Interrogando i centri germinali autoreattive individuali di fotoattivazione in un modello misto chimerico dell'autoimmunità

Questo modello chimerico fisiologicamente rilevante dei centri germinali autoreattivi spontanei consente il collegamento della localizzazione cellulare in vivo con analisi molecolari a valle. Il principale vantaggio del modello chimerico misto dei centri germinali autoreattivi è la sua natura versatile e marginale, consentendo l'interrogazione praticamente di qualsiasi sottoinsieme cellulare desiderato o via molecolare. La rilevanza fisiologica di questo modello di sviluppo delle malattie autoimmuni consente nuove intuizioni che possono aiutare l'avanzamento di nuove terapie.

Questo modello di chimera del midollo osseo può essere utilizzato in immunologia, immuno-oncologia e ricerca sulle cellule staminali. Il componente di fotoattivazione ha un ampio utilizzo, in quanto collega la localizzazione dei tessuti all'analisi delle cellule a valle. La preparazione e la ricostituzione del midollo osseo e le fasi di etichettatura in vivo e di espianto dei tessuti sono tutte procedure tecnicamente complesse che si prestano bene alle dimostrazioni visive.

Per estrarre il femore e la tibia del topo donatore 564Igi, rimuovere la pelle da un arto posteriore e far uscire le articolazioni del ginocchio e della caviglia tirando con forza il piede. Procedere a rompere l'articolazione della caviglia. Quindi, tirare il piede verso il corpo tenendosi sulla tibia, spogliando così i tendini e i muscoli dalla tibia.

Rompere l'articolazione del ginocchio per rilasciare la tibia e tirare l'osso verso il corpo tenendosi al femore per rimuovere i tendini e i muscoli dal femore. Quindi, fare un'incisione all'articolazione dell'anca e tagliare i tendini prima di estrarre il femore dalla presa dell'anca. Dopo aver rimosso le ossa dell'arto posteriore contralaterale in modo simile, strofinare accuratamente le ossa con un tovagliolo di carta grossolano per rimuovere il muscolo rimanente e il tessuto connettivo e sciacquare le ossa spogliate nel tampone del midollo osseo ghiacciato.

Quindi, usa le forcette Dumont numero sette per trasferire le ossa in un contenitore di tampone di midollo osseo fresco sul ghiaccio. Per estrarre le cellule del midollo osseo, sciacquare una malta nel tampone di midollo osseo ghiacciato e utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sostituire il tampone di lavaggio con 10 millilitri di tampone di midollo osseo fresco e ghiacciato. Usa le forcep per trasferire le ossa al mortaio e usa un pestello per schiacciare e macinare le ossa per rilasciare il midollo osseo.

Utilizzare la pipetta da 10 millilitri per raccogliere l'estratto di midollo osseo prima di passare la soluzione di midollo osseo attraverso un colino cellulare di 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Quindi, sciacquare la malta con altri 10 millilitri di tampone di midollo osseo fresco e ghiacciato per garantire un completo recupero delle cellule. Per preparare le sospensioni del donatore, mescolare i volumi appropriati di GFP fotoattivabile e midollo donatore 564Igi in un tubo conico da 50 millilitri e pelletare le cellule mediante centrifugazione.

Rimescolare il pellet a cellule miste ad una concentrazione di uno per 10 alle otto cellule per millilitro del tampone di midollo osseo ghiacciato e trasferire le cellule in un tubo di microcentrifugo preraffreddato da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Successivamente, confermare la mancanza di risposta al dito del dito nel mouse ricevente CD45.1 anestetizzato e scorrere il tubo delle cellule del midollo osseo del donatore per garantire un'adeguata resuspensione. Caricare 200 microlitri di midollo osseo mescolare in una siringa per insulina da 0,3 millilitri e calibro 30 e, con il ricevente su un lato, allungare delicatamente la pelle sopra e sotto l'occhio per far uscire leggermente l'occhio.

Inserire con cura la punta della siringa con un angolo approssimativo di 30 gradi nella parte anteriore dell'orbita oculare, facendo attenzione a evitare l'occhio e il tessuto circostante. Quando la punta dell'ago tocca l'osso sottolineando l'orbita oculare, ritrarre l'ago di circa 0,5 millimetri prima di utilizzare una pressione costante per iniettare lentamente il midollo osseo del donatore. Quindi, riportare il topo nella sua gabbia con acqua antibiotica ad libitum, con monitoraggio fino al pieno recupero.

Per etichettare il linfonodo popliteo, diluire due microlitri di anticorpi CD169 del ratto etichettati con ficoerytrina in 18 microlitri di PBS e aggiungere due goccioline da 10 microlitri dell'anticorpo su un pezzo di pellicola di paraffina di plastica. Caricare ogni goccia in una singola siringa per insulina da 0,3 millilitri con un ago calibro 30 e iniettare 10 microlitri di anticorpo nel footpad dell'animale ricevente anestetizzato. Prima di raccogliere il linfonodo, posizionare un coverslip quadrato su una superficie piana e utilizzare una siringa a cinque millilitri carica di grasso sottovuoto per tracciare i bordi del coverslip con grasso a circa uno o due millimetri da ogni bordo.

Trasferire la camera su una superficie fredda e piatta e riempire la camera di grasso sottovuoto con tampone di midollo osseo ghiacciato. Per accedere ai linfonodi poplitei, utilizzare forbici dritte e fini per fare un'incisione nella pelle appena sotto la fossa del ginocchio dell'animale ricevente eutanasiato ed estendere il taglio verso l'alto lungo la linea del tendine del ginocchio quasi fino all'articolazione dell'anca. Usando le forcelle Dumont numero cinque o numero sette, tirare ciascuno dei lembi esposti della pelle verso l'esterno per esporre il tessuto nella fossa poplitea e utilizzare le forcep per entrare con cura nella fossa solo mediale alla vena poplitea.

Aprire e chiudere le forcep lungo l'asse della gamba per esporre il linfonodo popliteale sottostante prima di utilizzare il pollice e l'indice per pizzicare il muscolo quadricipite dal lato anteriore prossimale al ginocchio, per far uscire il linfonodo dalla fossa. Far scorrere le forcep sotto il linfonodo per liberare il nodo dal tessuto circostante e posizionarlo nella camera del grasso sottovuoto. Dopo aver raccolto il secondo linfonodo, posizionare un secondo coverslip sul bordo del grasso sottovuoto e premere delicatamente verso il basso per chiudere la camera, facendo attenzione a estrudere tutte le bolle d'aria.

Per identificare i centri germinali nei campioni di tessuto di milza raccolti, posizionare la camera di imaging sullo stadio di un microscopio fluorescente a due fotoni e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica da 3,5 millilitri per posizionare una goccia di acqua distillata sopra il coverslip superiore. Abbassare l'obiettivo fino al punto di contatto e utilizzare la luce trasmessa per concentrarsi sulla parte superiore del tessuto. Passa alla modalità scura e all'eccitazione a due fotoni e sintonizza il laser su 940 nanometri.

Individuare le singole aree di polpa bianca delimitate dalla colorazione CD169 vicino alla superficie del tessuto e identificare la lucentezza linfoide periarteriolar dalla seconda generazione di armoniche associata all'arteriola centrale. Nella zona compresa tra la torcia linfoide periarteriolar e la zona marginale, identificare la presenza di macrofagi del corpo tingibile altamente autofluorescenti e attivati e, utilizzando questi punti di riferimento, disegnare una regione di interesse attorno a una singola area centrale germinale. Quindi, impostare una pila Z di circa 100-150 micrometri di profondità, partendo dalla superficie del tessuto e utilizzando una dimensione del passo di circa tre micrometri prima di passare a una lunghezza d'onda di eccitazione di 830 nanometri.

Spegnere o ammazzare tutti i canali per evitare danni fotografici ai rilevatori e l'immagine della pila. Quindi, torna alla lunghezza d'onda di eccitazione di 940 nanometri e riapri i canali, scansionando attraverso la pila per confermare un'efficiente fotoattivazione e un'assenza di danni fotografici in tutto lo stack di immagini. La sierotipizzazione delle chimere del midollo osseo misto rivela numeri cellulari B normalizzati a sei settimane dopo la ricostituzione, con una bassa frequenza di cellule B circolanti 9D11 positive derivate dal compartimento 564Igi.

All'interno del cancello totale dei linfociti, c'era una bassa frequenza di cellule residue derivate dal ricevente, circa il 6% delle quali derivate da CD45.1, che indicava un grado complessivo di chimerismo di circa il 94%C'era un chimerismo virtualmente completo nel compartimento cellulare B e una dominanza delle cellule B fotoattivabili derivate dal midollo osseo GFP, una conseguenza della pesante selezione negativa di cellule B derivate da 564Igi. Come osservato, l'etichettatura in vivo con CD169 facilita una visualizzazione robusta della zona marginale. Il secondo segnale armonico è evidente negli elementi strutturali contenenti collagene e nei principali vasi, tra cui l'arteriola centrale della tonalità linfoide periarteriolar e i macrofagi del corpotingibile altamente autofluorescenti e attivati associati all'attività del centro germinale.

Nel loro insieme, questi dati consentono l'identificazione di una regione di interesse che probabilmente contiene un singolo centro germinale fotoattivabile. La valutazione citometrica a flusso a valle conferma ulteriormente la presenza di numeri di compartimenti cellulari B normalizzati, una popolazione centrale germinale spontanea e un sottoinsieme di cellule B centro germinali fotoattivate. È importante limitare il tempo totale di consegna delle fasi di espianto, fotoattivazione e lavorazione dei tessuti a quattro o sei ore per garantire una sufficiente vitalità cellulare.

Le cellule fotoattivate possono essere ordinate a flusso e sottoposte a sequenziamento a una singola cellula per caratterizzare, ad esempio, il repertorio del recettore cellulare B di un singolo centro germinale. Il modello della chimera mista ha permesso l'esplorazione della biologia del centro germinale autoreattivo a una nuova profondità, ad esempio fornendo informazioni su come si svolge il processo di diffusione dell'epitopo. Si noti che la sorgente luminosa per la microscopia a due fotoni sono laser pulsati di classe 4 molto potenti che possono danneggiare gravemente gli occhi.