Name: Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Scopri l'assaggio di uccisione opsonofagocitica per valutare le risposte immunitarie contro Streptococcus pneumoniae. Questo metodo standard aiuta i ricercatori a studiare l'efficacia degli anticorpi e le terapie immunologiche.

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Ringraziamo il dottor Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) per la sua preziosa assistenza nella creazione di saggi OPKA nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute Grant 1R01AI123383-01A1 a FYA.

1. la cultura, la differenziazione e la convalida delle cellule HL-60

<ol><li>Preparare terreni di coltura delle cellule HL-60 composto da 500 mL RPMI con L-Glutammina e 50ml inattivati siero bovino fetale. Non aggiungere antibiotici come questo può influenzare la differenziazione delle cellule HL-60.</li>
	<li>Per propagazione/manutenzione delle cellule HL-60, 5 x 106 cellule in 10 mL di terreni di coltura delle cellule HL-60 75 cm2 sfiato matracci a 37 ° C e 5% CO2. Passaggio cellule ogni 3 − 4 giorni per mantenere le concentrazioni di cellulare ottimale. Nota: Concentrazione delle cellule non deve superare 5 x 106/ml.</li>
	<li>Generare lavoro scorte delle cellule HL-60 aliquotare circa 1 x 106 cellule/mL in terreni di coltura HL60 con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) in 1 mL provette criogeniche. Nota: Scorte di lavoro possono essere conservate a-80 ° C. Lo stock master deve essere conservato a-120 ° C.</li>
	<li>Differenziare cellule HL-60 di coltura 1.5 x 107 cellule in 15 mL di terreno di coltura delle cellule HL-60 con 0,6% N, N-dimetilformammide (DMF) a 37 ° C e 5% di CO2 in boccette2 75cm con tappo filtro sterile per 3 giorni prima del OPKA.</li>
	<li>Verificare che le cellule HL-60 sono state differenziate con successo e sono idonee all'uso nell'analisi della OPKA di test di vitalità e gli indicatori di superficie delle cellule secondo stabilito flusso cytometry protocolli16,17, 18,19. Dopo la differenziazione, raccogliere le cellule HL-60 e macchia circa 1 x 104 cellule con anticorpi/macchie coniugato fluorescente per CD71, CD35, Annessina V e ioduro di propidio. Nota: Le cellule differenziate dovrebbero essere ≥ 65% vitali, ≥ 55% CD35+e ≤ 20% CD71 stabilito+ come determinato tramite convalida protocolli14 (Figura 1).</li>
</ol>
2. preparazione del buffer OPKA e reagenti

<ol><li>Preparare 50 mL di tampone sterile opsonizzazione B (OBB) mescolando 42,5 mL di 1x sterile tampone fosfato salino (PBS) con Ca2 +/Mg2 +, 5 mL di siero bovino fetale inattivati e 2,5 mL di 0,1% gelatina sterile. Conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Ottenere il coniglio del bambino complemento e conservare a-80 ° C.</li>
	<li>Ottenere o preparare piastre di coltura batterica (cioè, piastre di agar sangue di montone al 5% 15 x 100 mm2 ).</li>
</ol>
3. preparazione dei campioni Stock batterici

<ol><li>Ottenere uno stock di ceppo batterico da testare. Nota: Per questo protocollo, sierotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornito da dottor Moon Nahm) viene utilizzato.</li>
	<li>Crescere il ceppo batterico in un brodo appropriato (cioè, Todd-Hewitt brodo + 0,5% di Estratto di lievito per questo ceppo WU2) per circa 2−4 h a 37 ° C. Nota: La densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura deve essere compreso tra 0,6 e 0,8.</li>
	<li>A pellet i batteri mediante centrifugazione a 6.000 x g per 2 min e risospendere le cellule in 10−30 mL di glicerolo al 15% nel brodo appropriato. Aliquotare la coltura batterica (500 µ l in ogni aliquota) in provette sterili da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.</li>
	<li>Disgelo fuori un flaconcino di stock batterici in bagnomaria a 37 ° C. Agglomerare le cellule batteriche e risospendere in 500 µ l di OBB in condizioni sterili.</li>
	<li>Preparare diluizioni differenti dello stock batterici in OBB (vale a dire, 10 µ l di Nessuna diluizione, 10 µ l di 01:10, 10 µ l di 1: 100, ecc.). Eseguire l'analisi OPKA (sezioni 4 – 6, tra cui co-cultura HL-60/complemento) come descritto di seguito utilizzando varie diluizioni dello stock batterica non trattata. Coltura le piastre durante la notte a 30 ° C (senza CO2). Nota: La temperatura di 30 ° C è specifica per WU2 prevenire la crescita eccessiva; altri ceppi/sierotipi possono crescere in modo ottimale a 37 ° C.</li>
	<li>Contare le colonie per ciascuna diluizione delle azione batterica non trattata co-coltivate con complemento e cellule HL-60. Determinare quale diluizione di batteri produce il numero ottimale di colonie numerabili (circa 80−120 CFUs per batteri non trattati co-coltivati con cellule HL-60). Nota questa diluizione per futuri OPKAs che coinvolgono questo stock batterico.</li>
</ol>
4. cultura e trattamento batterico

<ol><li>Scongelare una provetta di brodo batterico preparata al punto 3.3. A pellet batteri (6.000 x g per 2 min) e risospendere il pellet cellulare in OBB a una diluizione ottimale come determinato al punto 3.6.</li>
	<li>Pipettare 10 µ l di sedimento diluizione batterica per pozzetto in una piastra di coltura di cella di 96 pozzetti di turno-inferiore.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di trattamento appropriato dell'anticorpo o droga ad ogni pozzetto sperimentale in duplice copia. Nota: In questo protocollo, un sierotipo specifico anticorpo generato nei topi è aggiunto come trattamento X e un enzima di idrolasi del glicoside conosciuto a degradare la capsula del polisaccaride 3 sierotipo è aggiunto come trattamento Y (Figura 2)4,20. Per pozzetti di controllo, utilizzare 1X PBS o OBB, a seconda del buffer utilizzato per pozzi di trattamento.</li>
	<li>Agitare la piastra campione a circa 90 rpm per 1 h a temperatura ambiente. Regolare queste Condizioni a seconda della temperatura ottima o agitazione di trattamenti in fase di test.</li>
</ol>
5. HL-60 Co-coltura batterica

<ol><li>Preparare le cellule HL-60 raccogliendo le cellule HL-60 differenziati che sono trattate con DMF tre giorni prima (Vedi punto 1.4) in provette coniche da 15 mL. Appallottolare le celle (500 x g, 3 min), scartare il surnatante e lavare almeno 10 ml di PBS 1X.</li>
	<li>Agglomerare le cellule lavate (500 x g, 3 min), scartare il surnatante e risospendere le cellule in OBB (iniziare con 1 mL OBB e regolare per una concentrazione finale di 1 x 107/ml dopo il conteggio delle cellule).</li>
	<li>Aggiungere complemento di coniglio bambino (siero di coniglio bambino sterile, non diluito, età 3 − 4 settimane) in un volume finale di 1:5. Nota: La concentrazione finale della miscela HL-60-complemento dovrebbe essere 1 x 107/ml. Se il test dipendenza di complemento, una seconda soluzione contenente cellule HL-60 attive con complemento inattivati al calore può essere utilizzata (complemento può essere inattivato incubando in un bagno di acqua a > 55 ° C per almeno 30 min).</li>
	<li>Dopo coltura batterica 1h è completa (punto 4.4), dividere ogni campione (vale a dire, 10 µ l di ogni 30 µ l di campione fino a due nuovi pozzi) in pozzetti duplicati per i due gruppi (cioè, uso solo 20 µ l della co-cultura 30 µ l originale per tenere conto per pipettaggio errore) : un set verranno co-coltivato con HL-60-complemento e uno includerà solo i batteri. Aggiungere 50 µ l della miscela HL-60-complemento (dal punto 5.3) per ogni gruppo sperimentale di pozzi (delegati + HL-60); aggiungere 50 µ l di OBB da solo ai pozzetti di batteri solo (delegati -HL-60). Nota: In questo esempio, vengono utilizzati circa 800 CFUs batterica per la co-coltura con cellule HL-60 5 x 10550 µ l. Se questa molteplicità di infezione è troppo alto o troppo basso, come indicato da un numero finale di Colonia, regolare la diluizione batterica iniziale in contrasto con il conteggio delle cellule HL-60.</li>
	<li>Agitare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 1 h (non di CO2).</li>
</ol>
6. campione placcatura e incubazione Overnight

<ol><li>Diluire ciascun pozzetto 1:5 con OBB, in modo che ogni campione ha un volume di almeno 50 µ l.</li>
	<li>Pipettare 50 µ l di ciascun campione direttamente su un'area di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra campioni. Per 15 x 100 millimetri rotonda2 piastre di agar, campioni di dispensare circa 4 su un piatto.</li>
	<li>Coprire e lasciar campioni ad asciugare per circa 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Capovolgere le piastre e coltura durante la notte a 30 ° C (senza CO2). In alternativa, piastre in vasetti anaerobiche per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o a controllo per morfologia della coltura.</li>
	<li>Dopo una notte cultura, contare le colonie in ogni area campione designato. Analizzare dati confrontando il numero di cellule vive in ogni set di controllo corrispondente e/o campioni che non ricevono co-coltura delle cellule HL-60 (indicativo di sopravvivenza delle cellule di 100%, 0% delle cellule di uccisione).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
<li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li>
<li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
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<li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li>
<li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li>
<li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li>
<li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
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<li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li>
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<li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+high-throughput%2C+automated+counting+of+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li>
<li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).</li>
<li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).</li>
<li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells%3A+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li>
<li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

OPKAs servire ruoli essenziali nella valutazione risposte immunitarie anticorpo mediata indotte dalla vaccinazione6,8. Il significato principale di questo OPKA semplificata è l'adattabilità nelle condizioni per essere testati (cioè, anticorpi, enzimi trattamenti, ecc.). In questo senso, mentre questo test può essere utilizzato per verificare il contributo di opsonine (cioè anticorpi) nella fagocitosi, può anche essere utilizzato per valutare il modo di superare i...

L'anticorpli uccidendo assay (OPKA) sono uno strumento critico per il collegamento di alterazioni nella struttura batterica o funzione alle successive modifiche nella risposta immunitaria e la funzione. Come tale, esso è frequente come analisi complementare per determinare il sistema immunitario l'efficacia di trattamenti anticorpali, vaccini candidati, ottimizzazione degli enzimi, ecc. Saggi in vivo sono necessari per determinare l'effettiva liquidazione o protezione in un modello di infezione batterica, il OPKA può essere utilizzato per valutare il contributo immune alla morte delle cellule batteriche componenti di base al massimo: batteri, cellule immunitarie e sperimentale trattamenti. Gli studi precedenti hanno dimostrato che la OPKAs può essere modificato e utilizzato per una varietà di batteri e sierotipi, tra cui1di Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Inoltre, queste analisi ottimizzate possono essere utilizzate per valutare i diversi trattamenti sperimentali, tra cui la possibilità di un enzima per rendere più accessibile ai trattamenti di4 e l'anticorpo di complemento-mediata di cellule immuni per migliorare il batterio opsonizzazione5. Classicamente, analisi di OPKA è stato utilizzato con successo nella ricerca clinica e di base impostazioni come un indicatore potente per la protezione indotta da anticorpi patogeni specifici6,7,8,9 .
Diversi tipi di cellule del sistema immunitario possono essere utilizzati per la valutazione dell'uccisione di anticorpli. Una popolazione fagocitica comunemente usato è la linea di cellule leucemiche umane HL-60. Questa linea cellulare può essere mantenuta come inattivato promielociti nella cultura; Tuttavia, possono essere differenziati in vari stati attivati via droga diversi trattamenti10,11. Trattamento di HL60 con N, N-dimetilformammide differenzia la linea cellulare in neutrofili attivati con forte attività fagocitica11. Mentre le cellule HL-60 sono state ottimizzate e sono frequentemente utilizzate per questi test di fagocitosi10, altri leucociti polimorfonucleari primari è utilizzabile come il braccio immune dell' esperimento12.
Inoltre, queste analisi possono essere semplificata13 o multiplex14 a guardare più ceppi resistenti agli antibiotici dei batteri da testare. Il metodo multiplex è stato reso più fattibile attraverso lo sviluppo di software che può contare in modo efficiente Colonia batterica formando unità (CFUs) al posto su una piastra di agar15. Qui, descriviamo un metodo semplificato utilizzando un ceppo batterico, cellule HL-60, complemento di coniglio bambino e piastre di agar sangue. Con questo metodo, i trattamenti multipli possono essere valutati rapidamente per affrontare questioni di ricerche specifiche su come può essere modulata la risposta immunitaria innata alle infezioni batteriche.

<table><tbody><tr><td>Annessina V (coniugata con APC)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD35, umana (coniugata con PE)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD71, umana (coniugata con PE)</td><td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr><tr><td>ceppo batterico da utilizzare (ad es. Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Laboratorio di riferimento respiratorio batterico (Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastre di agar per sangue</td><td>Hardy Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Siero clone fetale</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 cellule</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG (PE coniugato)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformammide (DMF)</td><td>Fisher Chimico</td><td>UN2265</td><td></td></tr><tr><td>ioduro di propidio</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media con L-glutammina</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Un aspetto chiave della risposta immunitaria a colonizzazione batterica dell'host è la fagocitosi. Un'analisi di uccisione di anticorpli (OPKA) è una procedura sperimentale in cui le cellule fagocitiche sono co-coltivate con unità batterica. Le cellule immunitarie verranno fagocitare e uccidere le colture batteriche in modo complemento-dipendente. L'efficienza dell'uccisione delle cellule immuno-mediata è dipendente da una serie di fattori e può essere utilizzato per determinare batterica come le diverse culture confrontare per quanto riguarda la resistenza alla morte cellulare. In questo modo, può essere valutata l'efficacia di potenziali terapie basate su immunitario contro ceppi batterici specifici e/o sierotipi. In questo protocollo, descriviamo un OPKA semplificata che utilizza condizioni di cultura di base e delle cellule di conteggio per determinare la vitalità cellulare batterica dopo co-coltura con condizioni di trattamento e le cellule immunitarie di HL-60. Questo metodo è stato utilizzato con successo con un numero di diversi sierotipi pneumococcici, capsulari e ceppi di acapsular e altre specie batteriche. I vantaggi di questo protocollo OPKA sono la sua semplicità, versatilità (come questo test non è limitato ai trattamenti di anticorpo come opsonine) e la minimizzazione del tempo e reagenti per valutare gruppi sperimentali di base.

Convalida di differenziazione di HL-60 deve essere eseguita prima di iniziare la OPKA. Questa operazione può essere eseguita mediante citometria a flusso per determinare l'espressione extracellulare di CD11b, CD35, CD71 e Annessina V (Figura 1). Ioduro di propidio può essere utilizzato anche come un indicatore di redditività. Dopo essere stati trattati con DMF per 3 giorni, dovrebbe essere aumentata espressione di CD35 (≥ 55% di tutte le cellule) e deve essere diminuita espressione di CD71 (...

Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Questo saggio collega la modulazione della struttura batterica e della funzione all'attività antibatterica basata sulle cellule immunitarie. Come tale, un'immunoterapeutica chiave di un potenziale trattamento può essere valutata nel determinare la probabilità di una migliore clearance batterica. Il saggio di uccisione opsonofagocitica serve tradizionalmente come gold standard per valutare le funzioni efficaci degli anticorpi sollevati contro il batterio come osservante.Questo protocollo offre semplicità e versatilità rispetto ai test standardizzati ad alta produttività esistenti. In questo protocollo, studiamo gli effetti di un trattamento farmacologico sulla polmonite da streptococco e come questi effetti si traducono in una migliore fagocitosi del batterio. Qui, applichiamo l'OPKA alle cellule della polmonite dello streptococco.Tuttavia questo protocollo può essere adottato per valutare l'uccisione fagocitica di altri agenti patogeni da parte delle cellule immunitarie. Dedicare tempo per ottimizzare le scorte batteriche e garantire che i CFC finali da contare rientrano nell'intervallo ottimale. Si consiglia vivamente di utilizzare la citometria a flusso per garantire che le cellule HL60 siano vitali e attive e provare diverse condizioni di coltura per garantire cellule funzionalmente attive.La dimostrazione visiva fornirà una migliore comprensione di come il campione deve essere placcato e come ottenere campioni contati. Per iniziare, preparare i mezzi di coltura cellulare HL60 composti da 500 millilitri RPMI integrati con L-glutammina e 15 millilitri riscaldano il siero bovino fetale inattivato. Per la propagazione e il mantenimento di cellule HL60, coltura di cinque milioni di cellule in 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare HL60 in contenitori ventilati di 75 centimetri quadrati a 37 gradi celsius e anidride carbonica al cinque%.Per generare scorte di lavoro di cellule HL60, aggiungere circa un milione di cellule per millilitro nei mezzi di coltura HL60 integrati con solfossido di dimetile al 10% in un tubi criogenici millilitro. Per differenziare le cellule HL60, coltura 1,5 per 10 per le sette cellule in 15 millilitri di ambienti di coltura cellulare HL60 integrati con 0,6%DMF in filtro sterile limitato 75 flaconi di centimetri quadrati a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per tre giorni prima di OPKA. Per preparare i campioni di stock batterici, far crescere il ceppo batterico WU2 in un brodo appropriato per circa due o quattro ore a 37 gradi Celsius.Successivamente, pelletare i batteri per centrifugazione a seimila volte G per due minuti e rimescolare le cellule in 10-30 millilitri di 15%glicerolo nel brodo appropriato. Aliquotare la coltura batterica in tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri e conservare a 80 gradi celsius. Successivamente, scongelare una fiala di stock batterico in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Pellet le cellule batteriche e resuspend in 500 microlitri di FFS in condizioni sterili. Diluizioni della piastra del calcio batterico non trattato sulle placche di agar del sangue e coltura delle piastre durante la notte a 30 gradi Celsius. Dopo la fase di incubazione, contare le colonie per ogni diluizione di stock batterico non trattato co-coltivato con cellule HL60.Registra quale diluizione di batteri produce il numero ottimale di colonie numerabili per i futuri OPKA con questo stock batterico. Scongelare un tubo di calcio batterico. Batteri a pellet a seimila volte G per due minuti e rimosi il pellet cellulare in OBB alla diluizione ottimale ottenuta nella fase precedente.Pipetta 10 microlitri della diluizione batterica rimostrata per pozzo in un fondo rotondo 96 piastra di coltura cellulare del pozzo. Quindi, aggiungere 20 microlitri di un anticorpo appropriato o di un trattamento farmacologico a ciascun pozzo sperimentale in duplice copia. Per i pozzi di controllo, utilizzare 1XPBS o OBB a seconda del tampone utilizzato per i pozzi di trattamento.Agitare la piastra campione a circa 90 giri/min a temperatura ambiente per un'ora. Per raccogliere le cellule differenziate HL60 che vengono trattate con DMF tre giorni prima, pelletare le cellule a 500 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet con almeno 10 millilitri di 1XPBS.Pellet le cellule lavate a 500 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in OBB. Aggiungere siero sterile di coniglio non diluito a un volume finale da uno a cinque.Dopo un'ora di coltura batterica, dividere ogni campione in pozzi duplicati per due gruppi. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della miscela di complementi HL60 a ogni set sperimentale di pozzi e 50 microlitri di OBB solo ai pozzi dei batteri. Agitare la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per un'ora.Per placcare i campioni, diluire ogni pozzo con OBB a uno o cinque volumi finali in modo che ogni campione abbia un volume di almeno 50 microlitri. Successivamente, pipetta 50 microlitri di ciascun campione direttamente su un'area designata di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra i campioni. Coprire e lasciare asciugare i campioni per circa 15 minuti a temperatura ambiente.Invertire i piatti e la coltura durante la notte a 30 gradi celsius. In alternativa, piastre di coltura in barattoli anaerobici per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o per controllare la morfologia. Dopo la coltura notturna, contare le colonie in ogni area campione designata e procedere all'analisi dei dati confrontando il numero di cellule vive in ogni set con i controlli corrispondenti.Gli aspetti più difficili della creazione di questa tecnica per la prima volta saranno probabilmente l'ottimizzazione dei CFC di partenza dello stock batterico, oltre a garantire che le cellule HL60 siano efficacemente differenziate. Prima di iniziare l'OPKA, la differenziazione HL60 è stata convalidata usando la citometria del flusso con ioduro di propidio come marcatore di vitalità. Dopo essere stato trattato con DMF per tre giorni, l'espressione di CD35 è stata aumentata e l'espressione di CD71 è stata ridotta.Le percentuali medie di CFC batterici nei gruppi trattati con HL60 rispetto ai corrispondenti gruppi trattati non HL60 sono state utilizzate per confrontare la sopravvivenza cellulare batterica di diversi trattamenti. I risultati hanno mostrato che con un trattamento efficace, il numero di colonie era diverso tra la co-coltura HL60 e nessuna cellule HL60, indicativa di fagocitosi più efficiente. I risultati hanno mostrato che quando la diluizione batterica non è stata ottimizzata o la crescita della colonia non è stata osservata con attenzione dopo la placcatura, la crescita troppo delle colonie poteva impedire un conteggio accurato delle colonie.La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è monitorare attentamente l'incubazione batterica in modo da evitare la crescita troppo dei CFC. I saggi in vivo possono essere utilizzati per valutare un'efficace clearance batterica all'interno di un ospite. Questi test possono essere utilizzati per confermare l'efficacia immunitaria osservata con l'OPKA sono traducibili in modelli umani o animali.Il saggio di uccisione opsonofagocitica è stato usato con grande effetto in precedenti studi di ricerca significativi per collegare le terapie antibatteriche alle risposte immunitarie fagostiche. Lavorare con agenti patogeni batterici può essere pericoloso. Si prega di indossare dispositivi personali protettivi in ogni momento durante questo test.

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Vi presentiamo un elevato throughput saggio citometria a flusso per determinare l'attività fagocitaria dei antigene-anticorpi specifici da campioni clinici, utilizzando l'antigene fluorescenti rivestite perline e una linea cellulare monocitica esprimono più recettori Fc, fornendo utilizzo del recettore e determinazioni attività fagocitaria in una forma standardizzata e moda riproducibile per qualsiasi antigene di interesse.

Determinazione dell&#39;attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici

Fonte: Nagre, N., et al. Macrofagi alveolare, fagocitosi e eliminazione dei batteri nei topi. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra la valutazione della fagocitosi mediata dai recettori del complemento utilizzando globuli rossi di pecora opsonizzati con IgM e complemento, seguita dalla loro acquisizione da parte dei macrofagi del topo. L'entità della fagocitosi viene quantificata midendo un prodotto cromogenico blu formato tramite ossidazione catalizzata dall'emoglobina del diaminofluorene.

Modellazione della fagocitosi mediata dal complemento utilizzando globuli rossi opsonizzati in vitro

Fonte: Seman, B. G., et.al. Modello di imaging neonatale della sepsi batterica Gram-negativa. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'isolamento di neutrofili e monociti infiammatori dalle milze neonatali di topo e la loro applicazione in un saggio batterico luminescente che uccide. Copre la dissociazione meccanica, la lisi dei globuli rossi, l'arricchimento cellulare a base di perle magnetiche, l'incubazione batterica e la protezione antibiotica. Le letture di luminescenza a tempo indicano...

Valutazione in vitro della uccisione batterica da parte dei fagociti splenici neonatali del topo

Questo video dimostra una tecnica per valutare l'attività battericida mediata dal complemento degli anticorpi presenti nel siero. Questo approccio combina siero isolato con batteri patogeni e proteine esogene del complemento. Dopo l'incubazione, i batteri vengono coltivati su una piastra di agar e le colonie prodotte vengono quantificate per misurare il titolo battericida sierico.

Un test battericida sierico per l'attività battericida mediata dal complemento degli anticorpi

In questo video, dimostriamo un test per rilevare la citotossicità di ceppi virulenti e meno virulentidi S taphylococcus aureus contro neutrofili umani dopo fagocitosi utilizzando la citometria a flusso.

Saggio di citotossicità di ceppi di Staphylococcus aureus su neutrofili dopo fagocitosi

Il video mostra un test di uccisione opsonofagocitaria in vitro utilizzando una co-coltura di neutrofili umani con Streptococcus pneumoniae. Gli anticorpi e le proteine del complemento facilitano l'opsonizzazione dei batteri, consentendo ai neutrofili di riconoscere e uccidere i batteri, mostrando un'attività opsonofagocitaria di successo.

Valutazione dell'attività di uccisione opsonofagocitaria contro patogeni batterici

Questo video dimostra un test di aderenza all'opsono per esaminare l'interazione tra batteri opsonizzati e cellule immunitarie. I batteri marcati in fluorescenza, trattati con siero di prova contenente anticorpi anti-capsula, vengono incubati con macrofagi. Dopo aver colorato i macrofagi con la fluorescenza, i batteri attaccati sulla superficie dei macrofagi vengono osservati al microscopio per la visualizzazione.

Un test di aderenza all'opsono per valutare l'opsonizzazione dei batteri incapsulati da parte degli anticorpi anti-capsula

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività del Shigellacidal degli anticorpi nel siero. Siero è mescolato con batteri e complemento esogeno, incubate, e la miscela di reazione è placcata su piastre di agar. Batteri vitali formano colonie che sono contati, utilizzando un enumeratore di Colonia automatizzato e utilizzata per determinarne il titolo battericida.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

Scopri l'assaggio di uccisione opsonofagocitica per valutare le risposte immunitarie contro Streptococcus pneumoniae. Questo metodo standard aiuta i ricercatori a studiare l'efficacia degli anticorpi e le terapie immunologiche.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

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