Name: Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dellinfezione intranasale dellimmunosoppressione indotta dalla sepsi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Impara a creare un modello di doppio colpo con legatura e puntura cecale e infezione intranasale nei topi. Questo metodo consente di studiare le infezioni secondarie in condizioni di immunosoppressione indotta dalla sepsi.

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Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 a M. W. Le strutture principali dell'Università del Dakota del Nord sono state supportate da sovvenzioni NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Key Program of National Nature Science Foundation of China (81530063) a Jianxin Jiang. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Marvin Leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) per aver fatto il video.

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali da parte dell'Università del Dakota del Nord (IACUC).
1. Legatura e puntura Cecal
NOTA: I topi femminili C57BL/6 (peso, 18-22 g; età, 6-8 settimane) sono suddivisi in sei gruppi: gruppo di controllo (Ctrl), gruppo di infezioni (SA per S. aureus),due gruppi fittizi e due gruppi CLP. Gli animali Ctrl vengono lasciati senza intervento chirurgico e lesioni secondarie alle infezioni. Gli animali SA sono sottoposti a infezione polmonare S. aureus senza l'operazione. Gli animali operati da ham subiscono la stessa laparotomia con un'esposizione del cecum (tranne che il cecum non è né legato né forato). Otto topi per gruppo vengono utilizzati per l'analisi della sopravvivenza e da tre a cinque topi vengono utilizzati per la valutazione dell'infiammazione in vari momenti.
<ol><li>Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i materiali autoclaving per 20 min. Pulire e disinfettare la tabella operatoria con salviette disinfettanti. Per stabilire condizioni sterili durante l'intervento chirurgico, coprire tutti i campi operativi con tende chirurgiche sterili appropriate, e indossare una copertura per capelli, maschera chirurgica, occhiali protettivi, abito chirurgico, e guanti sterili.</li>
	<li>Pesare e anestesizzare il topo utilizzando 0,1 mL/topo di ketamina (80 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) miscela somministrata intraperitonealmente. Con il pollice e l'indice della mano sinistra che formano una posizione a forma di U, avvicinati al collo del mouse da dietro senza intoppi e delicatamente, quindi tieni il collo immediatamente dietro le orecchie in modo che la testa del topo sia altamente contenuta. Utilizzare un mignolo per tenere la gamba posteriore destra del mouse e utilizzare il medio e l'anulare (tutte le dita dalla mano sinistra) per tenere il corpo.</li>
	<li>Controllare l'intensità dell'anestesia da pizzico di punta fino a quando non si flette l'estremità.</li>
	<li>Rasare i quadranti inferiori dell'addome utilizzando un rasoio elettrico e disinfettare l'area con iodio.</li>
	<li>Posizionare il mouse sulla superficie sterile in posizione supina, con la testa orientata lontano dall'operatore. Drappo il mouse con asciugamano sterile con foro sopra l'incisione chirurgica prevista per mantenere campi sterili.</li>
	<li>Fare un'incisione longitudinale della pelle (circa 0,5 cm di lunghezza) con un bisturi nell'addome inferiore sinistro. Utilizzare piccole forbici per estendere l'incisione (1-2 cm). AVVISO: Fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale.</li>
	<li>Fare l'incisione intramuscolare per ottenere l'accesso nella cavità peritoneale e consentire l'esposizione del cecum con l'intestino adiacente.</li>
	<li>Isolare il cecum sul lato sinistro dell'addome (nella maggior parte dei casi, questo viene fatto utilizzando pinze anatomiche smussate) e rimuoverlo su un drappo sterile, lasciando l'intestino piccolo e grande nella cavità peritoneale. AVVISO: Evitare di danneggiare i vasi sanguigni mesborici.</li>
	<li>Ligate il cecum nella posizione distale 25% per creare un'infezione prolungata con mortalità relativamente bassa. AVVISO: Assicurarsi di non legate la valvola ileocecal.</li>
	<li>Perforare il cecum con un 21 G 1 1/2 ago per singola foratura attraverso-e-through (due fori) a metà strada tra la legatura e la punta del cecum nella zona meno vascolarizzata. AVVISO: Assicurarsi di non forare i vasi sanguigni.</li>
	<li>Rimuovere l'ago. Estrudere delicatamente una piccola quantità di feci dai fori di penetrazione per garantire la perforazione a pieno spessore. AGGIORNAMENTO: Fare attenzione a non ostacolare la continuità intestinale durante la procedura.</li>
	<li>Sostituire il cecum nella cavità addominale.</li>
	<li>Chiudere l'addome in due strati con suture chirurgiche in nylon 4-0. Chiudere la muscolatura addominale applicando semplici suture di corsa e chiudere la pelle applicando semplici suture interrotte. Pulire la pelle con iodio.</li>
	<li>Iniettare 1 mL di soluzione salina normale (NS) sterile preriscaldata (37 gradi centigradi) sulla schiena sottocutaneamente per sostituire la terza perdita di spazio e posizionarla su un cuscinetto caldo per recuperarla.</li>
	<li>Riportare i topi in gabbia in una stanza a temperatura controllata (22 gradi centigradi) con cicli di luce/buio di 12 h e libero accesso al cibo e all'acqua. Monitorare i topi ogni 0,5 ore per almeno 2 h, quindi ogni 6 h per almeno 2 d, quindi ogni 12 h per 3 giorni, o eutanasia quando moribondi per l'analisi di sopravvivenza. NOTA: L'analgesia pre e post-operatoria (buprenorfina, 50 g/kg sottocutaneamente ogni 12 h) è raccomandata per 24 ore prima dell'intervento fino alle 48 ore dopo l'intervento chirurgico9,10.</li>
</ol>2. Infezione polmonare secondaria con S. aureus
NOTA: ad eccezione dei gruppi Ctrl e SA, i mouse sopravvissuti a 3 giorni dopo la CLP nei gruppi sham e CLP devono essere somministrati intranasalmente con 30 - L di una sospensione batterica o NS, rispettivamente. I topi sopravvissuti del gruppo SA devono essere instillati intranasalmente con la sospensione batterica.
<ol><li>Anestesizzare il topo iniettando intraperitonealmente una soluzione di chetamina (45mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) e attendere che il mouse respiri lentamente. L'angolo di puntura tra l'ago e la parete addominale è inferiore a 30 gradi per un'iniezione lenta.</li>
	<li>Con l'aiuto di una micropipetta, instillare lentamente e intranasalmente con 30 -L di 1 x 107 unità formanti colonia (CFU) di S. aureus da aspirare durante l'inalazione. Tenendo il mouse per le orecchie in posizione eretta, diminuire lentamente 2-3 - L di sospensione batterica in entrambe le narici ogni volta. Regolare la velocità di rilascio per consentire al mouse di inalare senza formare bolle e cadere.</li>
	<li>Sollevare il mouse su e giù, con la testa su e la coda verso il basso, per aiutare i batteri a entrare nella trachea. Spostare il mouse rapidamente e fortemente, muovendolo verso il basso delicatamente e lentamente per aumentare la gravità. Ripetere l'instillazione di circa 15x fino a quando tutti i batteri sono inalati, che dovrebbe prendere 10-15 min per ogni topo.</li>
	<li>Posare il mouse sulla schiena e dirigersi verso l'alto sulla biancheria da letto angolata (circa 35 gradi) e guardare il mouse fino a quando il suo respiro torna alla normalità ed è completamente recuperato dall'anestesia e dalle procedure.</li>
	<li>Rimettere il mouse nella gabbia in una stanza a temperatura controllata (22 gradi centigradi) con cicli di luce/buio di 12 h e accesso illimitato al cibo e all'acqua.</li>
	<li>Controllare le condizioni del mouse ogni 2 h per il primo giorno e ogni 12 h in seguito per 4 giorni dopo l'intervento chirurgico. Eutanasia quando moribondo per l'analisi di sopravvivenza o 24 h dopo l'infezione per la valutazione dell'infiammazione.</li>
</ol>3. Parametri analizzati
<ol><li>Sopravvivenza dei topi<ol>
<li>Monitorare i topi per 7 giorni. Eutanasia quando moribonda e generare curve di sopravvivenza utilizzando metodi Kaplan-Meier11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conteggi batterici<ol>
<li>24 h dopo l'iniezione di SA, raccogliere il sangue, il liquido di lavaggio bronchoalveolar (BALF) e il liquido di lavaggio peritoneale (PLF) dai topi. In seguito, aggiungere 100 l diluenti a piastre di agar nutrienti e colture a 37 gradi centigradi per 24 h per determinare la colonia batterica conta11,12,13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citochine NOTA: Le concentrazioni di citochine pro-infiammatorie di IL-1, IL-6 e TNF nel siero e BALF dai topi devono essere valutate utilizzando i kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Coprire la piastra ELISA da 96 pozzetto con 100 gradi di una diversa soluzione di lavoro anticorpale di cattura per eseguire gli standard in duplicati e campioni in triplice copia. Sigillare la piastra e lasciarla per una notte a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Lavare la piastra tre volte con 255 tampone di lavaggio lassista/ello (1x PBS, 0,05% Tween-20).</li>
		<li>Per bloccare l'associazione non specifica, aggiungere 200 l/well diluente. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 h.</li>
		<li>Preparare la soluzione standard: otto diluizioni seriali biduna da 1000 pg/mL.</li>
		<li>Aggiungete 100/pozze l/pozzetto di standard o campioni ai pozzi appropriati e a 100 gradi di diluente ai pozze tè vuoto. Sigillare la piastra e incubare a RT per 2 ore o peruna per una notte a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Lavare la piastra 5x con un buffer da 255 l/benlavare.</li>
		<li>Aggiungete 100 l/po di soluzione di lavoro anticorpale di rilevamento diversa ai pozzi appropriati. Sigillare la piastra e incubare a RT per 1 ora.</li>
		<li>Lavare la piastra 5x con un buffer da 255 l/benlavare.</li>
		<li>Aggiungere 100 l/podi di soluzione HRP diluita a tutti i pozzetto. Sigillare la piastra e incubare a RT per 30 min.</li>
		<li>Lavare la piastra 5x con un buffer da 255 l/benlavare.</li>
		<li>Aggiungete 100 TMB l/ben diluiti. Incubare la piastra lontano dalla luce a RT per 15 min.</li>
		<li>Aggiungete 50 soluzione l/stop ben (1 M H3PO4). Assorbimento in lettura a 450 nm con un lettore di lastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometria di flusso<ol>
<li>Ottenere il numero totale di celle da BALF. Eseguire il lyse degli eritrociti utilizzando il buffer liscitale ACK e lavare 2x utilizzando PBS.</li>
		<li>Analizzare quindi le sospensioni a cella singola per citometria di flusso come descritto in precedenza11. Per la colorazione superficiale, neutrofili macchiati (CD11b-GR-1) con anticorpi APC anti-topo CD11b e gr-1 antitopo (Ly-6G/Ly-6C). Raccogliere un minimo di 3 x 104 cellule vive, non-debris per l'analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Delano, M. J., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system%27s+role+in+sepsis+progression%2C+resolution%2C+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome.</a> Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).</li>
<li>Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).</li>
<li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li>
<li>Reinhart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+Sepsis+as+a+Global+Health+Priority+-+A+WHO+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).</li>
<li>Boomer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+patients+who+die+of+sepsis+and+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure.</a> JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).</li>
<li>Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+immunosuppression%3A+from+cellular+dysfunctions+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li>
<li>Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34 (3), 250-260 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+Modulates+ROS+and+Impacts+Inflammatory+Response+via+IL-17+Signaling+in+Polymicrobial+Sepsis+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice.</a> PLoS Pathogens. 12 (7), 23(2016).</li>
<li>Pu, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+Deficiency+Intensifies+Inflammasome+Activation+and+Pyroptosis+in+Pseudomonas+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis.</a> Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).</li>
<li>Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).</li>
<li>Chin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+approach+to+eradicate+multidrug+resistant+bacterial+infections+while+mitigating+drug+resistance+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset.</a> Nature Communications. 9 (1), 917(2018).</li>
<li>Nascimento, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-33+contributes+to+sepsis-induced+long-term+immunosuppression+by+expanding+the+regulatory+T+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population.</a> Nature Communications. 8, 14919(2017).</li>
<li>Deng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+investigation+on+the+turning+point+of+over-inflammation+to+immunosuppression+in+CLP+mice+model+and+their+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics.</a> International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Come modello standard d'oro per la ricerca sulla sepsi, il CLP ha una combinazione di tre insulti, tra cui il trauma tissutale causato dalla laparotomia, la necrosi dovuta alla legatura del cecum e l'infezione a causa di perdite microbiche che causano peritonite con traslocazione di batteri nel sangue8. Pertanto, CLP imita la complessità della sepsi umana meglio di molti altri modelli. Tuttavia, una delle principali limitazioni dell'attuale modello CLP è l'incapacità di riflettere la fase più prol...

Sepsis avvia un complesso gioco di processi pro-infiammatori e antinfiammatori dell'ospite ed è caratterizzato da una risposta iperinfiammatoria e dalla conseguente disfunzione immunitaria1,2. La sepsi rappresenta una priorità sanitaria globale e causa un elevato numero di decessi nelle unità di terapia intensiva (ICU)3. Si stima che l'incidenza della sepsi superi i 30 milioni di casi in tutto il mondo all'anno, con tassi di mortalità fino al 30% nonostante i progressi nella gestione delle unità di terapia intensiva4,5. Nel 2017, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha adottato una risoluzione per migliorare la prevenzione, la diagnosi e la gestione di questa malattia mortale5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che la morte non deriva da infezione primaria in pazienti settici gravi, ma piuttosto da infezione nosocomiale secondaria (in particolare polmonite) causata dall'immunosoppressione6,7 . Pertanto, è urgente comprendere i meccanismi del perché i pazienti settici sviluppano infezioni secondarie e scoprono trattamenti più efficaci. Qui, viene descritto un doppio modello, noto anche come modello a doppio colpo, per studiare il fenomeno immunosoppressivo che si verifica nei pazienti con sepsi prolungata.
Poiché il modello sperimentale gold standard nella ricerca sulla sepsi polimicrobica, la legatura e la puntura della ceca (CLP) è un intervento chirurgico caratterizzato da legatura e perforazione del cecum, che contribuisce alla peritonite polimicrobica e alla sepsi8,9 . Il processo patofisiologico e i profili di citochina, insieme alla cinetica e alla grandezza, sono simili alla sepsi clinica. La posizione della legatura, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura e il numero di forature del ceca sono fattori importanti che influenzano la mortalità dopo il CLP.
La polmonite nosocomiale è la principale causa di mortalità tra i pazienti gravemente malati di sepsi. Il principale tipo di organismi che causano sepsi grave sono lo Staphylococcus aureus (20,5%), le specie Pseudomonas (19,9%), le Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) e i funghi (19%). Nel frattempo, studi recenti hanno suggerito una crescente incidenza di organismi gram-positivi, che ora sono quasi altrettanto comuni delle infezioni gram-negative3.
Il metodo descritto in questo protocollo coinvolge CLP, eseguito come il "primo colpo" per indurre peritonite polimicrobica subletale, che manifesta una condizione di immunosoppressione. La procedura comporta anche la successiva instillazione intranasale di S. aureus come il "secondo colpo" per fornire una piattaforma di ricerca clinicamente rilevante.

<table><tbody><tr><td>21 G 1 &frac12; Ago</td><td>BD</td><td>BD305167</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD11b anti-topo</td><td>Biolegend</td><td>101201</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)</td><td>Biolegend</td><td>108401</td><td></td></tr><tr><td>Topi C57BL/6</td><td>Harlan (Indianapolis)</td><td>C57BL/6NHsd</td><td></td></tr><tr><td>Lampada da tavolo</td><td>Fornitura generale</td><td>Fornitura</td><td></td>generale</tr><tr><td>Salviette disinfettanti</td><td>Clorox</td><td>B07NV5JMCS</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Fornitura generale</td> Kit ELISA <td>di fornitura</td><td></td>generale</tr><tr><td>(mouse IL-1&beta;, IL-6 e TNF&alpha;)</td><td>Invitrogen</td><td>88-7013, 88-7064 e 88-7324</td><td></td></tr><tr><td>Iodio</td><td>Dynarex</td><td></td><td>B003U463PY PVP Salviette di iodio</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>FORT DODGE</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Iniezione di ammina cloridrato Scala</td></tr> di <tr><td>laboratorio</td><td>Fornitura generale</td><td>Fornitura</td><td></td>generale</tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>Genetica molecolare, polvere</td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td>ErgoOne</td><td>7100-1100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale</td><td>Fornitura</td><td></td><td></td>generale</tr><tr><td>Asciugamano polifoderato</td><td>CardinalHealth, Convertors</td><td>3520</td><td>Telo chirurgico, sterile, solo per uso singolo</td></tr><tr><td>Sutura in seta, 4-0</td><td>DAVIS & GECK</td><td>1123-31</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi per piccoli animali</td><td>Fornitura generale Fornitura</td><td>generale Forbici</td><td></td></tr><tr><td>per chirurgia per piccoli animali</td><td>Fornitura generale</td><td>Fornitura</td><td></td>generale</tr><tr><td>Pinza chirurgica per piccoli animali</td><td>Fornitura generale</td><td>Fornitura generale Fornitura</td><td></td> generale</tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>13301</td><td></td></tr><tr><td>Pad caldo</td><td>Fornitura generale</td><td>Fornitura</td><td></td>generale</tr><tr><td>Xilazina</td><td>Alfa Aesar</td><td>7361-61-7</td><td></td></tr></tbody></table>

progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

La sepsi, un'infezione pericolosa per la vita grave e complicata, è caratterizzata da uno squilibrio tra risposte pro e antinfiammatorie in più organi. Con lo sviluppo delle terapie, la maggior parte dei pazienti sopravvive alla fase iperinfiammatoria, ma progredisce verso una fase immunosoppressiva, che aumenta l'emergere di infezioni secondarie. Pertanto, una migliore comprensione della patogenesi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella fase immunosoppressiva durante la sepsi è di enorme importanza. Segnalato qui è un modello per testare i risultati infettivi creando infezioni a doppio colpo nei topi. Una procedura chirurgica standard viene utilizzata per indurre la peritonite polimicrobica mediante legatura e puntura (CLP) e seguita da un'infezione intranasale dello Staphylococcus aureus per simulare la polmonite che si verifica nella soppressione immunitaria che si vede frequentemente in pazienti settici. Questo doppio modello può riflettere lo stato immunosoppressivo che si verifica in pazienti con sepsi prolungata e suscettibilità all'infezione secondaria da polmonite nosocomiale. Quindi, questo modello fornisce un semplice approccio sperimentale per studiare la fisiopatologia della polmonite batterica secondaria indotta dalla sepsi, che può essere utilizzata per scoprire nuovi trattamenti per la sepsi e le sue complicazioni.

A seconda della progettazione e delle procedure sperimentali, i topi C57BL/6 sono stati sottoposti a CLP e, dopo 3 giorni, sono stati somministrati batteri per via intranasale (Figura1). Come mostrato nella Figura 2, i topi hanno cominciato a morire a 12 h dopo l'induzione della peritonite. Due topi del gruppo CLP-SA e tre topi del gruppo CLP-NS sono morti prima dell'instillazione intranasale S. aureus. Nessuna mortalit...

Questo protocollo descrive le tecniche per misurare gli esiti infettivi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella condizione immunosoppressiva, prima istituendo topi di legatura/foratura della ceca e poi sfidandoli con infezioni intranasali creare un modello clinicamente rilevante di sepsi immunosoppressione.

Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Preparare il mouse per l'intervento chirurgico. Radere i quadranti inferiori dell'addome usando un rasoio e disinfettare l'area con iodio. Posizionare il mouse su una superficie di lavoro pulita sulla schiena con la testa rivolta lontano dall'operatore.Fai un'incisione longitudinale della pelle lunga circa mezzo centimetro nell'addome inferiore sinistro. Fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale. Usa piccole forbici per estendere l'incisione di circa uno o due centimetri.Fare un'incisione intramuscolare per ottenere l'accesso alla cavità peritoneale. Nella maggior parte dei casi, il cieco si trova sul lato sinistro dell'addome. Isolare il cieco.Utilizzando forcep smussate e anatomiche, esporre delicatamente e accuratamente il cieco attraverso l'incisione. Il quarto passo è la legazione. La posizione della legatura sul cieco determina il livello di gravità della sepsi.Legare circa il 75% del cieco induce una sepsi grave. Legare il 50% del cieco induce sepsi di medio livello. Mentre legare il 25% o meno del cieco si tradurrà in sepsi minore.Ligate il cieco nella posizione designata. Assicurarsi di non ligare la valvola ileocecale. Il quinto passo è quello di forare il

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il modello murino di legatura del cieco e la puntura come un prezioso strumento per lo studio della sepsi umana.

Legatura del cieco procedura di puntura

Sepsi si riferisce ad una sindrome da risposta infiammatoria sistemica risultante da una infezione microbica, e può essere simulato da una tecnica chirurgica denominata legatura cecale e puntura (CLP). Qui si descrive un metodo per utilizzare CLP-indotta modello animale per lo screening erbe medicinali per gli agenti terapeutici.

Uso di un modello animale di sepsi per valutare nuove terapie a base di erbe

Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP). Attuali protocolli per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi CLP-indotta sono presentati qui: Un protocollo per misurare autofagia utilizzando topi (GFP)-LC3, e un protocollo per misurare formazione dell'autofagosoma mediante microscopia elettronica.

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Questo protocollo fornisce i passaggi necessari per stabilire e valutare il sepsis neonatale in 7 giorno-vecchi topi.

Un modello di Mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale

L'infezione di topi neonatale con bioluminescente E. coli O1:K1:H7 provoca un'infezione settica con significativa infiammazione polmonare e patologia polmonare. Qui descriviamo le procedure per modellare e studiare ulteriormente la sepsi neonatale utilizzando l'imaging intravitale longitudinale in parallelo con l'enumerazione dei fardelli batterici sistemici, la profilazione infiammatoria e l'istopatologia polmonare.

Un modello di imaging neonatale di sepsi batterica gram-negativa

Qui, presentiamo un metodo efficace ed efficiente per le iniezioni di vene della coda dei roditori utilizzando un dispositivo di riscaldamento / contenimento dal design unico. Semplificando l'avvio di processi di vasodilatazione e contenimento, questo protocollo consente iniezioni endovenose accurate e tempestive di grandi gruppi di animali con un disagio minimo.

Un dispositivo di riscaldamento / contenimento contemporaneo per iniezioni efficienti della vena della coda in un modello di sepsi fungina murina

Questo protocollo presenta i dettagli operativi della legatura e puntura cecale (CLP) in un modello murino di sepsi. Il CLP è una delle tecniche più utilizzate per creare un modello animale di sepsi. Pertanto, è necessario un protocollo CLP standardizzato per il raggiungimento di risultati di ricerca affidabili.

Valutazione di un biomarcatore affidabile in un modello murino di sepsi indotta da legatura cecale e puntura

Questo articolo descrive un nuovo modello murino per la transizione dello pneumococco da colonizzatore asintomatico a patogeno che causa malattie durante l'infezione virale. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare le interazioni polimicrobiche e ospite-patogeno durante le diverse fasi della progressione della malattia e tra vari ospiti.

Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno in seguito a co-infezione virale ricapitola la malattia esacerbata dall'età

Qui presentiamo un protocollo per stabilire un modello di immunosoppressione per la sepsi del topo tramite instillazione intranasale di Klebsiella pneumoniae e convalidiamo il modello attraverso vari indicatori.

Stabilimento di un modello di immunosoppressione indotta dalla sepsi nel topo tramite instillazione intranasale di batteri

Un recente sviluppo di particelle romanzo agglutinazione (PA) test utilizzando molecola recettore del virus ha permesso l'identificazione rapida e facile dei poliovirus (PV). In questo articolo mostreremo la procedura per il saggio PA per l'identificazione fotovoltaico.

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

Impara a creare un modello di doppio colpo con legatura e puntura cecale e infezione intranasale nei topi. Questo metodo consente di studiare le infezioni secondarie in condizioni di immunosoppressione indotta dalla sepsi.

Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dellinfezione intranasale dellimmunosoppressione indotta dalla sepsi (Video) | JoVE Journal

Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi

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