Misurazione diretta del coinvolgimento target KDM1A utilizzando Immunoassays basate su Chemoprobe

La valutazione dell'impegno target, cioè l'interazione di un farmaco con la proteina per cui è stato progettato, è un requisito di base per l'interpretazione dell'attività biologica di qualsiasi composto nello sviluppo di farmaci o in progetti di ricerca di base. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la misurazione diretta dell'effetto di dose e della dinamica dell'innesto bersaglio di KDM1A, piuttosto che misurazioni di effetti a valle come segni istoni ed espressione. Questa tecnica può essere applicata nella ricerca di base e anche negli studi clinici, nel SNC oncologico o in altre malattie soggette a trattamento con inibitore KDM1A per studiare farmacodinamica.

Questa tecnica si basa su una chemioprobe sviluppata per studiare ORY-1001, iadademstat, ma può essere realmente utilizzata per altri inibitori del KDM1A e la strategia può essere applicata ad altri obiettivi. La procedura sarà dimostrata da Raquel Ruiz, responsabile operativo della piattaforma di scoperta PK/PD del mio laboratorio. Durante il trattamento cellulare con ORY-1001 il composto si lega alla proteina KDM1A presente nel nucleo.

Per iniziare questa procedura, recuperare un'aliquota singola da 10 microlitri di soluzione di magazzino OG-881 a sonda biotilata millimolare dal frigorifero e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzando un micropipeto con punte filtranti, diluire in serie la soluzione stock per preparare la soluzione di lavoro a due micromolari. Quindi, sciogliere una compressa di inibitore della proteasi in un millilitro di PBS in un tubo di microcentrifugo.

Per ogni millilitro del volume desiderato di tampone di lysis cellulare 1x con la chemioprobe, mescolare 100 microlitri di tampone di lysi cellulare ottenuto commercialmente, 150 microlitri dell'inibitore della proteasi 10x, 12,5 microlitri della soluzione di lavoro micromolare OG-881 e 737,5 microlitri di acqua distillata doppia di tipo 1. Le cellule vengono liscive in tampone di lisi 1x in presenza della chemioprobe che si lega a qualsiasi proteina KDM1A libera. Per prepararsi dai tessuti, utilizzare un mortaio e un pestello che vengono refrigerati sul ghiaccio secco per polverizzare e omogeneizzare un pezzo di tessuto congelato di un centimetro cubo.

Aliquotare il tessuto in fiale mono-uso, assicurandosi di trasferire circa 40 milligrammi di polvere di tessuto in ogni flaconcino, evitando allo stesso tempo lo scongelamento. Conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'applicazione. Per prepararsi da pellet cellulari, rimescolare il pellet di circa 10 milioni di cellule in 200 microlitri di tampone di lisi cellulare 1x contenente 25 OG-881 nanomolare.

Vortice ogni campione brevemente e tenerli sul ghiaccio per cinque minuti. Utilizzando un sonicatore, sonicare i campioni con tre impulsi a 45 kilohertz della durata di 20 secondi ciascuno. Posizionare i campioni sul ghiaccio per 20 secondi tra gli impulsi.

Tenere i campioni sul ghiaccio per altri cinque minuti. Quindi, vortice brevemente e centrifugare i campioni a 14.000 volte G per 10 minuti in una centrifuga che viene pre-refrigerata a quattro gradi Celsius. L'uso di un micropipetto millilitro trasferisce ogni supernatante in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 millilitri.

Lasciare i tubi sul ghiaccio per due ore prima della lavorazione. Quindi, quantificare la proteina nativa usando il saggio di Bradford come delineato nel protocollo di testo. Una piastra totale è rivestita con anticorpo anti-KDM1A.

La piastra libera è rivestita con streptavidina. Il lisato cellulare viene quindi aggiunto a entrambe le piastre e il complesso KDM1A viene catturato direttamente o attraverso la chemioprobe. Le piastre vengono lavate e incubate con l'anticorpo di rilevamento anti-KDM1A e un anticorpo secondario accoppiato alla perossidasi rafano.

Infine, viene aggiunto un substrato luminescente e generato segnale. Per il KDM1A ELISA totale, preparare 10 millilitri di anticorpo di cattura KDM1A in PBS a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro per ogni piastra. Trasferire 100 microlitri in ogni pozzo della piastra.

Per KDM1A ELISA gratuito, preparare 10 millilitri di streptavidina in PBS come concentrazione di 10 microgrammi per millilitro per ogni piastra. Trasferire 100 microlitri in ogni pozzo della piastra. Quindi, sigillare in alto ogni piastra con pellicola adesiva e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, rimuovere i piatti dal frigorifero e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente per circa 45 minuti. Lavare ogni piastra tre volte con tampone di lavaggio, assicurandosi di toccare la piastra sugli asciugamani di carta dopo ogni fase di lavaggio per rimuovere qualsiasi soluzione residua. Aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco ad ogni pozzo di entrambe le piastre.

Sigillare in alto le piastre con pellicola adesiva e incubare a temperatura ambiente per due ore. Nel frattempo, diluire gli estratti proteici nativi precedentemente ottenuti con PBS alla concentrazione appropriata e disporre la piastra per preparare una curva standard utilizzando rKDM1A umano come delineato nel protocollo di testo. Al termine dell'incubazione di due ore, scartare il tampone di blocco e lavare le piastre con tampone di lavaggio, assicurandosi di toccare la piastra sugli asciugamani di carta dopo ogni fase di lavaggio per rimuovere qualsiasi soluzione residua.

Trasferire i campioni diluiti appropriati in un blocco refrigerato di stoccaggio di pozzi profondi 96 in seguito alla distribuzione delle lastre trovata nella tabella due del protocollo di testo. Mantenere questo blocco sul ghiaccio mentre si pipettano 100 microlitri per pozzo nelle piastre ELISA totali e libere seguendo la distribuzione delle lastre trovata nella tabella tre del protocollo di testo. Incubare a temperatura ambiente per un'ora, quindi scartare i campioni e lavare le piastre cinque volte con tampone di lavaggio.

Preparare 20 millilitri di anticorpo di rilevamento anti-KDM1A del coniglio nel tampone di blocco a una concentrazione di 0,125 microgrammi per millilitro. Aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale di rivelazione a ciascun pozzo di entrambe le piastre, ad eccezione di quelli corrispondenti ai controlli negativi. Sigillare in alto le piastre con pellicola adesiva e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, scartare la soluzione anticorpale di rilevamento e lavare le piastre sei volte con tampone di lavaggio. Preparare 25 millilitri di anticorpo anti-coniglio di capra secondario, HRP, con una diluizione da uno a 5.000 nel tampone di blocco. Aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo delle piastre del microtitolo e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

30 minuti prima della fine di questa incubazione, mescolare parti uguali di esaltatore di luminol e soluzione di perossido in una bottiglia ambrata in condizioni di luce soffaccia. Lasciare questa miscela a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di un'ora, scartare la soluzione anticorpale secondaria e lavare le piastre sei volte con tampone di lavaggio.

Successivamente, pipettare 100 microlitri della soluzione di lavoro del luminol ad ogni pozzo delle piastre, assicurandosi di pipet molto lentamente per evitare la formazione di bolle. Utilizzare un timer per controllare il tempo tra l'aggiunta della soluzione e la misurazione della luminescenza delle piastre e mantenere questo tempo costante per ottenere una buona riproducibilità tra i test. Sigillare in alto le piastre con pellicola adesiva e centrifuga a 500 volte G e a temperatura ambiente per 45 secondi per eliminare eventuali bolle rimanenti.

Incubare le piastre su uno shaker a 100 giri/min per un minuto. Quindi, rimuovere la pellicola adesiva e inserire la piastra in un lettore di micropiastrine e lasciarla per tre minuti per stabilizzare la temperatura a 25 gradi Celsius. Leggere le relative unità di luminescenza di ogni saggio di piastra ELISA.

Salvare e copiare i valori RLU non elaborati dai file del foglio di calcolo dei dati non elaborati per ulteriori analisi. In questo studio, un nuovo ELISA basato sulla cattura di chemioprobe KDM1A viene utilizzato per misurare direttamente l'impegno target KDM1A in cellule e campioni di tessuto. I valori RLU di rKDM1A totali e liberi vengono valutati per verificare la linearità.

I valori RLU del KDM1A totale e libero rilevati nei PBPC umani da tre volontari indipendenti vengono quindi sovrapposti alla curva standard. Le celle AML sono coltivate seguendo le raccomandazioni del fornitore e vengono trattate con veicoli o ORY-1001 a diverse concentrazioni. L'estratto proteico nativo è ottenuto in presenza di chemioprobe OG-881 millimolare e 0,5 microgrammi di proteina totale viene utilizzato per eseguire l'analisi del coinvolgimento target.

Vengono quindi determinati KDM1A totali e gratuiti e vengono calcolate le percentuali di coinvolgimento target da ORY-1001 a KDM1A rispetto al veicolo. L'impegno target KDM1A dose-responsive nei PBBC e nel trattamento polmonare dei ratti con ORY-1001 per gavage orale, calcolato rispetto al gruppo di veicoli è mostrato qui. L'incubazione ex vivo con 25 nanomolare ORY-1001 di estratti di proteine polmonari dagli animali trattati con il veicolo, produce TE completo, ma non aumenta ulteriormente te nei campioni di ratti trattati per quattro giorni con 30 microgrammi per chilogrammo ORY-1001, confermando che KDM1A era già completamente inibito in vivo.

Questo protocollo valuta l'impegno target KDM1A misurando kdm1a gratuito e totale. Ricorda che richiede l'estrazione di proteine native. Questa tecnica può essere utilizzata su campioni di diverse specie per valutare uno specifico inibitore, anche per migliorare la ricerca di nuovi inibitori.

La chemioprobe utilizzata in questo studio può anche essere applicata per la chemioproteomica per studiare l'interactum KDM1A. Ricorda di lavorare in sicurezza e rispettare in ogni momento le misure preventive quando si maneggiano campioni biologici e composti bioattivi come l'inibitore di KDM1A.