Name: Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri la visualizzazione di complessi mitofagici endogeni in cellule beta pancreatiche umane mediante l'assay di ligazione di prossimità. Questo metodo consente l'analisi quantitativa con campioni biologici limitati.

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Gli autori riconoscono il sostegno al finanziamento da JDRF (CDA-2016-189 e SRA-2018-539), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), la famiglia Brehm e la famiglia Anthony. Il JDRF Career Development Award a S.A.S. è in parte sostenuto dalla Danish Diabetes Academy, sostenuta dalla Novo Nordisk Foundation.

L'uso di isole pancreatiche umane de-identificate del donatore avviene tramite un'esenzione dell'IRB (Institutional Review Board) e in conformità con la politica IRB dell'Università del Michigan. Le isole pancreatiche umane sono state fornite dal programma integrato di distribuzione dell'isola (IIDP) sponsorizzato da NIH/NIDDK.
1. Preparazione del campione di isleta umana
<ol><li>
Dissociazione a cella singola
	<ol>
<li>Campioni di isolotto umano di coltura (4000-6000 equivalenti di isolotto/10 mL di supporti) per almeno 1 giorno a 37 gradi centigradi in supporti di isolotto pancreatico (PIM(S)) integrati con 1 mM di glutammina (PIM(G)), 100 unità/mL antimicotico-antibiotico, 1 mM di piratosa di sodio e 10 % bovina fetale siero (FBS) o siero UMANO AB.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio luminoso di dissezione a un ingrandimento 3x per contare le singole isole umane dalla coltura. Prelevare 40 isolotti per trattamento/condizione di interesse (come la glucolipotossicità) in tubi da 1,5 mL nel supporto dell'isolotto.</li>
		<li>Le isole Centrifuga a 400 x g per 1 min a 10 gradi centigradi.</li>
		<li>I campioni di lavaggio, mediante breve inversione dei tubi a temperatura ambiente, due volte con 1 mL di salina tampolatata per fosfati (PBS) contenente 50 PR619 (un inibitore della deubiquitinasi; per preservare le interazioni tra proteine dipendenti dall'ubiquitina, con centrifugazione tra ogni lavaggio a 400 x g per 1 min a 10 gradi centigradi.</li>
		<li>Dissociate le isole in singole cellule con 125 gradi di ritegno dello 0,25% contenente 50 :M PR619 incubando la trypsin preriscaldata (37 gradi centigradi) per 3 min con pellet di isolotto. Disperdere delicatamente le isse durante questo periodo con una pipetta delicata periodica utilizzando una pipetta da 200 l.</li>
		<li>Quenpsin con un supporto PIM riscaldato da 1 mL (37 gradi centigradi) contenente 50 -M PR619, quindi sedimentare le cellule centrifundo a 400 x g per 1 min.</li>
		<li>Lavare le cellule per centrifugazione a 400 x g per 1 min, due volte, con PBS - 50 - M PR619.</li>
		<li>Infine, risospendere le celle in PBS 150 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aderenza e fissazione di una singola cellula
	<ol>
<li>Dopo la sospensione, far girare la soluzione cellulare su vetrini smerigliati, carichi, al microscopio utilizzando una citocentrifuga a 28 x g per 10 min.</li>
		<li>Dopo la citocentrifuga, delineare l'area cellulare con una penna idrofobica (vedere la Tabella dei materiali) per ridurre al minimo i volumi di soluzione anticorpo/PLA necessari. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min a temperatura ambiente. AVVISO: il PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura.</li>
		<li>Per ottenere i migliori risultati, eseguire la colorazione/PLA immediatamente, o entro 24 h. Se necessario, conservare i campioni in PBS a 4 gradi centigradi fino a ottenere una colorazione non superiore a 48 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunoistochimica
<ol><li>
Blocco
	<ol>
<li>Lavare le cellule due volte con 1x PBS per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Soluzione a celle a blocchi, per eliminare la colorazione dello sfondo, con il siero del 10% dell'asino in PBS contenente il detersivo dello 0,3% (si veda la tabella deimateriali) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione
	<ol>
<li>Cellule incubate con anticorpi di topo primario o coniglio contro USP8 (1:250) e NRDP1 (1:250) rispettivamente (vedi Tabella dei materiali) diluite nel fosfato tampinato con detersivo (PBT, vedi Table of Materials),a 4 rilevare la segnalazione complessa di mitofagia tramite PLA.</li>
		<li>Co-incubare le cellule con un marcatore specifico per l'identificazione delle cellule beta che non è stato sollevato nel mouse o nel coniglio in modo da non interferire con il segnale PLA. In questo caso incubare cellule con PDX1 anti-capra (1:500) in PBT. Incubare tutti gli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi, utilizzando pellicola di plastica sopra la soluzione per prevenire l'evaporazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Saggio di legatura di prossimità
<ol><li>Sonda e contromacchia PLA
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di sonda PLA secondo le istruzioni del produttore, vale a dire, fare 20 l di soluzione sonda per campione, preparando una concentrazione finale di soluzione 1:5 sia anti-topo che anti-coniglio in PBT, e incubazione per 20 min a room temperatura.</li>
		<li>Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule due volte con 1x PBS per 5 min ciascuno, su un rocker.</li>
		<li>Poco prima dell'incubazione con la soluzione di sonda, aggiungere Cy5 anti-gola secondario ad una concentrazione finale di 1:600 alla soluzione sonda (per il rilevamento di PDX1 endogeno). Aggiungere la soluzione a sonda 20 per ogni condizione della cella, coprire delicatamente con pellicola di plastica e incubare a 37 gradi centigradi per 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Legatura
	<ol>
<li>Lavare le cellule due volte, a temperatura ambiente, con buffer A (vedere la Tabella dei Materiali per la ricetta) per 5 min ciascuno, su un rocker.</li>
		<li>Preparare la soluzione di legatura (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Per questo, diluire lo stock di legatura (5x) 1:5 in acqua trattata decontemporanea (DEPC) dietile. Immediatamente prima dell'incubazione aggiungere 0,025 U/mL ligase. Aggiungere una soluzione di legatura da 20 l alle cellule. Coprire con pellicola di plastica e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificazione
	<ol>
<li>Lavare le cellule due volte a temperatura ambiente con buffer A per 2 min ciascuno.</li>
		<li>Fare la soluzione di amplificazione (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Diluire il buffer di amplificazione (5x) 1:5 in acqua trattata con DEPC e tenere al buio fino all'uso. Aggiungere una diluizione 1:80 di polimerasi (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) alla soluzione immediatamente prima di aggiungere la soluzione alle cellule.</li>
		<li>Aggiungere 20 - soluzione di amplificazione alle cellule. Coprire con pellicola di plastica e mettere al buio a 37 gradi centigradi per un valore compreso tra 1 h 40 min e 2 h per il segnale massimo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione per l'imaging
	<ol>
<li>Lavare le cellule due volte con buffer B (vedere la Tabella dei Materiali per ricetta) per 10 min a temperatura ambiente, su un rocker.</li>
		<li>Infine, lavare le cellule una volta in 0.01x Buffer B, per 2 min a temperatura ambiente su un rocker.</li>
		<li>Montare i campioni aggiungendo una goccia di supporti di montaggio contenenti 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e posizionando con attenzione una coverslip sopra i campioni utilizzando una lama del bisturi per premere eventuali bolle formate. Sigillare le labbra con smalto chiaro intorno ai bordi.</li>
		<li>Esempi di immagini su un microscopio in grado di catturare più piani focali, come un microscopio confocale a scansione laser o un microscopio a fluorescenza invertita con capacità di deconvoluzione, prendendo almeno 9 diverse immagini del piano focale.<ol>
<li>Acquisire immagini con un ingrandimento di 100 volte, con un'altezza dello z-stack di circa 0,45 mm. Catturare Il PLA a 550 nm eccitazione, 570 nm emissioni; contro la macchia a 650 nm eccitazione, 670 nm emissione; e DAPI a 405 nm eccitazione, 450 nm emissioni.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per garantire che i segnali di sfondo dell'immagine a fluorescenza e la luce vagante siano ridotti al minimo per l'analisi a valle degli eventi PLA (in particolare sui microscopi widefield), le immagini di processo utilizzando un algoritmo di deconvoluzione bidimensionale (vicino più vicino) software di elaborazione delle immagini standard prescelto. NOTA: Per l'uso di Olympus CellSens, Nikon utilizza NIS-Elements, Leica utilizzare LAS X, zeiss – .eiss – EN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, così come diversi plugin disponibili attraverso Image-J. Per l'analisi, il numero totale di interazioni su tutti gli z-stack deve essere analizzato utilizzando il software Image-J, assicurando che vengano analizzate solo le celle positive Pdx-1 (sezione 3.5).</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione delle interazioni con PLA
	<ol>
<li>Aprire l'applicazione software gratuita Image-J e aprire l'immagine PLA. Iniziare dalla prima immagine PLA nitidamente messa a fuoco.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda immagine e selezionare Regola, quindi soglia (Figura 1A). Regolare la soglia per rimuovere tutti i segnali PLA non specifici, prendere nota della regolazione della soglia e cercare di mantenerla coerente durante l'analisi.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda processo e selezionare binary, quindi rendere binario (Figura 1B). Utilizzare l'immagine binaria per misurare le particelle, facendo clic sulla scheda "Analizza" e premendo Analizza particelle (Figura 1C).</li>
		<li>Per l'analisi, assicurarsi che le impostazioni siano le seguenti: Dimensione : 0-Infinito, Circolarità 0–1,0, Mostra , Contorni, caselle di controllo per Visualizza risultatie Cancella risultati (Figura 1D). Fare clic su OK. Prendere nota del numero di particelle analizzate in un foglio di calcolo che denota il campione e della posizione della pila z.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.5.2–3.5.4 fino a quando non sono stati analizzati tutti gli stack z a fuoco per il campione. Sommare il numero totale di particelle per il campione nel foglio di calcolo per quantificare il numero totale di interazioni.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).</li>
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<li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+alpha%2C+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li>
<li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type%E2%80%93specific+expression+changes+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li>
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<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li>
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<li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+%C3%9F-Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li>
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<li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Parkin+Zone%3A+Mitophagy+without+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo un approccio semplice ed efficiente per utilizzare NRDP1:USP8 PLA in tessuti/cellule di interesse per quantificare la formazione di complessi mitopagia a monte. In precedenza abbiamo confermato la formazione del complesso mitopagy CLEC16A-NRDP1-USP8 nelle cellule beta pancreatiche da diverse metodologie, tra cui esperimenti di co-immunoprecipitazioni, studi di interazione senza cellule e in vitro e analisi dell'ubiquitinazione, e ha dimostrato come questo complesso aziona regolato flusso mitofagico<sup cl...

Le cellule beta pancreatiche producono l'insulina necessaria per mantenere l'omeostasi normale del glucosio e il loro fallimento si traduce nello sviluppo di tutte le forme di diabete. Le cellule beta mantengono una robusta capacità mitocondriale per generare l'energia necessaria per accoppiare il metabolismo del glucosio con rilascio di insulina. Recentemente, è diventato evidente che il mantenimento della massa mitocondriale funzionale è di fondamentale importanza per la funzione ottimale della cella beta1,2,3. Al fine di sostenere la massa mitocondriale funzionale, le cellule beta si basano su meccanismi di controllo di qualità per rimuovere i mitocondri disfunzionali, danneggiati o i mitocondri di invecchiamento4 . Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule beta si basano su una forma specializzata di turnover mitocondriale, chiamata autofagia mitocondriale (o mitopagia), per mantenere il controllo della qualità mitocondriale sia nei roditori che nelle isole umane1, 2,5. Purtroppo, tuttavia, non esisteva un metodo semplice per rilevare la mitofagia, o componenti mitoplasmasi endogenamente espressi, nelle cellule beta pancreatiche umane.
Recentemente abbiamo dimostrato che la regolazione a monte della mitofagia nelle cellule beta si basa sulla formazione di un complesso proteico che comprende i legamenti E3 CLEC16A e NRDP1 e la deubiquitinasi USP81. NRDP1 e USP8 hanno dimostrato indipendentemente di influenzare la mitopfagia attraverso l'azione sull'initiatore di mitopfagia chiave PARKIN6,7. NRDP1 si rivolge a PARKIN per l'ubiquitinazione e la degradazione per spegnere la mitofagia6e USP8 deubiquitinates specificamente PARKIN K6-linked per promuovere la sua traslocazione a mitocondri7. La tecnologia di analisi della legatura di prossimità (PLA) èstata un recente progresso nel campo della biologia dell'interazione delle proteine 8, consentendo la visualizzazione di interazioni endogene di proteine in situ in singole cellule e non è limitata da scarsi materiali campione. Questa metodologia è particolarmente allettante per la biologia delle cellule umane-beta, a causa della disponibilità del campione, unita alla necessità di comprendere i complessi proteici fisiologicamente rilevanti all'interno di tipi di cellule eterogenee.
Utilizzando l'approccio PLA, siamo in grado di osservare i principali complessi mitogeni endogeni nelle cellule beta pancreatiche umane primarie e nelle linee cellulari neuronali, e dimostrare gli effetti di un ambiente diabegenico sul percorso mitopfagia1. In sintesi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare specifici complessi proteici mitopagia in tessuti privi di materiale abbondante, o dove non sono possibili studi convenzionali di interazione proteica.

<table><tbody><tr><td>0,25% di tripsina-EDTA 1X</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td><td>in blocchi Fatto in casa</td><td></td><td>Utilizzare 1X PBS, aggiungere il 10% di siero d'asina e lo 0,3% di detersivo Triton X-100.</td></tr><tr><td>Tampone A</td><td>fatto in casa</td><td></td><td>Per fare 1L: Mescolare 8,8 g di NaCl, 1,2 g di base Tris, 500ul Tween-20, con 750 ml di ddH20. pH a 7,5 con HCl e riempire a 1 litro di soluzione filtrante e conservare a 4C. Portare a RT prima dell'uso sperimentale Tampone</td></tr><tr><td>B</td><td>fatto in casa</td><td></td><td>Per fare 1 litro: mescolare 5,84 g di NaCl, 4,24 g di base Tris, 26 g di Tris-HCl con 500 ml di ddH20. pH a 7,5, e riempire fino a 1 litro. Filtrare la soluzione e conservare una 4C. Portare a RT prima dell'uso sperimentale</td></tr><tr><td>Cy5-coniugato AffiniPure donkey anti-goat</td><td>Jackson Labs</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti di rilevamento Red</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092008-100RXN</td><td>Kit contenente: stock di soluzione di legatura (5X), ligasi, stock di soluzione di amplificazione (5X) e polimerasi.</td></tr><tr><td>Sonda DuoLink PLA anti-topo MINUS</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092004-100RXN</td><td></td></tr><tr><td>Sonda DuoLink PLA anti-coniglio PLUS</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092002-100RXN</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td><td></td><td></td><td></td>fetale bovino</tr> Capra <tr><td>policlonale anti-PDX1 (clone A17)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-14664</td><td>RRID: AB_2162373</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare pancreatica MIN6</td><td>Dono di D. Stoffers</td><td></td><td>Linea cellulare di insulinoma di topo, utilizzata per saggi basati su cellule.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-USP8 (clone US872)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB200527</td><td></td></tr><tr><td>Pap-pen</td><td>Research Products International</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Utilizzare per sigillare le soluzioni anticorpali e sondare le cellule per prevenire l'evaporazione quando si utilizzano piccoli volumi di soluzione.</td></tr><tr><td>PBT (soluzione salina tamponata con fosfato con tritone)</td> fatto <td>in casa</td><td></td><td>Per fare 50 ml: 43,5 ml di H2O, 5 ml di PBS 10X, 0,5 ml di BSA 10X (soluzione di 100 mg/ml), 1 ml di soluzione di tritoni X-100 al 10% in ddH20)</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>PIM(ABS) Siero AB umano</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-ABS001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PIM(G) (glutammina)</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-G001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PIM(S) media</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PR619</td><td>Apex Bio</td><td>A812</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold reagente antidissolvenza con DAPI</td><td>Life Technologies (sonde molecolari)</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio policlonale anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-049A</td><td>RRID: AB_2181251</td></tr><tr><td>cellule SH-SY5Y</td><td>Regalo da L. Satin</td><td></td><td>Linea cellulare di neuroblastoma umano, utilizzata per saggi basati su cellule.</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per il lavoro sull'RNA (acqua DEPC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP361-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

La mitofagia è un percorso di controllo della qualità mitocondriale essenziale, che è fondamentale per la bioenergetica delle cellule beta delle isoloti pancreatiche per alimentare il rilascio di insulina stimolato dal glucosio. La valutazione della mitofagia è impegnativa e spesso richiede giornalisti genetici o molteplici tecniche complementari non facilmente utilizzate in campioni di tessuto, come le isole pancreatiche primarie umane. Qui dimostriamo un approccio robusto per visualizzare e quantificare la formazione di complessi chiave di mitofagia endogena nelle isole pancreatiche primarie. Utilizzando la tecnica di analisi della legatura di prossimità sensibile per rilevare l'interazione dei regolatori di mitopagia NRDP1 e USP8, siamo in grado di quantificare specificamente la formazione di complessi mitopagia essenziali in situ. Accresciuto questo approccio per contrastare la controtendenza per il fattore di trascrizione PDX1, possiamo quantificare i complessi di mitofagia e i fattori che possono compromettere la mitofagia, in particolare all'interno delle cellule beta. La metodologia che descriviamo supera la necessità di grandi quantità di estratti cellulari necessari per altri studi di interazione proteina-proteina, come l'immunoprecipitazioni (IP) o la spettrometria di massa, ed è ideale per preziosi campioni di isole umane generalmente non disponibili in quantità sufficienti per questi approcci. Inoltre, questa metodologia evita la necessità di tecniche di selezione del flusso per purificare le cellule beta da una popolazione di isolotto eterogeneo per applicazioni di proteine a valle. Perquesto, descriviamo un protocollo prezioso per la visualizzazione della mitofagia altamente compatibile per l'uso in popolazioni cellulari eterogenee e limitate.

Abbiamo condotto esperimenti iniziali nella linea di cellule beta pancreatiche MIN6 e nella linea di cellule del neuroblastoma SH-YY5Y SH-YY5Y, per ottimizzare e confermare sia la specificità degli anticorpi che le interazioni proteiche visualizzate. Le cellule MIN6 sono state placcate su coverlips a 30.000 celle / mL e lasciate aderire per 48 h, le cellule SH-SY5Y sono state placcate su coverlips a 15.000 celle / mL e lasciate aderire per 24 h. Il protocollo PLA è stato poi seguito come ...

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Questo protocollo ci consente di monitorare i complessi endogeni di micofagia nei tessuti umani come le cellule beta, facilitando la ricerca sulla micofagia nei tessuti fondamentali traslazionemente rilevanti. Un vantaggio di questa tecnica è la sua capacità di visualizzare importanti complessi di micofagia in vivo in tessuti con una disponibilità rara o in piccoli numeri di campione. Dopo l'isolamento secondo i protocolli standard, la coltura da quattro a sei volte 10 al terzo isolotto umano equivalenti in 10 millilitri di mezzo isolotto pancreatico completo per almeno un giorno a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo, usa un microscopio luminoso a dissezione con un ingrandimento tre volte superiore per contare i singoli isolotti umani all'interno della cultura. Raccogliere 40 isolotti per trattamento o condizione di interesse in tubi da 1,5 millilitri di mezzo isolotto. Sedimentare gli isolotti mediante centrifugazione e rimospendare il pellet in un millilitro di PBS integrato con 50 micromolare PR619.Invertire il tubo e raccogliere gli isolotti per centrifugazione per un secondo lavaggio in inibitore fresco della PBS più deubiquitinasi. Dopo la seconda centrifugazione, dissociare gli isolotti in singole cellule con 125 microlitri dello 0,25% di tripside più inibitore per tre minuti a 37 gradi Celsius con pipettazione delicata periodica. Alla fine dell'incubazione, arrestare la reazione con un millilitro di 37 gradi Celsius mezzo isolotto pancreatico riscaldato integrato con PR619.Raccogliere gli isolotti per centrifugazione per due lavaggi in PBS fresco più inibitore per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare gli isolotti dissociati in 150 microlitri di PBS fresco più inibitore. Per l'aderenza e la fissazione dei singoli isolotti, citospin la soluzione cellulare su vetrini al microscopio carico smerigliati e delineare l'area cellulare con una penna idrofobica.Quindi fissare le celle accerchiate con paraformaldeide e PBS al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Per l'analisi immunoistochimica dei campioni di isolotto, lavare le cellule con due lavaggi di cinque minuti in PBS a temperatura ambiente, seguiti da un blocco legante non specifico con siero d'asino al 10% e PBS più 0,3% detergente per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione di blocco, coincubare le cellule con anticorpo primario del topo contro la peptidasi 8 specifica dell'ubiquitina, anticorpo primario del coniglio contro la proteina di degradazione del recettore della neuregulina-1 e un marcatore specifico per l'identificazione delle cellule beta che non è stato sollevato nel topo o nel coniglio in modo da non interferire con il segnale di dosaggio della legatura di prossimità durante la notte a quattro gradi Celsius.La mattina dopo, lavare i campioni con due lavaggi di cinque minuti in PBS su un rocker. Aggiungere anticorpo secondario Cy5 anti-capra a una soluzione di dosaggio di ligation di prossimità preparata al momento. Dopo il secondo lavaggio, etichettare ogni campione di isolotto con 20 microlitri di soluzione di sonda e recuperare gli scivoli con pellicola di plastica per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con due lavaggi di cinque minuti nel tampone A su un rocker seguito da incubazione con 20 microlitri di soluzione di legatura appena preparata integrata con 0,25 unità per microlitro di ligasi per scivolo per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della legatura, lavare le cellule due volte con tampone A per due minuti per lavaggio. Coprire ogni campione con 20 microlitri di soluzioni di amplificazione integrati con polimerasi per un'incubazione da 100 a 120 minuti a 37 gradi Celsius.Per preparare le cellule per l'imaging, lavare i campioni due volte in tampone fresco A per 10 minuti per lavaggio su un rocker seguito da un lavaggio in tampone B 0,1x per due minuti sul rocker. Dopo l'ultimo lavaggio, montare le diapositive con una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI e posizionare con cura un coverslip su ogni campione utilizzando un bisturi per premere eventuali bolle. Quindi sigillare i copripavimenti con smalto chiaro intorno ai bordi.Per immaginire i campioni, posizionare una diapositiva sul palco di un microscopio in grado di catturare più piani focali e selezionare l'ingrandimento 100 volte. Impostare l'altezza della pila Z su circa 0,45 micrometri e i parametri appropriati di eccitazione ed emissione del segnale di macchia, controsostenimento e segnale a celle vive. Ottenere almeno nove diverse immagini del piano focale.Per garantire che i segnali di sfondo dell'immagine a fluorescenza e la luce vagante siano ridotti al minimo, elaborare le immagini utilizzando un algoritmo adiacente più vicino alla deconvoluzione bidimensionale utilizzando un software standard di elaborazione delle immagini preferito. Per quantificare le interazioni del saggio di legatura di prossimità, aprire ImageJ e aprire l'immagine del saggio di ligation di prossimità. A partire dalla prima immagine con lo stato attivo, fare clic su Immagine e selezionare Regola e soglia.Regolare la soglia per rimuovere tutto il segnale di dosaggio della legatura di prossimità non specifico e prendere nota della regolazione della soglia per cercare di mantenere il segnale coerente durante l'analisi. Fate clic su Elabora (Process) e selezionate Binario (Binary) e Rendi binario (Make Binary). Verificare che Dimensione sia impostata su zero su infinito, Circolarità è impostata su zero su uno, Mostra è impostato su Contorni e selezionare le caselle Visualizza risultati e Cancella risultati.Si noti il numero di particelle analizzate in un foglio di calcolo che indica il campione e la posizione dello stack Z. Quindi fate clic su Analizza (Analyze) e analizza particelle (Analyze and Analyze Particles) per misurare le particelle. Quando tutti gli Z-stack a fuoco per il campione sono stati analizzati, inviare il numero totale di particelle per il campione nel foglio di calcolo per quantificare il numero totale di interazioni.Gli anticorpi utilizzati nel saggio di prossimità sono specifici per i ligandi e non dimostrano alcuna sovrapposizione. Come osservato, il protocollo di dispersione è altamente efficiente nell'ottenere singole cellule nel campo visivo del microscopio per l'analisi a valle e la colorazione delle cellule beta viene mantenuta a seguito di un saggio di legatura di prossimità nella colorazione degli isolotti umani primari. Utilizzando le tecniche dimostrate, si potrebbe determinare che l'interazione della proteina di degradazione del recettore della neuregulina-1 e della peptidasi 8 specifica dell'ubiquitina è diminuita a seguito di un'esposizione di 48 ore al palmitato, evidenziando la fattibilità di questo saggio per valutare i principali fattori di mitofagia endogena a seguito di stimoli diabetogenici.L'efficiente e delicata dispersione degli isolotti umani è essenziale per garantire la quantificazione delle corrette popolazioni cellulari a valle. Il PLA consente la valutazione di importanti complessi di micofagia in campioni di isolotti umani consentendo l'analisi della micofagia e campioni di pazienti umani biologicamente importanti che spostano il campo della ricerca sul diabete in avanti.

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Il protocollo seguente delinea il processo di dissezione del pancreas per l'imaging fetta virtuale, e la successiva quantificazione di tutte le GFP-tagged beta-cellule del pancreas intero.

Quantificazione in situ di cellule beta pancreatiche Messa in topi

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.

Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità

La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l'osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.

Visualizzazione della mitofagia con coloranti fluorescenti per mitocondri e lisosomi

La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità

L'obiettivo di questo protocollo è determinare i livelli autofagici nel cancro del pancreas e nelle cellule acinose pancreatiche attraverso l'immunofluorescenza LC3 e la quantificazione dei punti LC3.

Valutazione dei livelli di autofagia in due diversi modelli di cellule pancreatiche utilizzando l'immunofluorescenza LC3

Questo protocollo delinea due metodi per l'analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche: in primo luogo, una combinazione di coloranti specifici per mitocondri permeabili alle cellule e, in secondo luogo, un reporter mitofagico geneticamente codificato. Queste due tecniche sono complementari e possono essere implementate in base a esigenze specifiche, consentendo flessibilità e precisione nell'affrontare quantitativamente il controllo di qualità mitocondriale.

Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche

Questo studio utilizza marcatori di morte cellulare e apoptosi basati sulla fluorescenza multi-colorazione combinati con la microscopia confocale per valutare l'apoptosi indotta da citochine e la morte specifica delle cellule β nelle isole pancreatiche. Rivela cambiamenti spaziali e temporali nella morte cellulare e nell'apoptosi in risposta a stimoli extracellulari.

Trattamento isolato delle isole pancreatiche e misurazione dell'apoptosi

Scopri la visualizzazione di complessi mitofagici endogeni in cellule beta pancreatiche umane mediante l'assay di ligazione di prossimità. Questo metodo consente l'analisi quantitativa con campioni biologici limitati.

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Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

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