Un protocollo dello schermo mutante di segnalazione della forza di manodopera e ripetibile per lo studio della Thigmomorphogenesis di un modello di arabidopsis thaliana

Costruiamo una macchina automatica a forza tattile per osservare la morfogenesi del segnale dell'impianto. I bracci robotici che ho installato con spazzole per capelli umani per applicare una leggera forza di tocco sulle piante. Rispetto al tocco umano delle dita, la touch machine automatica per capelli umani può offrire un maggiore risparmio di manodopera, un carico uniforme della forza di tocco.

Il tempo necessario per un ciclo di caricamento della forza può essere limitato in diversi minuti. Rispetto a diverse ore di tocco delle dita e un tocco di batuffolo di cotone, la macchina robotica può migliorare in gran parte la ricerca di risposta mercantile dell'impianto. Aumentando l'efficienza e la popolazione delle piante trattate, prevediamo che la touch machine automatica verrà applicata in quattro schermi mutanti di segnalazione e negli studi di risposta mercantile sia nelle piante che negli animali.

Per iniziare, testare il tasso di germinazione di ogni genotipo dopo aver nutrito i semi su una piastra di agar dell'8% con mezzo MS per sette giorni. In base al tasso di germinazione, preparare i semi da quattro a cinque volte più del numero desiderato di piante da produrre. Immergere i semi in acqua fredda in tubi di plastica da 1,5 millilitri e coprire con un foglio di alluminio da tenere al buio.

Conservare a quattro gradi celsius per l'imbibizione dei semi. Da cinque a sette giorni dopo l'imbibizione, selezionare il terreno appropriato per la crescita delle piante. Evitare grandi grumi e utilizzare una forchetta per mescolarli in modo omogeneo.

Preparare 24 tazze di plastica da 207 millilitri con un diametro superiore del cerchio di 7,4 centimetri. Praticare tre fori rotondi nella parte inferiore delle tazze per scopi di irrigazione. Riempire queste tazze di plastica con terreno misto.

Lasciare che il terreno si accumuli fino a circa un centimetro più in alto rispetto al bordo della tazza e utilizzare un righello per appiattire dolcemente la superficie del terreno ammucchiato. Trasferire 24 tazze in un vassoio di plastica. Impostare l'intensità luminosa della camera di crescita tra 180 e 240 microeinsteine al secondo per metro quadrato, che è superiore alla radiazione attiva fotosintetica per una rapida crescita delle piante.

Impostare la condizione di luce su una costante di 24 ore. Impostare la temperatura della camera di crescita a 23,5 più o meno 1,5 gradi celsius e umidità tra 35 e 45%Aggiungere 2,5 litri di acqua in ogni vassoio. Lasciare che il terreno assorba l'acqua dai fori situati nella parte inferiore delle tazze e attendere che la superficie del terreno lasci cadere al livello del bordo della tazza.

Due ore dopo, semina da tre a quattro semi in un unico punto e quattro punti distribuiti uniformemente all'interno di una tazza. Posizionare una copertura di plastica trasparente sopra ogni vassoio e lasciare germogliare i semi per una settimana. Quindi, rimuovere il coperchio e consentire alle piantine di crescere per un'altra settimana.

Irrigare le piante con 1,5 litri di acqua a giorni e due giorni dopo il germinare i semi. Da nove a 10 giorni dopo la semina del seme, rimuovere i germogli extra assottigliando. Usa piccole forbici per tagliare gli scivoli ed evitare di estrarre direttamente l'intera pianta dal terreno.

Da tre a quattro individui vegetali di dimensioni simili in ogni tazza. Per installare spazzole per capelli touch sui bracci robotici, utilizzare prima la colla per fissare uniformemente uno strato di capelli umani su un righello in acciaio lungo 330 millimetri. La lunghezza dei capelli è di 126 millimetri.

Con due morsetti metallici, attaccare quei righelli d'acciaio sui bracci robotici. Nel pannello di controllo, impostare l'altezza dei bracci della macchina lungo la dimensione verticale premendo Jog F plus per sollevare e Jog R meno per abbassare i bracci e le spazzole robotiche. Mantenere la punta delle spazzole per capelli 5 centimetri più in basso rispetto al bordo della tazza.

Premere Inc F plus o R meno per preeseguire la macchina da uno a due cicli per assicurarsi che tutti gli individui dell'impianto vengano toccati. Prima dell'esperimento ufficiale, utilizzare una scala elettronica per misurare la forza di tocco. Regolare l'altezza dei bracci della macchina per mantenere la forza di tocco da uno a due millinewton.

Quindi, impostare manualmente la posizione iniziale dei bracci della macchina lungo la dimensione orizzontale. Lasciare appendere le spazzole per capelli al bordo di ogni vassoio. Premere Jog F plus o Jog R meno per spostare il braccio della macchina orizzontalmente a poco a poco per assicurarsi che nessuna pianta venga toccata prima dell'inizio dell'esperimento toccante.

Impostare la distanza di percorrenza della spazzola per capelli nella dimensione orizzontale su 365 millimetri premendo il pulsante di corsa. Premere Inc F più o R meno per spostare i bracci della macchina per ottenere una distanza di percorrenza completa e assicurarsi che tutte le piante trattate vengano toccate. Quindi, premere il pulsante di velocità automatica per impostare la velocità di movimento lungo l'asse x dei bracci della macchina a 5000 millimetri al minuto.

Premere il pulsante del ciclo secondario per impostare il tempo di tocco a 20 prove pari a 40 tocchi per round. Impostare l'intervallo di ripetizione del tondo a 480 minuti al giorno premendo il pulsante del periodo principale che consente alle spazzole per capelli di toccare le piante per tre round al giorno con un intervallo di otto ore. La macchina inizierà automaticamente un nuovo round di tocco quando il conto alla rovescia diventa zero.

Impostare il ciclo principale a 12 prove per consentire alla macchina di toccare gli impianti per 12 colpi in un periodo di quattro giorni. Premere il pulsante start per avviare il programma preimpostato. Regola e calibra le spazzole e le punte dei capelli alla stessa altezza ogni giorno durante l'intero periodo toccante.

Per tracciare il giorno di bullonatura di ogni pianta all'interno di un esperimento toccante, osservare quotidianamente il primo fusto infiorescente di ogni pianta. Misurare la lunghezza e registrare la durata della crescita quando raggiunge un centimetro, il che significa che è passato dalla fase vegetativa alla fase riproduttiva. La misura del raggio della rosetta, scatta foto dell'intero vassoio dall'alto.

Utilizzare un software di elaborazione delle immagini per misurare la distanza dal centro della rosetta alla punta della foglia più lunga con il bordo della tazza come righello. Per misurare l'area della rosetta, in primo luogo, rimuovere l'infiorescenza senza influenzare il resto degli organi di rosetta. Scatta foto dalla parte superiore di ogni pianta insieme a un righello in scala posizionato nelle vicinanze.

Nel software di elaborazione delle immagini, misurare l'area orizzontale della superficie bidimensionale delle foglie di rosetta. In questo esperimento il trattamento manuale del tocco in batuffolo di cotone è stato confrontato con il trattamento a sfioramento dei capelli guidato dalla macchina su piante Columbia zero di controllo del tipo selvaggio. Bullonatura ritardata di 1,7 giorni dopo il trattamento continuo con tampone di cotone.

Allo stesso modo per il tocco automatico dei capelli azionati dalla macchina, è stata osservata la bullonatura ritardata. L'analisi univariata dei pericoli di Cox mostra che il rischio di bullonatura delle piante nel gruppo touch è rispettivamente del 31% e del 52% rispetto agli impianti del gruppo di controllo. Tuttavia, questo ritardo di bullonatura non è stato osservato sui mutanti inserizionali tDNA, NKK uno e NKK due.

Il modello di pericolosità proporzionale Cox univariate mostra che solo il tipo selvaggio Columbia zero ha mostrato una differenza significativa tra piante di controllo e piante tattili con una HR stimata di 41. Per i cambiamenti morfologici, la pianta zero di tipo selvatico Columbia ha mostrato un raggio di rosetta significativamente più piccolo e una lunghezza delle foglie più corta dopo tre giorni di costante e ripetitivo tocco automatico di capelli azionati dalla macchina. L'area della rosetta proiettata è stata cambiata da 20 a 16 centimetri quadrati dopo 13 giorni di tocco.

Per assicurarsi che il caricamento della forza di tocco non porti al mento, è necessario impostare con attenzione una forza di tocco appropriata. Sono necessarie una serie di condizioni di crescita adeguate per produrre un impianto di arabidopsis adatto per il test di risposta al tocco. Ad esempio, sono necessarie 24 ore di intensità luminosa tra 180 e 240 microeinstein per metro quadrato al secondo per osservare la morfogenesi del segnale.

Per estendersi alle altre forme di carico meccanico della forza, la macchina può anche essere modificata con ugelli di spruzzatura dell'acqua o soffianti a vento per imitare gli effetti della pioggia o del vento, rispettivamente in futuro.