Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Questo protocollo ci consente di monitorare i complessi endogeni di micofagia nei tessuti umani come le cellule beta, facilitando la ricerca sulla micofagia nei tessuti fondamentali traslazionemente rilevanti. Un vantaggio di questa tecnica è la sua capacità di visualizzare importanti complessi di micofagia in vivo in tessuti con una disponibilità rara o in piccoli numeri di campione. Dopo l'isolamento secondo i protocolli standard, la coltura da quattro a sei volte 10 al terzo isolotto umano equivalenti in 10 millilitri di mezzo isolotto pancreatico completo per almeno un giorno a 37 gradi Celsius.

Il giorno dopo, usa un microscopio luminoso a dissezione con un ingrandimento tre volte superiore per contare i singoli isolotti umani all'interno della cultura. Raccogliere 40 isolotti per trattamento o condizione di interesse in tubi da 1,5 millilitri di mezzo isolotto. Sedimentare gli isolotti mediante centrifugazione e rimospendare il pellet in un millilitro di PBS integrato con 50 micromolare PR619.

Invertire il tubo e raccogliere gli isolotti per centrifugazione per un secondo lavaggio in inibitore fresco della PBS più deubiquitinasi. Dopo la seconda centrifugazione, dissociare gli isolotti in singole cellule con 125 microlitri dello 0,25% di tripside più inibitore per tre minuti a 37 gradi Celsius con pipettazione delicata periodica. Alla fine dell'incubazione, arrestare la reazione con un millilitro di 37 gradi Celsius mezzo isolotto pancreatico riscaldato integrato con PR619.

Raccogliere gli isolotti per centrifugazione per due lavaggi in PBS fresco più inibitore per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare gli isolotti dissociati in 150 microlitri di PBS fresco più inibitore. Per l'aderenza e la fissazione dei singoli isolotti, citospin la soluzione cellulare su vetrini al microscopio carico smerigliati e delineare l'area cellulare con una penna idrofobica.

Quindi fissare le celle accerchiate con paraformaldeide e PBS al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Per l'analisi immunoistochimica dei campioni di isolotto, lavare le cellule con due lavaggi di cinque minuti in PBS a temperatura ambiente, seguiti da un blocco legante non specifico con siero d'asino al 10% e PBS più 0,3% detergente per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione di blocco, coincubare le cellule con anticorpo primario del topo contro la peptidasi 8 specifica dell'ubiquitina, anticorpo primario del coniglio contro la proteina di degradazione del recettore della neuregulina-1 e un marcatore specifico per l'identificazione delle cellule beta che non è stato sollevato nel topo o nel coniglio in modo da non interferire con il segnale di dosaggio della legatura di prossimità durante la notte a quattro gradi Celsius.

La mattina dopo, lavare i campioni con due lavaggi di cinque minuti in PBS su un rocker. Aggiungere anticorpo secondario Cy5 anti-capra a una soluzione di dosaggio di ligation di prossimità preparata al momento. Dopo il secondo lavaggio, etichettare ogni campione di isolotto con 20 microlitri di soluzione di sonda e recuperare gli scivoli con pellicola di plastica per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con due lavaggi di cinque minuti nel tampone A su un rocker seguito da incubazione con 20 microlitri di soluzione di legatura appena preparata integrata con 0,25 unità per microlitro di ligasi per scivolo per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della legatura, lavare le cellule due volte con tampone A per due minuti per lavaggio. Coprire ogni campione con 20 microlitri di soluzioni di amplificazione integrati con polimerasi per un'incubazione da 100 a 120 minuti a 37 gradi Celsius.

Per preparare le cellule per l'imaging, lavare i campioni due volte in tampone fresco A per 10 minuti per lavaggio su un rocker seguito da un lavaggio in tampone B 0,1x per due minuti sul rocker. Dopo l'ultimo lavaggio, montare le diapositive con una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI e posizionare con cura un coverslip su ogni campione utilizzando un bisturi per premere eventuali bolle. Quindi sigillare i copripavimenti con smalto chiaro intorno ai bordi.

Per immaginire i campioni, posizionare una diapositiva sul palco di un microscopio in grado di catturare più piani focali e selezionare l'ingrandimento 100 volte. Impostare l'altezza della pila Z su circa 0,45 micrometri e i parametri appropriati di eccitazione ed emissione del segnale di macchia, controsostenimento e segnale a celle vive. Ottenere almeno nove diverse immagini del piano focale.

Per garantire che i segnali di sfondo dell'immagine a fluorescenza e la luce vagante siano ridotti al minimo, elaborare le immagini utilizzando un algoritmo adiacente più vicino alla deconvoluzione bidimensionale utilizzando un software standard di elaborazione delle immagini preferito. Per quantificare le interazioni del saggio di legatura di prossimità, aprire ImageJ e aprire l'immagine del saggio di ligation di prossimità. A partire dalla prima immagine con lo stato attivo, fare clic su Immagine e selezionare Regola e soglia.

Regolare la soglia per rimuovere tutto il segnale di dosaggio della legatura di prossimità non specifico e prendere nota della regolazione della soglia per cercare di mantenere il segnale coerente durante l'analisi. Fate clic su Elabora (Process) e selezionate Binario (Binary) e Rendi binario (Make Binary). Verificare che Dimensione sia impostata su zero su infinito, Circolarità è impostata su zero su uno, Mostra è impostato su Contorni e selezionare le caselle Visualizza risultati e Cancella risultati.

Si noti il numero di particelle analizzate in un foglio di calcolo che indica il campione e la posizione dello stack Z. Quindi fate clic su Analizza (Analyze) e analizza particelle (Analyze and Analyze Particles) per misurare le particelle. Quando tutti gli Z-stack a fuoco per il campione sono stati analizzati, inviare il numero totale di particelle per il campione nel foglio di calcolo per quantificare il numero totale di interazioni.

Gli anticorpi utilizzati nel saggio di prossimità sono specifici per i ligandi e non dimostrano alcuna sovrapposizione. Come osservato, il protocollo di dispersione è altamente efficiente nell'ottenere singole cellule nel campo visivo del microscopio per l'analisi a valle e la colorazione delle cellule beta viene mantenuta a seguito di un saggio di legatura di prossimità nella colorazione degli isolotti umani primari. Utilizzando le tecniche dimostrate, si potrebbe determinare che l'interazione della proteina di degradazione del recettore della neuregulina-1 e della peptidasi 8 specifica dell'ubiquitina è diminuita a seguito di un'esposizione di 48 ore al palmitato, evidenziando la fattibilità di questo saggio per valutare i principali fattori di mitofagia endogena a seguito di stimoli diabetogenici.

L'efficiente e delicata dispersione degli isolotti umani è essenziale per garantire la quantificazione delle corrette popolazioni cellulari a valle. Il PLA consente la valutazione di importanti complessi di micofagia in campioni di isolotti umani consentendo l'analisi della micofagia e campioni di pazienti umani biologicamente importanti che spostano il campo della ricerca sul diabete in avanti.