litro di acqua deionizzata per tre giorni, cambiando l'acqua tre volte al giorno. Una volta completata la dialisi, conservare la soluzione di fibroina di seta a quattro gradi Celsius. Successivamente, utilizzare i metodi descritti in precedenza per pulire un prisma di fluoruro di calcio e ricoprirlo con una sottile pellicola di polistirolo da una soluzione di polistirolo del 3,5% in peso.Posizionare il prisma rivestito in polistirolo a contatto con la soluzione di fibroina di seta ed esaminare l'interfaccia della fibroina di seta di polistirolo con la spettroscopia SFG. Per iniziare a preparare il duplex oligonucleotide, sciogliere 10 nanomoli dell'oligonucleotide a singolo filamento appropriato in 0,5 millilter di acqua ultrapura. Fai lo stesso per l'oligonucleotide gratuito.Unire le soluzioni per ottenere una soluzione oligonucleotide duplex da 10 nanomoli per millilitro. Quindi combinare due milligrammi di DPPC, due milligrammi di DPPC deuterato e un millilitro di cloroformio per ottenere la soluzione lipidica. Successivamente, pulire e plasma trattare un prisma di fluoruro di calcio come descritto in precedenza.Attacca questo prisma alla stiva del campione di un trogolo di Langmuir-Blodgett. Riempire il trogolo con acqua deionizzata e abbassare una faccia del prisma nel trogolo a un millimetro al minuto. Iniettare diversi microlitri della soluzione lipidica sulla superficie dell'acqua e attendere che la pressione superficiale si stabilizzi a circa 12 millinewton per metro.Quindi iniziare a comprimere il monostrato lipidico a cinque millimetri al minuto. Quando la pressione superficiale raggiunge i 34 millinewton per metro sollevare il prisma dal trogolo a un millimetro al minuto. Preparare quindi 500 microlitri di una miscela della soluzione di oligonucleotide duplex e della soluzione lipidica in un rapporto uno-100 molare.Quindi sostituire il trogolo di Langmuir-Blodgett con un contenitore cilindrico in politetrafluoretilene riempito con acqua deionizzata. Iniettare la miscela lipidica oligonucleotide sull'acqua fino a quando la pressione superficiale raggiunge i 34 millinewton per metro. Mettere la faccia rivestita di monostrato lipidico del prisma a contatto con la miscela lipidica oligonucleotide per formare il campione finale.Valutare i segnali vibrazionali dell'acqua chirale e achirale con spettroscopia FSG. In questo primo esempio, l'interfaccia tra gli idrogel PHEMA e il prisma del fluoruro di calcio ha mostrato chiari picchi bruschi nello spettro SFG. Questo è stato attribuito all'interfaccia liscia tra il fluoruro di calcio e l'idrogel.L'interfaccia tra l'idrogel e l'acqua circostante aveva caratteristiche più ampie e meno intense perché le molecole d'acqua potevano diffondersi nella maggior parte dell'idrogel. Qui, quando la concentrazione di fibroina di seta era al di sopra della concentrazione critica sovrapposta, sono state rilevate strutture secondarie chirali all'interfaccia del polistirolo della soluzione, a meno che il metanolo non sia stato aggiunto come agente induttore. Al di sotto della concentrazione critica sovrapposta, sono stati rilevati segnali SFG chirali anche senza aggiungere metanolo che indica che le strutture secondarie ordinate si sono formate senza assistenza all'interfaccia del polistirolo della soluzione.Nel campione di strato lipidico ancorato oligonucleottide duplex che varia la concentrazione di ioni di calcio non ha avuto alcun effetto significativo sul segnale dell'acqua chirale che corrisponde principalmente all'idratazione successiva della colonna vertebrale chirale nella scanalatura minore. Al contrario, la concentrazione di calcio ha prodotto forti effetti sui segnali dell'acqua achirale che corrispondono principalmente allo strato d'acqua che circonda la catena duplex e il bistrato. Nel complesso questo suggerì che la colonna vertebrale chirale dello strato d'acqua potesse proteggere l'oligonucleotide dagli ioni di calcio.Il calcolo del coefficiente di Fresnel e la scelta di uno spessore del film appropriato possono risolvere i problemi di interferenza. Se la multi-riflessione e la rifrazione sono considerate la giusta distribuzione del campo elettrico alle interfacce può essere regolata. Esistono metodi alternativi che possono essere utilizzati per preparare pellicole sottili con gli spessori desiderati come il rivestimento a gradini e la deposizione chimica di vapore.Rilevare la superficie e le strutture interfacciali relative all'adesione, al merlano, all'attrito e ad altre proprietà può aiutare i ricercatori a comprendere i meccanismi sottostanti e sviluppare nuovi materiali funzionali. Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi in cui è necessario esaminare diverse interfacce. Tuttavia, il mezzo che si desidera propagare i fasci di luce deve essere trasparente.

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Biochimica

I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Qui vi presentiamo un protocollo per misurare la forza di interazione fra una superficie inorganica ben definita e sia peptidi o aminoacidi mediante spettroscopia forza singola molecola utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Le informazioni ottenute dalla misurazione è importante per capire meglio la interfase materiale peptide-inorganico.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

Descriviamo le procedure dettagliate e le strategie per misurare le proprietà meccaniche e percorsi meccanici spiegamento di singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica. Mostriamo anche risultati rappresentativi come riferimento per la selezione e giustificazione delle registrazioni di buona singola proteina molecola.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la struttura e la dinamica di acqua interfaccia su scala atomica, in termini di risoluzione submolecular imaging, manipolazione molecolare e spettroscopia vibrazionale singolo-legame.

La struttura e la dinamica di acqua interfaccia con Tunneling di microscopia e spettroscopia di sondaggio

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

L'attaccamento covalente delle molecole della sonda alle punte a sbalzo a forza atomica (AFM) è una tecnica essenziale per lo studio delle loro proprietà fisiche. Questo ci permette di determinare la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza dei polimeri tramite la spettroscopia a forza singola a singola molecola basata su AFM con elevata riproducibilità.

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

Questo protocollo descrive l'applicazione della microscopia a forza atomica e della spettroscopia infrarossa su scala nanometrica per valutare le prestazioni della spettroscopia infrarossa fototermica su scala nanometrica nella caratterizzazione di campioni multipolimerici tridimensionali.

Progressi nella spettroscopia infrarossa su scala nanometrica per esplorare sistemi polimerici multifase

È stato sviluppato un quadro di imaging iperspettrale rapido e multimodale per ottenere immagini di generazione di somma e frequenza vibrazionale a banda larga (VSFG), insieme a modalità di imaging in campo chiaro, generazione di seconda armonica (SHG). A causa della risonanza della frequenza infrarossa con le vibrazioni molecolari, viene rivelata la conoscenza della morfologia strutturale e mesoscopica microscopica dei campioni consentiti dalla simmetria.

Imaging chimico iperspettrale non lineare multimodale mediante microscopia a scansione lineare con generazione di somma-frequenza vibrazionale

Qui, presentiamo il protocollo per studiare la flessibilità locale e la dinamica delle biomolecole utilizzando l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo a livello di singola molecola in modalità microscopia confocale.

Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate ed esempi per la preparazione del campione, l'acquisizione e l'analisi dei dati per caratterizzare polimeri sintetici con dispersità e gruppi finali variabili utilizzando la spettrometria di massa a tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Metodo MALDI-ToF MS per la caratterizzazione di polimeri sintetici con dispersità e gruppi terminali variabili

Scopri la spettroscopia vibrazionale SFG per analizzare strutture interfacciari di polimeri e biomacromolecole con selettività di interfaccia. Questa tecnica ottica non invasiva rivela ordini conformazionali a livello submonostrato.

Strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma (Video) | JoVE Journal

Strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma

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