Metodo per ottenere il modello di respirazione nei topi senescenti attraverso Pletimografia Barometrica Sfrenata

Questo protocollo può essere utilizzato per misurare i modelli di respirazione nei topi. È importante sottolineare che può ridurre al minimo l'impatto dei comportamenti attivi nei ceppi geneticamente modificati che possono confondere i risultati. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva e che non richiede l'uso di vincoli anestetici o che inducono stress.

Iniziare assicurandosi che tutti i tubi e i tubi siano collegati alla camera del pletismografo barometrico e collegando un tubo di afflusso di gas e un tubo di deflusso sottovuoto direttamente alla camera di pletismografia barometrica. Per calibrare il flusso basso nella camera, impostare il flusso in entrata e in uscita dalla camera su zero e rimuovere il tubo di flusso nella camera. Spegnere il vuoto ed inserire uno zero nella cella dell'unità bassa per registrare il flusso zero nella configurazione dell'amplificatore 7700 del software del pletismografo barometrico.

Quindi ricollegare il tubo di afflusso e accendere il flusso sottovuoto per calibrare l'alto flusso e consentire al 20,93% di gas azoto bilanciato dall'ossigeno di fluire attraverso la camera di pletosmografia barometrica dal miscelatore di gas. Quindi, convertire il valore di afflusso misurato dal misuratore di flusso da litri al minuto in millilitri al secondo e fare clic sulla cella dell'unità alta per immettere il valore in millilitri al secondo. Fare doppio clic su cal alto, impostare l'ora su tre secondi e fare clic su Misura.

Quindi lasciare aperta la scheda di configurazione dell'amplificatore 7700 per calibrare gli analizzatori metabolici al software di pletosmografia barometrica. Per calibrare l'analizzatore metabolico, nel programma miscelatore di gas, impostare il miscelatore di gas sul 20,93% di ossigeno e sul 79,07% di azoto. E sull'analizzatore metabolico, impostare il livello di calibrazione dell'ossigeno al 20,93% e l'anidride carbonica allo 0%Rivolgere il quadrante al campione una volta inseriti i valori appropriati sugli analizzatori di gas per impostare l'alta percentuale di ossigeno e bassa anidride carbonica.

Fare clic sulla scheda ABCD 4 del software di pletosmografia barometrica ed immettere 20.93 sotto l'unità alta della linea C2 per l'ossigeno. In cal alto modificare l'ora in tre secondi e fare clic su Misura. Immettere zero sotto basso contenuto cal della linea C3 per l'anidride carbonica.

Quindi modificare l'ora in tre secondi e fare clic su Misura in cal basso. Nel programma miscelatore di gas, modificare il valore dell'ossigeno al 10% e il valore dell'anidride carbonica al 5% e attendere diversi minuti affinché il flusso di gas si adatti a questi valori. Sugli analizzatori metabolici, ruotare le manopole di regolazione per calibrare l'anidride carbonica al 5%, facendo attenzione a rivolgere il quadrante al campione una volta calibrati i valori.

Dopo aver verificato che le letture dell'analizzatore siano stabili, fare clic su unità alta sotto C3 e immettere cinque per l'anidride carbonica. Quindi modificare cal alto in tre secondi e fare clic su Misura. Fare clic su unità bassa sotto l'opzione C2 e immettere 10 per l'ossigeno e fare clic su cal basso, inserire tre secondi e fare clic su Misura.

Cambiare il miscelatore di gas al 20,93% di ossigeno e al 79,07% di azoto e attendere diversi minuti prima che la camera si adatti a questi valori. Esegui regolarmente calibrazioni aggiuntive con serbatoi di gas certificati per confermare che il miscelatore di flusso e gli analizzatori di anidride ossigeno-carbonio funzionano correttamente. Una volta calibrati gli analizzatori metabolici, ricontrollare i misuratori di portata collegati alla camera del pletismografo barometrico e regolare il flusso d'aria in entrata e in uscita dalla camera alle velocità appropriate per l'esperimento.

Dopo aver applicato tutte le impostazioni al software di pletografia barometrica, fare clic su Chiudi nella scheda Acquisizione. Hit Start Acquisition, assegnare un nome al file e fare clic su OK per iniziare la registrazione. Per la pletosmografia barometrica sfrenata, registrare il peso e la temperatura corporea iniziale del mouse prima di riportare il mouse nella gabbia domestica.

Attendere 10 minuti per raccogliere i dati di ossigeno di fondo e anidride carbonica dalla camera vuota prima di posizionare il mouse nella camera. Durante la prima ora, documentare il comportamento dell'animale prendendo note dettagliate che includono i valori specifici dell'in e del deflusso della camera. Alla fine dell'assunzione della camera, guarda i segmenti di respirazione silenziosa per i successivi 60 minuti prendendo le misurazioni della temperatura corporea ogni 10 minuti quando si utilizza un dispositivo impiantabile.

Fai attenzione a familiarizzare con i comportamenti generali del mouse in modo che i casi di respirazione calma senza annusare, pulire o esplorare possano essere identificati in modo appropriato. Alla fine dell'esperimento, riportare il topo nella sua gabbia e pulire e pulire accuratamente l'attrezzatura. Per un'analisi del metabolismo, aprire il pannello metabolico nel software e ottenere la media dei primi 10 minuti dei livelli di ossigeno e anidride carbonica da quando la camera era vuota.

Visualizzare il pannello di flusso del software di pletografia barometrica e fare clic con il pulsante destro del mouse su Analizza attributo per impostare i parametri appropriati. Per un modello di analisi della respirazione, confermare i tempi per i 15 secondi di respirazione silenziosa utilizzando note sul comportamento degli animali e sul tracciamento del pannello di flusso. Immettere quindi gli orari in open parser dialogue dalla scheda parser dati e fare clic su Parser View Mode per visualizzare solo i segmenti di interesse specifici di 15 secondi.

Per analizzare le apnee e il respiro aumentato, nel file di revisione aperto uscire dalla modalità di visualizzazione parser e fare clic su Setup P3 Setup e Graph Setup per selezionare Visualizzazione pagina come tipo e cinque come numero di riquadri. Immettere meno due nella casella etichettata in basso e due nella casella etichettata in alto per le misure di flusso in millilitri al secondo e applicare le modifiche. Quindi scorrere fino al segno di 30 minuti sul pannello di tracciamento del flusso e contare manualmente le apnee e i respiri aumentati per il periodo da 30 a 60 minuti dopo che il mouse è stato posizionato nella camera.

Per questa analisi, i periodi di respirazione sospesa che durano più o sono pari a 0,5 secondi sono indicativi di un'apnea. I respiri aumentati sono indicati da un forte aumento della traccia respiratoria sopra 1,25 millilitri al secondo seguito da una forte diminuzione sotto meno 0,75 millilitri al secondo. Questo tracciamento rappresentativo del flusso della respirazione silenziosa in un topo di 22 mesi è tipico di un modello in cui la respirazione è coerente senza comportamenti respiratori attivi.

Questo modello di respirazione proviene da un segmento più attivo durante il quale i topi stavano esplorando lo sniffing e / o la toelettatura della camera e non è l'ideale per il tipo di raccolta della respirazione utilizzato per questa metodologia. Il parametro scelto per la valutazione del possibile modello di differenze respiratorie tra i due punti di tempo era la frequenza respiratoria, il volume delle maree, la ventilazione minuto, il rapporto tempo inspiratorio del volume mareale e il rapporto di anidride carbonica espulso per la ventilazione minuto. Ulteriori analisi sono state eseguite con ciascuno dei quattro segmenti di base di 15 secondi per frequenza, volume mareale, ventilazione minuti, rapporto di tempo inspiratorio del volume mareale e ventilazione minuto espulso rapporto di anidride carbonica.

Non sono state riscontrate differenze significative tra nessuno dei punti di tempo e nessuna differenza nella variabilità tra nessuno dei quattro segmenti di tempo per qualsiasi modello di misura respiratoria. La quantificazione del numero di apnee e respiri aumentati osservati per ogni animale durante i minuti da 30 a 60 del protocollo di pletosmografia barometrica sfrenata ha rivelato che gli animali invecchiati mostravano un alto numero di apnee e la presenza di respiri aumentati entro un arco di 30 minuti. I ricercatori possono anche impiegare sfide di gas come ipossia o ipercapnia per documentare eventuali cambiamenti nel modello respiratorio derivanti da un intervento o una terapia.

Questa tecnica fornisce un mezzo per caratterizzare i modelli di respirazione in piccoli roditori e ceppi animali geneticamente modificati che possono presentare distinte differenze comportamentali.