Indagare sulle alterazioni nel caecum Microbiota dopo una lesione cerebrale traumatica nei topi
19 settembre 2019
Presentato qui è un protocollo per indurre lesioni cerebrali traumatiche diffuse utilizzando un dispositivo a percussione fluida laterale seguito dalla raccolta del contenuto di caecum per l'analisi del microbioma intestinale.
La simultaneità e le interazioni delle linee tra il cervello e il microbiota intestinale rimangono sconosciute. Utilizzare questa tecnica, è possibile esaminare le alterazioni del microbiota intestinale dopo lesioni cerebrali traumatiche nei topi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice ed efficiente.
A dimostrare la procedura sarà Wendong You, uno studente laureato del mio laboratorio. Per l'induzione traumatica di lesioni cerebrali, confermare una mancanza di risposta al dito del piede in un topo anestetizzato e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Dopo la rasatura, disinfettare la pelle esposta del cuoio capelluto con il 70% di etanolo prima di incisione del cuoio capelluto in un piano sagittale.
Usando le forcep, ritrarre l'incisione su entrambi i lati e separare leggermente il periosteo. Utilizzare un marcatore per disegnare un cerchio di tre millimetri di diametro sull'area parietale destra del cranio a due millimetri di distanza dalla linea mediana. Utilizzare un trapano elettrico per penetrare attentamente nel cranio senza danneggiare la dura.
Rimuovere il lembo osseo per esporre una finestra ossea di tre millimetri e posizionare una cannula di plastica sulla craniotomia. Dopo aver cementato la cannula al cranio con acrilico dentale, utilizzare una siringa da cinque millilitri per riempire la cannula con una soluzione salina sterile dello 0,9%, facendo attenzione ad evitare bolle. Accendere l'oscilloscopio e l'amplificatore.
Verificare che il tubo ad alta pressione del dispositivo di lesione a percussione del fluido laterale sia privo di bolle d'aria e fornire circa 10 impulsi di prova, fino a quando il dispositivo non fornisce un segnale costante. Regolare l'angolo della posizione iniziale del pendolo per raggiungere un'intensità dell'impulso di circa due atmosfere standard e collegare la cannula della lesione al dispositivo di lesione a percussione del fluido laterale. Premere il grilletto per rilasciare il pendolo, inducendo la lesione cerebrale.
Quindi ottenere e trasmettere un impulso alla dura attraverso l'intero sistema di tubi chiuso e riempito di fluido. Dopo l'induzione di lesioni cerebrali, rimuovere la cannula e suturare l'incisione. Quindi posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a quando non è ambulatorio, prima di riportare l'animale nella sua gabbia di casa con accesso ad libitum a cibo e acqua.
Nei punti di tempo sperimentali indicati, esporre l'intestino secondo protocolli standard e utilizzare pinze atraumatiche per separare delicatamente il feco dagli altri tratti intestinali. Quando il tessuto è stato localizzato, tagliare il feco con forbici affilate ed estrarre manualmente il contenuto di caecum su una medicazione sterile. Quindi trasferire il contenuto in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri, per una conservazione di meno 80 gradi Celsius fino all'analisi del microbioma.
Il sequenziamento del DNA ricombinante 16S dimostra una ridotta diversità nel caecum microbiota nei topi tre giorni dopo una lesione cerebrale traumatica, con i taxa più abbondanti all'interno del contenuto di caecum dei gruppi di lesioni cerebrali fittizie e traumatiche mostrati nella figura. Inoltre, il ridimensionamento multidimensionale non metrico rivela cambiamenti nella composizione del caecum microbiota dopo una lesione cerebrale traumatica. Ricorda di mantenere dura intatta durante la perforazione del cranio e di essere gentile quando localizza e separa il caecum da altri tratti intestinali.
Seguendo questa procedura, la colorazione e l'analisi dell'ematossilina e dell'eosina possono essere eseguito per esaminare il cambiamento istologico e la risposta infiammatoria all'interno dei tratti intestinali dopo una lesione cerebrale traumatica.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per indurre un danno cerebrale traumatico (TBI) diffuso utilizzando un dispositivo di percussione fluidica laterale nei topi. Dopo la lesione, lo studio analizza le variazioni della microbiota intestinale raccogliendo il contenuto del cieco per l'analisi. L'approccio mira a chiarire le interazioni tra il danno cerebrale e la composizione della microbiota intestinale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi del microbioma
- Ricerca sulle lesioni cerebrali traumatiche
Sfondo
- Comprendere le relazioni tra cervello e microbiota intestinale è fondamentale nella ricerca sul trauma cranico.
- Le attuali conoscenze su come il trauma cranico influisce sul microbiota intestinale sono limitate.
- L'uso del topo come organismo modello permette condizioni sperimentali controllate.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per indurre un TBI e analizzare i cambiamenti successivi nel microbioma intestinale.
- Indagare le possibili correlazioni tra danno neurologico e diversità della microbiota intestinale.
- Fornire informazioni sugli impatti del TBI sulla salute generale e sulle interazioni con il microbioma.
Metodi Utilizzati
- È stato utilizzato un dispositivo di percussione laterale del liquido per indurre un TBI in topi anestetizzati.
- Sono state eseguite procedure chirurgiche accurate, compresa la penetrazione del cranio e l'implantazione della cannula.
- Dopo la lesione, i contenuti del cieco sono stati raccolti per l'analisi del microbioma e conservati in modo appropriato.
- È stata impiegata la sequenza del gene 16S rDNA per determinare i cambiamenti nella diversità e nella composizione della microbiota.
Risultati principali
- L'analisi ha indicato una ridotta diversità della microbiota del cieco entro tre giorni dal trauma cranico.
- La scalatura multidimensionale non metrica ha dimostrato significativi cambiamenti nella composizione della microbiota a seguito della lesione.
- Lo studio sottolinea la necessità di cautela nella manipolazione dei tessuti e nel mantenimento di condizioni sterili.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce una metodologia per esplorare l'asse intestino-cervello nel contesto del trauma cranico.
- I risultati suggeriscono che il trauma cranico potrebbe alterare la microbiota intestinale, il che potrebbe avere implicazioni sulla ripresa.
- Il miglioramento delle conoscenze riguardo le interazioni tra intestino e cervello potrebbe orientare future strategie terapeutiche per il trauma cranico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una riduzione del rischio meccanicistica dell'asse microbiota-intestino-cervello nella ricerca sulle lesioni cerebrali traumatiche, fornendo un modello riproducibile per valutare le alterazioni del microbioma dopo la lesione. Supporta la validazione degli obiettivi e la scoperta di biomarcatori collegando il trauma neurologico a modifiche quantificabili nella composizione del microbiota del cieco. L'approccio migliora la fiducia predittiva negli studi preclinici standardizzando l'induzione del TBI e le procedure di campionamento del microbioma.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle ipotesi sull'asse intestino-cervello misurando le variazioni della diversità della microbiota dopo l'induzione controllata di TBI.
- Valore operativo: Fornisce una procedura chirurgica e di campionamento standardizzata per la raccolta coerente della microbiota del cieco tra diversi gruppi sperimentali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di sequenziamento del DNA ribosomiale 16S per analizzare le variazioni compositive della microflora in campioni del cieco.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro riproducibile per l'analisi del microbioma che può essere integrato in procedure di screening per terapie mirate all'intestino.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie correlando la gravità del trauma cranico con alterazioni del microbioma in un modello murino.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale dei cambiamenti della microflora per informare decisioni di avanzamento con aggiustamento del rischio nei programmi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo collega la biologia della scoperta e la validazione preclinica standardizzando l'induzione del danno cerebrale traumatico e l'analisi del microbioma intestinale per la riduzione del rischio associato al target.
- Biologia della Scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sulle interazioni tra microbiota, intestino e cervello mediante lesioni controllate e analisi del profilo del microbioma.
- Screening: Fornisce campioni standardizzati di microbiota del cieco adatti per sequenziamento 16S e analisi della diversità.
- Analisi: Permette il confronto quantitativo della composizione microbica tramite scalatura multidimensionale non metrica e metriche di diversità.
- Ricerca Translazionale: Collega modelli di lesione neurologica a biomarcatori del microbioma per garantire continuità preclinica.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio della modulazione dell'asse intestino-cervello in modelli di malattie neurologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sull'asse intestino-cervello fornendo letture quantitative della microbiota dopo il TBI.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di chirurgia, campionamento e sequenziamento.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione collegando i modelli di TBI a firme di biomarcatori basate sul microbioma.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio di composti mirati alle interazioni intestino-cervello nel recupero dal TBI.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle procedure chirurgiche su modelli murini e nella manipolazione sterile dei tessuti.
- Presuppone l'accesso a dispositivi per lesioni da percussione laterale del liquido e a infrastrutture per il sequenziamento del DNA ribosomiale 16S.
- Necessita di una standardizzazione congiunta tra gruppi di neuroscienze e di analisi del microbioma.
- Comporta considerazioni di adattamento per il campionamento del cieco in diverse linee di topi o modelli di lesione.
- È limitato dalla necessità di tecniche asettiche durante la dissezione dei tessuti intestinali per prevenire contaminazioni.
