Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II
16 giugno 2019
La profilazione proteomica delle proteine tirosine-nitrirate è stata una tecnica impegnativa a causa della bassa abbondanza della modifica 3-nitrotyrosine. Qui descriviamo un nuovo approccio per l'arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi usando Angiotensin II come modello. Questo metodo può essere esteso per altri sistemi in vitro o in vivo.
Questo messaggio che può aiutare a rispondere a domande chiave su come arricchire e identificare i nitropeptidi con un approccio chimico e la spettrometria di massa. Questa tecnica ha una maggiore sensibilità per il rilevamento dei nitropeptidi mediante spettrometria di massa e che può essere applicata sia ai sistemi biochimici in vitro che ai tessuti biologici endogeni. Per la desalizzazione nitro-angiotensina II, utilizzare una pipetta millilitro per precondizione di un'estrazione in fase solida in fase inversa o colonna SPE con l'aggiunta di 500 microlitri di metanolo e 500 microlitri di acqua nella parte superiore della colonna.
Quando tutta l'acqua ha attraversato la colonna, caricare 410 microlitri di soluzione di nitro-angiotensina II sulla colonna. Lavare la colonna con 500 microlitri di 5%metanolo e acqua e 300 microlitri dell'80% di metanolo e acqua per elutare il nitropeptide. Quindi asciugare l'eluato per vuoto di velocità nell'impostazione predefinita a temperatura ambiente.
Per l'alchilazione primaria dell'ammina, ricostituire la nitro-angiotensina II in polvere in 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di Trietilammonio da 100 millimolare e aggiungere 400 microlitri di formaldeide al 4% alla soluzione in una cappa fumi con breve miscelazione. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di cianoboroidro di sodio molare 0,6 alla soluzione con scuotimento a 400 rotazioni al minuto per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare la reazione di etichettatura con 16 microlitri di soluzione di ammoniaca all'1% per cinque minuti a temperatura ambiente seguita da acidificazione con otto microlitri di acido formico.
Quindi desalt la soluzione in una nuova colonna SPE in fase inversa come appena dimostrato. Per la riduzione della nitrotirosina in amminotirosina, ricostituire la nitro-angiotensina II con etichetta dimetile in 500 microlitri di PBS e aggiungere 10 microlitri di un ditionato di sodio molare per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Dopo la reazione di riduzione, la soluzione gialla diventerà chiara.
Desalt il campione ridotto in una nuova colonna SPE in fase inversa, come dimostrato. Per la biotinilazione e l'arricchimento, ricostituire l'amminoangiotensina II a marchio dimetile in 500 microlitri di PBS seguita dall'aggiunta di cinque microlitri di biotina NHS-S-S nanomolare sciolta in solfossido di dimetile per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare la reazione con un microlitro di idrossilammina al 5% e aggiungere 500 microlitri di PBS fresco a 100 microlitri di perline di agarosio Streptavidin per l'equilibrazione mediante tre centrifugazioni separate.
Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere 100 microlitri di perline al sistema di reazione per un'incubazione di un'ora su uno shaker rotativo a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare il sistema quattro volte con 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio seguito dall'aggiunta di 400 microlitri di 10 millimolare ditiothreitol per un'incubazione di 45 minuti a 50 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, girare lungo la colonna e trasferire il supernatante in un nuovo tubo contenente 20 microlitri di iodoacetamide molare 0,5 per un'incubazione di 20 minuti al buio.
Quindi desalt la soluzione in una nuova colonna SPE in fase inversa come dimostrato e risolvere il peptide secco in 20 microlitri dello 0,1% di acido formico. Per il rilevamento, caricare il prodotto su un cromatografo liquido con uno spettrometro di massa tandem. Separare i peptidi di angiotensina II modificati con un'elusione gradiente di 60 minuti ad una portata di 0,3 microlitri al minuto con il sistema di cromatografia liquida ad altissima pressione che è direttamente interfacciato con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.
Nella modalità di acquisizione dipendente dai dati, impostare un singolo spettro di massa di scansione completo nello spettrometro di massa, seguito da 20 scansioni di massa tandem dipendenti dai dati con energia di collisione normalizzata al 28%. Quindi aprire i dati degli spettri di massa e identificare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica è stata eseguita con successo. Qui si possono osservare spettri di massa rappresentativi di angiotensina II prima e dopo ogni modifica chimica dimostrata.
Il peso molecolare del composto è indicato dai valori del rapporto massa-carica del picco mono isotopico, indicando che la modifica chimica sull'angiotensina II è stata raggiunta con successo per quel passo. Qui viene mostrato il prodotto finale rilevato e caratterizzato da cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem. L'analisi quantitativa dei nitropeptidi mediante etichettatura dimetile consente di calcolo delle quantità relative di luce e pesante attraverso il confronto dell'intensità del picco mono isotopico in ciascun gruppo, consentendo la quantificazione dei nitropeptidi arricchiti provenienti da diversi gruppi.
Seguendo la procedura, è possibile utilizzare un motore di ricerca del programma come il numero massimo SEQUEST di pFIND per identificare i potenziali nitropeptidi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'inizio delle funzioni biologiche di specifici siti di nitrazione.
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Panoramica
Questo articolo presenta un approccio innovativo per l'arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi, utilizzando specificamente l'Angiotensina II come modello. Il metodo aumenta la sensibilità per il rilevamento dei nitropeptidi attraverso la spettrometria di massa, applicabile in vari sistemi biologici.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Proteomica
- Spettrometria di massa
- Analisi biochimica
Contesto
- Le proteine nitrato-tirosina sono difficili da profilare a causa della loro bassa abbondanza.
- La modifica della 3-nitrotirosina è un aspetto chiave di questa ricerca.
- Le tecniche esistenti spesso mancano di sensibilità per il rilevamento dei nitropeptidi.
- La spettrometria di massa è uno strumento cruciale per l'analisi di queste modifiche.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'arricchimento dei nitropeptidi.
- Migliorare la sensibilità di rilevamento dei nitropeptidi nei campioni biologici.
- Fornire un protocollo adattabile a vari sistemi.
Metodi utilizzati
- Approccio chimico per l'arricchimento dei nitropeptidi.
- Spettrometria di massa per la profilazione dei nitropeptidi.
- Estrazione in fase solida a fase inversa (SPE) per la desalinizzazione.
- Applicazione del metodo sia a sistemi in vitro che in vivo.
Principali risultati
- È stata raggiunta una maggiore sensibilità nel rilevamento dei nitropeptidi.
- Il metodo ha arricchito con successo la nitro-angiotensina II.
- Sono stati forniti i dettagli del protocollo per la preparazione e l'elusione della colonna SPE.
- I risultati indicano l'applicabilità a vari contesti biologici.
Conclusioni
- Il nuovo metodo offre un significativo avanzamento nella profilazione proteomica dei nitropeptidi.
- Può essere utilizzato per ulteriori studi sulle proteine nitrato-tirosina.
- Questo approccio potrebbe portare a nuove intuizioni nella ricerca biochimica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Protein nitration is a critical post-translational modification linked to inflammation, aging, and cancer, yet nitropeptide detection remains challenging due to low abundance. This protocol enables sensitive enrichment and quantification of nitropeptides via chemical reduction, biotin labeling, and high-resolution mass spectrometry, supporting target validation in oxidative stress pathways. The dimethyl-labeling strategy allows relative quantification across experimental conditions, enhancing predictive confidence in mechanistic studies of nitrosative stress.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tyrosine nitration as a biomarker of oxidative stress in disease models.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for nitropeptide enrichment from complex biological samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative nitropeptide profiles using dimethyl labeling for comparative analysis.
- Operational Value: Utilizes disulfide-linked biotin for reversible enrichment, improving mass spectrometry detection sensitivity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by identifying nitrosative stress signatures in Angiotensin II, a peptide relevant to cardiovascular and inflammatory pathways.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of nitropeptide levels to inform risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, where nitropeptide profiling informs target validation and pathway elucidation prior to assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of nitrosative stress mechanisms through site-specific nitropeptide identification.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for hit confirmation in oxidative stress-modulating compound screens.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based readouts enabling relative quantification and modification site mapping.
- Translational Research: Connects nitropeptide detection to pathophysiological processes in cardiovascular and inflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for nitropeptide profiling applicable across multiple target validation projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target validation by reducing ambiguity in nitrosative stress biomarker detection.
- Operational Value: Enhances assay standardization and sensitivity through SPE-based enrichment and MS-compatible labeling.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions by clarifying the role of protein nitration in mechanism of action.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of targets based on nitrosative stress engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mass spectrometry, and peptide chemistry.
- Depends on access to high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry systems.
- Necessitates standardized operating procedures for SPE, labeling, reduction, and biotinylation steps.
- Adaptation to diverse biological matrices may require optimization of enrichment efficiency.
- Practical limitations include the multi-step workflow and need for careful quenching to avoid side reactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Nitro-Angiotensin II Desalting
1:30
Primary Amine Alkylation by Dimethyl Labeling
2:37
Nitrotyrosine to Aminotyrosine Reduction and Biotinylation, Enrichment, and Detection
6:03
Results: Representative Mass Spectra Analyses
6:59
Conclusion
