Name: In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Impara a eseguire saggi di ubiquitinazione e deubiquitinazione in vitro su istoni nucleosomici purificati. Questo metodo consente di studiare i meccanismi molecolari e identificare potenziali bersagli terapeutici.

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Ringraziamo Diana Adjaoud per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) e Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. è uno studioso senior del Fonds de la Recherchetchedu duébec-Santé (FRQ-S). L.M e N.S.K. hanno una borsa di dottorato dal FRQ-S. H.B ha ricevuto una borsa di studio presso il Ministero dell'istruzione superiore e dalla ricerca scientifica della Tunisia e dalla Fondazione Cole.

1. GSH-agarose Affinity Purification del GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex
<ol><li>Utilizzare il costrutto di espressione batterica pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) per trasformare i batteri BL21 (DE3) (vedere Tabella deimateriali)23. Questo costrutto consente l'espressione del dominio murine RING1B 1-159 fuso al dominio BMI1 1-109 con il tag GST nella backbone pGEX-6P-2.</li>
	<li>Eseguire una coltura di avviamento durante la notte inoculando RIL-batteri esprimendo GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) in 20 mL di mezzo di brodo LB in presenza di 100 g/mL di ampicillina e 50 g/mL chloramphenicol. Incubare agitando a 37 gradi durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere la coltura di avviamento a un pallone da 1 L contenente 500 mL di brodo LB fresco (1/26 diluizione) con ampicillina e incubare la coltura nello shaker a 37 gradi centigradi per 2-4 h.</li>
	<li>
Durante il periodo di incubazione, misurare l'OD a 600 nm con uno spettrometro. Quando la coltura batterica raggiunge 0,6 unità OD a 600 nm, prendere una aliquota da 1 mL in un tubo da 1,5 mL come campione non indotto. Aggiungere al 1 L l'espressione proteica al numero di isopropilei il z-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla coltura da 1 L. Incubare i batteri a 25 gradi centigradi per 6 h durante la notte.
	<ol>
<li>Centrifugare 1 mL di aliquote a 14.000 g per 30 s, scartare il supernatante, rimettere in sospensione il pellet in 200 -L di buffer campione Laemmli, e mantenere per SDS-PAGE e Coomassie blu analisi di induzione delle proteine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire la coltura batterica indotta dal flacone in una bottiglia di centrifugazione pulita e girare verso il basso a 3.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet con 40 mL di PBS freddo e scendere a 3.500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Scartare il supernatante e congelare il pellet a -80 gradi centigradi o procedere al passo successivo. Se le proteine sono indotte al peso molecolare previsto, procedere al passo successivo.</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico in 25 mL di ilttante a freddo A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0,5 mM DTT e 1/100 cocktail anti-proteasi contenenti AEBSF, Aprotin, Bestatin, E-64, Leupeptin e Pepstatin A). Assicurarsi che tutti i batteri pellet è risospeso. PMSF e cocktail anti-proteasi devono essere aggiunti al buffer di lisi, solo al momento della lisi batterica. ATTENZIONE: Tenere sempre il campione sul ghiaccio. NOT:</</c9> Lysozyme a 100 g/mL può essere aggiunto per migliorare la lisi batterica.</li>
	<li>Incubare i batteri lise sul ghiaccio per 15 min. ATTENZIONE: Durante la sonicazione, tenere sempre i campioni sul ghiaccio.</li>
	<li>Durante il periodo della centrifugazione, prendere 500 perline GSH-agarose imballate 50 in un tubo da 15 mL e aggiungere 10 mL di tampone A senza PMSF e anti-proteasi. Mescolare brevemente e girare a 2.500 g per 3 min a 4 gradi centigradi, ripetere questa fase di lavaggio altre due volte e tenere le perline sul ghiaccio.</li>
	<li>Seguendo la centrifugazione lisatea batterica, raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico 50 mL. Prendere un aliquota di 100 ll come lisato totale e aggiungere 100 L di 2x buffer di campione Laemmli per l'analisi SDS-PAGE e Coomassie blue.</li>
	<li>Filtrare il lisato attraverso il filtro di siringa di pori 0,45 m e mescolare con le perline GSH. Incubare a 4 gradi centigradi con agitazione per 5 h. Ruotare le perline a 2.500 x g per 3 min, rimuovere e salvare il supernatante come il flusso attraverso. Lavare le proteine-GSH legato perline 6 volte (5 mL ciascuna) con tampone A contenente cocktail anti-proteasi e PMSF.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline insieme a 10 mL di tampone in una colonna di cromatografia vuota, aggiungere 1,5 mL tampone A contenente 25 mM glutathione, e raccogliere l'elusione per gravità in 1.5 mL microtubi. Ripetere la procedura di eluizione 4 volte. NOT:</</c16> La soluzione stock Glutathione è preparata a 200 mM di concentrazione in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5</li>
	<li>Prendere un'aliquota di 10 gradi da ciascuna delle 4 eluzioni e aggiungere 10 -L di 2x buffer di campione Laemmli. Questi campioni saranno utilizzati per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie per determinare la presenza e la purezza delle proteine purificate. NOT:</</c17> Dopo l'ultima elusione, tenere le perline in tampone a 4 gradi centigradi per il riciclaggio e l'uso futuro.</li>
	<li>Scegli le frazioni eluite che mostrano quantità ragionevoli di proteine purificate per un'ulteriore analisi. Fare piccole aliquote della preparazione. Conservare le proteine purificate in -80 gradi centigradi. Di solito, la concentrazione delle proteine varia da 0,5 g a 2 g per luna e i campioni possono essere conservati in questo stato.</li>
	<li>
FACOLTATIVO: Concentrare il campione o modificare il buffer utilizzando un'unità filtro centrifuga 10K</li>
</ol>2. Purificazione del complesso BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase
<ol><li>Utilizzare i costrutti di espressione batterica pET30a-His-BAP138 e pDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 per trasformare i batteri RIL BL21 (DE3) rispettivamente per la produzione di His-BAP1 e MBP-DEUBAD.</li>
	<li>Eseguire due colture di avviamento notturne separate incubando His-BAP1 e MBP-DEUBAD (ASXL2) esprimendo batteri in 20 mL di brodo LB di mezzo di ampicillina contenente 50 g/mL di chloramphenicol e l'antibiotico corrispondente per ogni plasmide, 100 g/ mL di kanamycin o rispettivamente di 100 g/mL di ampicillina. Mettere sullo shaker a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Eseguire i passaggi da 1.3 a 1.6.</li>
	<li>
Risospendere i batteri pellet in 25 mL di lisi ghiacciata Tan B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM-Mercaptoetanool, 0.2% Triton X-100, 1 mM PMSF e 1/100 cocktail anti-protease). Mescolare volumi uguali del His-BAP1 con le lisate MBP-DEUBAD e incubare sul ghiaccio per 15 min. Sonicato e quindi centrifugare il lisato come indicato nel protocollo 1 (fase 9).
	<ol>
<li>Durante la centrifugazione, preparare 500 perline di agarose Ni-NTA compresse (50% di liquami) lavandole tre volte con buffer B senza PMSF e cocktail anti-proteasi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seguendo la centrifugazione lisatea batterica, raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico 50 mL. Prendere un aliquota di 100 ll come lisato totale e aggiungere 100 L di 2x buffer di campione Laemmli per l'analisi SDS-PAGE e Coomassie blue.</li>
	<li>
Filtrare il lisato attraverso il filtro di siringa di pori 0,45 m e mescolare con le perline Ni-NTA. Incubare a 4 gradi centigradi con agitazione per 5 h. Ruotare le perline a 2.500 x g per 3 min, rimuovere e salvare il supernatante come il flusso attraverso.
	<ol>
<li>Lavare le perline 6 volte (5 mL ciascuna) con il buffer B contenente 20 mMM 1,3-Diaza-2,4 ciclidi (Imidazolo). NOTA: Creare una soluzione stock di 2 M imidazolo a pH 7.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline con 10 mL di tampone in una colonna di cromatografia vuota, aggiungere 1 tampone B contenente 200 mM Imidazole e raccogliere l'eluzione per gravità in microtubi da 1,5 mL contenenti 10 DTT l(500 mM) e 2 EDTA (500 mM , pH: 8). Ripetere la procedura di eluizione 4 volte. Prendere 10 l di ogni frazione di eluizione e aggiungere 10 L di 2x Laemmli buffer campione per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie. Mettere in comune le frazioni eluite desiderate. NOT:</</c11> Tenere le perline in tampone a 4 gradi centigradi per il riciclaggio e l'uso futuro.</li>
	<li>
Diluire il complesso eluito 3 volte con il buffer C (50 mM Tris pH 7.3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF e 1/100 protease inhibitor cocktail) prima dell'incubazione con le perline di amiloaro aga.
	<ol>
<li>Preparare le perline di agarose di amilosio (500 o L imballate) lavandole 2 volte con il tampone C senza aggiungere il PMSF e il cocktail anti-proteasi. Aggiungere le perline all'eluizione diluita e incubare pernottamento a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuga a 2.500 x g per 3 min e mantenere il flusso attraverso. Lavare le perline legate alle proteine con 5 mL di buffer C (5–6x).</li>
	<li>Mantenere il complesso His-BAP1/MBP-DEUBAD purificato sulle perline di agarose amylose nel buffer D (50 m HEPES pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% Glycerol e 1 mM DTT) e conservare a -80 . Prendere 20 l della frazione di perline (soluzione 50% perline) e aggiungere 20 -L di 2x Laemmli buffer campione per l'analisi SDS-PAGE e Coomassie blu.</li>
</ol>3. Purificazione dei Nucleosomes dalle cellule HEK293T
<ol><li>Coltura HEK293T cellule in completo Dulbecco modificato mezzo di Eagle (DMEM) integrato con 5% neonatale siero vitello (NBS), 2 mM L-glutamina, e 1% penicillina / streptomicina.</li>
	<li>Piatto intorno 12 x 106 cellule HEK293T in 20 mL di supporti completi per piatto di coltura 15 cm un giorno prima della trasfezione (sono stati utilizzati 10 piatti). Prima della trasfezione, modificare il mezzo della cellula a 12 mL di mezzo senza sieri e trasfecare le cellule con 21 g di pCDNA-Flag-H2A utilizzando 63 l di polietilenimina (PEI) a 1 mg/mL36. Passare al supporto completo 12 h in un secondo momento.</li>
	<li>Tre giorni dopo la trasfezione, lavare le cellule con 15 mL di PBS ghiacciato (due volte) e raccoglierle in 3 mL di PBS ghiacciate utilizzando un raschietto cellulare. Centrifuga a 2.100 x g per 8 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il PBS e procedere al passo della lisi o congelare il pellet cellulare a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 10 volumi di buffer E (50 mM MM Tris-HCl pH 7.3, 420 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 1/100 proteasi inhibitor cocktail, e 20 mM di N-methylmaleimide (NEM)) e incubare su 20 m. N-metilmaleimide (NEM) è fondamentale per inibire i DUB che co-purificano con i nucleosomi.</li>
	<li>
Dopo la centrifugazione a 3.000 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet cromatina in 10 volumi di tampone E. Mix per inversione e centrifuga a 3.000 x g per 5 min.
	<ol>
<li>Ripetere la fase di lavaggio un'altra volta utilizzando il buffer E e due volte utilizzando il buffer F "MNase Buffer" (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,3 M di saccarosio, 0,1% NP-40, 1 mM PMSF e 1/100 proteasi inibitore cocktail). AMMONImento: Pellet fluttuerà durante i fusti e la centrifugazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere la cromatina in un buffer F da 5 mL e trattare il pellet con nucleale micrococcale (MNase) (3 U/mL per 10 min a temperatura ambiente). NOT:</</c15> La reazione può essere aiutata mescolando utilizzando un Omogenizer Dounce.</li>
	<li>
Dopo l'incubazione, prendi un 40 o Ll della miscela per l'analisi dei frammenti di DNA nucleosomico. Mescolare questa aliquota con 40 lun di Phenol/cloroformio e 20 -L di 6x tamburo di carico del DNA, vortice, girare a 18.000 x g per 2 min, e caricare il DNA su un gel di agarose 2%.
	<ol>
<li>Quando il DNA è prevalentemente un frammento di 147 bp corrispondente ai mononucleosomi, arrestare la reazione aggiungendo 5 mM EDTA alla concentrazione finale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la centrifugazione a 21.000 x g per 20 minuti a 4oC, incubare la frazione di cromatina solubile con resina anti-bandiera durante la notte a 4 gradi centigradi. Lavare le perline con 6x Buffer G (50 mM Tris-HCl, pH 7.3, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1/100 cocktail di inibitori proteasi).</li>
	<li>Trasferire le perline con buffer G da 5 mL in una colonna di cromatografia vuota. Elutare i nucleosomi legati alle perline con 200 g/mL di peptide di eluizione Flag. Utilizzare un buffer di elusione composto da un buffer G contenente 200 peptidi di eluizione del flag g/mL (vedere Tabella dei materiali) e 1/5 (vol:vol) 1 M Tris, pH 8.0. Elutizzare i nucleosomi 3x con 260 buffer di eguagliazione flag (2 h ogni eluizione).</li>
	<li>Testare le 3 eluzioni prendendo un per l'estrazione del fenolo-cloroformio e caricare il DNA in un gel di aliquota agarose del 2%. Prendere 10 l di ogni frazione di eluizione e aggiungere 10 L di laemmli buffer campione 2x per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie e caricare ogni elusione per il rilevamento Western Blot di H2A onniquiterato. Conservare l'eluizione a -80 gradi centigradi. In generale, la purificazione dalle cellule umane produce una quantità inferiore di proteine rispetto a quella dei batteri, con concentrazioni che vanno da 0,1 a 0,5 g/l.</li>
</ol>4. Nucleosome Ubiquitination Assay Using BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase Complex
<ol><li>Centrifugare i nucleosomi attraverso 10K poro 0,5 mL filtri centrifughi per cambiare il substrato dal buffer di eluzione al buffer di reazione H (25 mM Tris, pH 7.5; 10 mM MgCl2e 5 mM ATP). In alternativa, i nucleosomi disponibili in commercio possono essere utilizzati per il saggio. NOT:</</c2> La modifica della soluzione di sospensione del substrato al buffer di reazione garantisce la riproducibilità e previene la potenziale inibizione delle ligasi E3 da parte dei composti presenti nella miscela di elusione della bandiera.</li>
	<li>Incubare 1 g di nucleosomi in 40:L volume totale del buffer H. Aggiungere gli enzimi Ub Activating Enzyme (UBE1) (250 ng), Ub (50 ng/L) e gli enzimi coniugati E2 Ub-coniugati (672 ng) e 1 g di BMI1/RING1B E3 ubiquitina ligase complesso. Incubare la reazione per 3 h a 37 gradi centigradi con scosse occasionali. NOT:</</c4> Diversi controlli possono essere condotti in parallelo, tra cui l'omissione, E1, E2, E3, ATP e ubiquitina. Ciò garantisce la specificità della reazione di ubiquitinazione.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 40 lofun di 2x laemmli buffer campione e analizzare l'istone H2A K119 ubiquitination by SDS-PAGE e gonfiore occidentale, secondo le procedure standard. Utilizzare gli anticorpi anti-H2A o Anti-H2A K119ub (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>5. In Vitro Nucleosomal H2A DUB Saggio utilizzando BAP1/DEUBAD
<ol><li>Utilizzare i nucleosomi purificati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. Risospendere 100-500 ng di nucleosomi nel buffer I da 40 mM, pH 7,3, 1 mM MgCl2, 50 mM NaCl e 1 mM DTT). Aggiungete 1 g di His-BAP1, purificati dai batteri BAP1 e MBP-DEUBAD. Eseguire la reazione di deubiquitinazione per 3 h a 37 gradi centigradi con scosse occasionali.</li>
	<li>Fermare la reazione in vitro aggiungendo 40 luna di 2x laemmli tampone e analizzare con immunoblotting.</li>
</ol>

<ol><li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+ubiquitin+chains%3A+E2+enzymes+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li>
<li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li>
<li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Ligases%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling%2C+cell+death+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li>
<li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li>
<li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasomes%3A+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li>
<li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense%3A+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li>
<li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li>
<li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li>
<li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li>
<li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li>
<li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li>
<li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li>
<li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li>
<li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li>
<li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%3A+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li>
<li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li>
<li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma%2C+lung+adenocarcinoma%2C+meningioma%2C+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li>
<li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li>
<li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li>
<li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li>
<li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li>
<li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li>
<li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li>
<li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2%2B+flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385(2018).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAP1%2FASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li>
<li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li>
<li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li>
<li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li>
<li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%2FASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292(2016).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ci sono diversi vantaggi di stabilire robusti saggi di ubiquitinazione in vitro e deubiquitinazione per le proteine di interesse. Questi saggi possono essere utilizzati per: (i) stabilire condizioni ottimali e definire requisiti minimi per queste reazioni, (ii) determinare costanti cinetiche e biochimiche enzimatiche, (iii) definire i ruoli dei cofattori o inibitori che possono influenzare queste reazioni, (iv) identificare le interfacce di interazione, (v) testare l'impatto di mutazioni artificiali o associate alla mala...

L'ubiquitinazione è una delle modifiche post-traduzionali più conservate ed è fondamentale per un'ampia varietà di organismi, tra cui lievito, piante e vertebrati. L'ubiquitinazione consiste nell'attaccamento covalente dell'ubiquitina, un polipeptide da 76 amminoacidi altamente conservato, per colpire le proteine e si verifica in tre fasi sequenziali che coinvolgono tre enzimi, vale a dire, l'attivazione di E1, la coniugazione E2 e la ligase1: 2,3. Questa modifica post-traduzionale svolge un ruolo centrale in un ampio spettro di processi biologici. Infatti, i legamenti E3, che forniscono la specificità della reazione, costituiscono una grande superfamiglia di enzimi e sono gli enzimi più abbondanti del sistema di ubiquitina4,5,6. Gli effetti a valle dell'ubiquitinazione proteica dipendono dalla natura della modificazione: monoubiquitinazione, multimonoscanto e poliubiquitinazione lineare o ramificata. La monoubiquitinazione è raramente associata alla degradazione proteasomica, ma questa modifica è coinvolta nella mediazione di vari eventi di segnalazione. La poliubiquitinazione coinvolge i residui di lisina o di lisina nella molecola di ubiquitina stessa, e il destino di una proteina poliubificata dipende da quale residuo è coinvolto nell'estensione della catena di ubiquitina. È noto da tempo che la poliubiquitinazione mediata dalla lisina 48 dell'ubiquitina induce la degradazione proteasomica. Al contrario, la poliubiquitinazione via lisina 63 di ubiquitina è spesso associata all'attivazione della proteina7,8,9. Simile ad altre importanti modifiche post-traduzionali, l'ubiquitinazione è reversibile e la rimozione dell'ubiquitina dalle proteine è garantita da proteasi specifici rivolte deubiquitinase (DUB), che sono emerse come importanti regolatori dei processi cellulari 2 Il nome del sistema , 10. È importante sottolineare che molti DUB sono altamente specializzati e regolano, attraverso la deubiquitinazione, substrati specifici, indicando che un sottile equilibrio tra ubiquitazione e deubiquitinazione è fondamentale per la funzione proteica. Gli E3 e i DUB, insieme ai meccanismi proteasomeri di degradazione e ai fattori accessori, formano il sistema Ubiquitin Proteasome System (UPS, con geni >1200) che regola i principali percorsi di segnalazione, molti dei quali sono associati alla crescita cellulare e alla proliferazione, determinazione del destino cellulare, differenziazione, migrazione cellulare, e la morte delle cellule. È importante sottolineare che la deregolazione di diverse cascate di segnalazione che coinvolgono l'ubiquitazione promuove la tumoralgenesi e le malattie di neurodegenerazione5,11,12,13, 14.
L'ubiquitazione svolge ruoli pervasivi nella biologia della cromatina e nei processi dipendenti dal DNA15,16,17. Per esempio, la monoubiquitinazione dell'istono H2A sulla lisina 119 (qui dopo H2A K119ub) è una modifica fondamentale post-traduzionale coinvolta nella repressione trascrizionale e nella riparazione del DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub è catalizzato dal Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), che svolge un ruolo chiave nel mantenimento delle informazioni epigenetiche ed è altamente conservato dalla Drosophila all'uomo. Canonical PRC1 è costituito in particolare dal RING1B e BMI1, che sono il complesso principale E3 ubiquitin ligase responsabile del suddetto evento di ubiquitinazione22,23. In Drosophila, la monoubiquitinazione H2A (H2A K118ub che corrisponde a H2A K119ub nei mammiferi) è invertita dal DUB Calypso, che interagisce con Additional Sex Comb (ASX) formando il complesso DUB policomb-repressivo (PR-DUB)24. L'ortologo mammifero di calypso, BAP1, è un soppressore tumorale cancellato o inattivato in varie neoplasie umane25,26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33.BAP1 regola i processi dipendenti dal DNA nel nucleo e l'apoptosi mediata dalla segnalazione del calcio al reticolo endoplasmico33,34,35,36, 37 Mi lasa' di , 38 Mi lasa , 39 mila: l'altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 42. BAP1 assembla complessi proteici multi-subunità contenenti regolatori di trascrizione in particolare ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (ASXL), tre ortologhi di ASX38,43. Gli ASXL utilizzano il dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), anche chiamato dominio ASXM, per stimolare l'attività BAP1 DUB35,36,44. Quindi, gli ASXL svolgono un ruolo importante nel coordinare l'attività di BAP1 DUB alla cromatina e più in generale la sua funzione di soppressore tumorale.
Esistono diversi metodi per studiare i processi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. In particolare, i saggi biochimici che utilizzano proteine purificate dai batteri rimangono molto potenti nel dimostrare l'ubiquitinazione diretta o la rimozione dell'ubiquitina da substrati specifici. Questi esperimenti possono essere condotti per studiare una serie di parametri come la determinazione del requisito di complessi minimi, la determinazione della cinetica delle reazioni, la definizione delle relazioni struttura/funzione e la comprensione dell'impatto mutazioni genetiche. Qui, forniamo protocolli per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione su substrati di cromatina con componenti purificati. Come sistema modello, viene presentata l'ubiquitinazione in vitro e la deubiquitinazione della proteina H2A nucleosomica. Le proteine purificate dai batteri assemblate in complessi minimi di RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD vengono utilizzate rispettivamente per l'ubiquitinazione o la deubiquitinazione del nucleosomal H2A.

<table><tbody><tr><td>Perle di agarosio amilosio</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL filtri centrifughi 10K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#8240</td><td></td></tr><tr><td>Perline di agarosio anti-bandiera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A4596</td><td></td></tr><tr><td>cocktail anti-proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#P8340</tr><tr><td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL batteri</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>#230240</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Colonna cromatografica vuota</td><td>Biorad</td><td>#731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Flag peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F3290</td><td></td></tr><tr><td>Perle di GSH-agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G4510</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>#CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I5513</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasi micrococcica (MNasi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N3755</td><td></td></tr><tr><td>Perle di agarosio Ni-NTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#88221</td><td></td></tr><tr><td>N-metilmaleimmide (NEM)</td><td>Bioshop</td><td>#ETM222</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa per pori 0,45 &mu; m</td><td>Sarstedt</td><td>#83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Polysciences Inc</td><td>#23966-1</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td><td>Addgene</td><td>#63139</td><td></td></tr><tr><td>Enzima attivante Ub (UBE1)</td><td>Boston Biochem</td><td>#E-305</td><td></td></tr><tr><td>UBCH5C (UBE2D3)</td><td>Boston Biochem</td><td>#E2-627</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ubiquitination e deubiquitination saggi di istoni nucleosomici

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante in vari percorsi di segnalazione ed è particolarmente coinvolta nel coordinamento della funzione della cromatina e dei processi associati al DNA. Questa modifica comporta un'azione sequenziale di diversi enzimi, tra cui E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjuging e E3 ubiquitin-ligase ed è invertita da deubiquitinaes (DUB). L'ubiquitinazione induce la degradazione delle proteine o l'alterazione della funzione proteica, compresa la modulazione dell'attività enzimatica, l'interazione proteina-proteina e la localizzazione subcellulare. Un passo fondamentale nella dimostrazione dell'ubiquitinazione proteica o della deubiquitinazione è quello di eseguire reazioni in vitro con componenti purificati. Un'efficace ubiquitinazione e reazioni di deubiquitinazione potrebbero essere fortemente influenzate dai diversi componenti utilizzati, dai co-fattori enzimatici, dalle condizioni di buffer e dalla natura del substrato.  Qui, forniamo protocolli passo-passo per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Illustriamo queste reazioni utilizzando componenti minimi del mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, un E3 ubiquitin ligase che monoubiquizza istone H2A sulla lisina 119. La deubiquitinazione del nucleosomal H2A viene eseguita utilizzando un complesso minimo Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) formato dal deubiquitinase BAP1 umano e dal dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) del suo co-fattore ASXL2. Questi saggi di ubiquitinazione/deubiquitinazione possono essere condotti nel contesto di nucleosomi ricombinanti ricostituiti con proteine purificate dai batteri o nucleosomi nativi purificati dalle cellule dei mammiferi. Mettiamo in evidenza la complessità che può avere un impatto significativo su queste reazioni e proponiamo che i principi generali di questi protocolli possano essere rapidamente adattati ad altri legamenti e deubiquitinasi E3.

Le proteine GST-BMI1 e RING1B sono ben prodotte nei batteri e possono essere facilmente estratte nella frazione solubile. La figura 1A mostra una colorazione blu Coomassie per una tipica purificazione del complesso GST-BMI1-RING1B. Le bande GST-BMI1 e RING1B migrano al peso molecolare previsto, rispettivamente 45 kDa e 13 kDa. In particolare il complesso della ligia E3 è altamente omogeneo con livelli molto bassi di contaminanti proteici batterici e/o prodott...

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Data la complessità delle reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione all'interno delle cellule è importante stabilire saggi in vitro con componenti purificati definiti. Questo aiuta a comprendere i meccanismi di ubiquitinazione e deubiquitinazione e anche a determinare come le mutazioni associate ai geni che codificano gli enzimi responsabili di questa reazione possono causare malattie umane. Possiamo identificare i domini e i motivi in questi componenti che guidano queste reazioni.Possiamo anche sviluppare test dello schermo ad alta produttività che possono essere utilizzati per lo schermo per inibitori di piccole molecole che possono essere sviluppati come potenziali terapie. Per iniziare la lisi batterica, aggiungere PMSF e cocktail antiproteasi nel tampone di lisi ghiacciata A.Aggiungere 25 millilter del tampone di lisi A nella bottiglia contenente pellet batterico e rimescolare il pellet. Trasferire il lisato contenente batteri in un tubo per la sonicazione.Utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare il lisato con un'ampiezza di uscita del 70% per 30 secondi, da quattro a cinque volte. Quindi centrifugare a 21.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver incubato il batterio lisciviato con perline GSH per cinque ore secondo il manoscritto, trasferire le perline insieme a 10 millilter di tampone in una colonna cromatografica vuota.Quindi, aggiungere 1,5 millilter di tampone A contenente 25 glutatione millimolare nella colonna e raccogliere l'eluizione per gravità in microtubi da 1,5 millilitri. Ripetere la procedura di eluizione quattro volte con tampone fresco A un trattamento continuo delle frazioni eluizzate secondo il manoscritto. Per iniziare, rimescolare il pellet batterico His-BAP1 e MBP-DEUBAD in 25 millilter di tampone di lisi ghiacciata B.Mescolare 25 millilter di ogni lisato e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.Sonicare e poi centrifugare il lisato a 21.000 volte g per 20 minuti. Dopo la centrifugazione del lysate, filtrare il lysate attraverso un filtro siringa a poro da 0,45 micrometri in una bottiglia e mescolarlo con le perline Nickel NTA. Incubare a quattro gradi Celsius tremando per cinque ore.Dopodi tempo, gira giù per le perline a 25.000 volte g per tre minuti. Utilizzare una pipetta per salvare il supernatante in un tubo da 50 millilitri man mano che il flusso scorre. Lavare le perline con cinque millilter di tampone B, contenenti 20 imidazolo millimolare, sei volte con centrifuga di tre minuti.Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le perline con 10 millilter di tampone B in una colonna cromatografica vuota e aggiungere un millilitro di tampone B contenente 200 millimolare imidazolo. Raccogliere l'eluizione per gravità in microtubi da 1,5 millilitri contenenti DTT ed EDTA. Ripetere la procedura di eluizione quattro volte e mettere in comune le frazioni eluizzate desiderate in un tubo da 15 millilitri.Aggiungere il buffer C per diluire il complesso eluitato tre volte. Quindi trasferire l'eluizione diluita alle perline di amilosio preparate in tubi e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Al mattino, centrifuga i tubi a 2.500 volte g per tre minuti e mantieni il supernatante in un tubo da 15 millilitri mentre fluiscono.Lavare le perline legate alla proteina con cinque millilter di tampone C per cinque o sei volte. Aggiungere quindi 500 microlitri di tampone D al complesso Depurato His-BAP1/MBP-DEUBAD sulle perline di agarosio amilosio per creare una soluzione di tallone al 50%. Trasferire 20 microlitri della soluzione di perline al 50% su un tubo di microcentrifugo e aggiungere 20 microlitri di tampone campione Laemmli due volte per l'analisi blu SDS-PAGE e Coomassie.Conservare la soluzione di perline rimanente a meno 80 gradi Celsius per un utilizzo futuro. Dopo aver coltura le cellule HEK293T, placcare 12 milioni di cellule in 20 millilter di mezzi completi in un piatto di coltura di 15 centimetri, un giorno prima della trasfezione. Dopo un giorno, sotto la cappa di coltura cellulare, aspirare i mezzi e fornire 12 millilter di mezzi senza siero.Trasfetto le cellule con 21 microgrammi di pCDNA flat-H2A utilizzando 63 microlitri di PEI a un milligrammo per millilitro. Dopo 12 ore, passare al mezzo completo. Dopo aver raccolto le cellule secondo il manoscritto, rimescolare il pellet cellulare in circa 10 volumi di tampone E contenente NEM per inibire le deubiquitinasi e si incuba sul ghiaccio per 20 minuti.Dopo la centrifugazione a 3.000 volte g per cinque minuti, scartare il supernatante. Lavare il pellet di cromatina due volte con 10 volumi di tampone E prima e poi lavare due volte con tampone F.Resuspend la cromatina in cinque millilter del tampone F e trattare il pellet con nucleasi micrococcica alla concentrazione di tre unità per millilitro per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, trasferire un'aliquota di 40 microlitri della miscela in un tubo da 1,5 millilitri per l'analisi di frammenti di DNA nucleosomico.Aggiungere 40 microlitri di fenolo-cloroformio e 20 microlitri di tampone di carico del DNA sei volte superiore. Vortice e rotazione a 18.000 volte g per due minuti. Quindi trasferire 15 microlitri della fase acquosa in un gel di agarosio al 2% per caricare il DNA.Dopo aver interrotto la reazione e la centrifugazione secondo il manoscritto, incubare la frazione solubile di cromatina con perline di resina anticarro in un tubo da 15 millilitri durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Lavare le perline sei volte con tampone G.Trasferire le perline con cinque millilter di tampone G in una colonna cromatografica vuota. Diluire i nucleosomi legati del tallone con 260 microlitri di tampone G contenenti 200 microgrammi per millilitro di peptide di eluizione della bandiera e da uno a cinque tris molare a pH otto.Elute i nucleosomi tre volte, un'ora nella stanza fredda. Per eseguire il test di ubiquitinazione, aggiungere prima un microgrammo dei nucleosomi purificati in 40 microlitri di tampone H.Successivamente, aggiungere una miscela di soluzione enzimatica contenente 250 nanogrammi di UBE1, 672 nanogrammi di enzimi coniuganti UB ed E2 UB e un microgrammo di complesso di ubiquitina ligasi BMI1-RING1B E3 nel tubo. Incubare la reazione per tre ore a 37 gradi Celsius con occasionali scosse.Interrompere la reazione aggiungendo 40 microlitri di due volte Laemmli Sample Buffer e analizzare l'ubiquitinazione dell'istono H2AK119 mediante macchia occidentale. Per eseguire il saggio di deubiquitinazione in vitro riprendo i nucleosomi purificati in 40 microlitri del tampone I e un microgrammo di batteri purificavano le perline His-BAP1/MBP-DEUBAD. Posizionare il tubo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre ore per eseguire la reazione di deubiquitinazione con agitazioni occasionali.Quindi interrompere la reazione aggiungendo 40 microlitri di tampone Laemmli due volte e analizzare mediante immunoblotting. In questo esperimento, la colorazione blu coomassie per una tipica purificazione del complesso GST-BM1-RING1B usando perline di affinità GST, mostra che le bande migrano al peso molare previsto rispettivamente intorno a 45 kilodalton e 13 kilodalton. Allo stesso modo, la purificazione del complesso His-BAP1 MBP-DEUBAD ha anche portato a preparazioni omogenee relativamente elevate con bande rispettivamente di circa 90 kilodalton e 55 kilodaltoni.D'altra parte la frazione nucleosomica purificata è essenzialmente composta da una banda di 147 coppie di basi che indica la presenza di frazione mononucleosomiale altamente arricchita. La colorazione blu coomassie dei nucleosomi purificati mostra un tipico modello a banda delle quattro subunità istono con quantità stechiometriche. L'ubiquitinazione dell'istone H2A con il complesso BMI1-RING1B mostra un aumento dipendente dal tempo della forma ubiquitinata della proteina mentre i livelli della forma non modificata sono concomitanti diminuiti.La reazione di ubiquitinazione è totale in quanto praticamente tutte le proteine H2A vengono trasformate in H2A K119ub. D'altra parte, il saggio di deubiquitinazione è stato condotto nucleosomi nativi. Dopo l'incubazione di questi nucleosomi con BAP1-DEUBAD è stata osservata una riduzione dipendente dal tempo del segnale H2A K119ub.Il successo delle reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione dipende dal modo in cui la proteina viene purificata. Abbiamo bisogno di una buona resa e l'uso tampone per la resuspensione e la purificazione delle proteine dovrebbe essere compatibile con le reazioni biochimiche. Quando questi test di ubiquitinazione e deubiquitinazione sono ben consolidati, possiamo testare gli attivatori e gli inibitori dell'effetto delle mutazioni geniche associate alla malattia.Questo metodo è stato stabilito con il contributo di diversi laboratori e sono molto utili per comprendere i meccanismi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Diverse sostanze chimiche sono pericolose e devono essere manipolate nel cofano. Questo include fenolo-cloroformio, acidi, basi e agenti riducenti.

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